Bu protokol, proteinler tarafından ATP hidrolizinden kaynaklanan serbest fosfatı ölçerek ATPaz proteinleri için aktivitenin belirlenmesine yardımcı olacaktır. Malakit yeşil tahlili, inorganik fosfat tespiti için basit, hassas, hızlı ve ucuz bir prosedürdür. Bileşiklerin hedefine karşı otomasyon ve yüksek verimli taranması için uygundur.
Bu teknik, önemli bir anti-kanser hedefi olan Hsp90 proteinine karşı inhibitörlerin hızlı keşfedilmesinde önemli bir rol oynayacaktır. Başlamak için, 40 mikromolar fosfat çözeltisi elde etmek için 960 mikrolitre ultra saf suda 40 mikrolitre bir milimolar fosfat standardı pipet. Fosfatın 0-40-mikromolar arasında seri seyreltilmesini oluşturmak için üreticinin talimatlarına göre bu çözeltiyi ekleyin.
Daha sonra, ölçülebilir ATPaz aktivitesi için sekiz mikrolitre maya Hsp90 kullanın. Boşluğa ve pozitif kontrole malakit yeşili reaktif ekleyin ve eklemeden sonra boş ve pozitif kontrol arasındaki optik yoğunluk farkının en az 0,5 ve 1'den az olduğunu kontrol edin. ATP'yi hazırlamak için, dört milimolar stok çözeltisi elde etmek için bir miligram ATP'yi 453.39 mikrolitre ultra saf su içeren bir şişeye aktarın.
ATP'yi taze hazırlayın, çünkü zamanla kendiliğinden hidrolize olabilir. 0.2-milimolar nihai kuyu konsantrasyonu vermek için her bir kuyucuğa dört mikrolitre ATP stok çözeltisi ekleyin. Tüm reaksiyonların aynı anda başlaması için çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyona son bileşen olarak ATP ekleyin.
Daha sonra, 178.37 mikrolitre DMSO'da bir miligramı çözerek 10 milimolar bir geldanamisin stoğu hazırlayın. Stok çözeltisini kullanarak, seri seyreltme ile DMSO'da 4-milimolar, 0.8 milimolar, 0.16-milimolar, 0.032-milimolar, 0.0064-milimolar ve 0.00128-milimolar çözelti hazırlayın. 0.1-milimolar, 0.02-milimolar, 0.04-milimolar, 0.0008-milimolar, 0.00016-milimolar ve 0.000032-milimolar nihai kuyu konsantrasyonu elde etmek için her bir kuyucuğa bu stok çözeltilerinden iki mikrolitre ekleyin.
Daha sonra kuyuları, boş ve negatif kontrolü içeren kuyularla birlikte hazırlayın. Geldanamisin içeren kuyucuklar pozitif kontrol görevi görür. 96 delikli plakaları hazırlayın ve bu dalga boyundaki absorbansı kaydetmek için 620 nanometrede absorbans gösteren bileşikler için ayrı bir kuyu hazırlayın.
Geldanamisin için ayrı bir kuyu göstermeyin, çünkü geldanamisin bu tahlilde kullanılan konsantrasyon için 620 nanometrede absorbans göstermez. Her kuyuya ultra saf su ekleyerek tahlil kuyuları kurun. Daha sonra, gerekli miktarda tahlil tamponu ve geldanamisin çözeltisi gibi bir bileşik çözelti ekleyin.
Uygun kuyucuklara Hsp90 ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda iki dakika çalkalayın. Çok kanallı pipet kullanarak dört mikrolitre ATP çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 200 rpm'de oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda iki dakika çalkalayın.
Plakayı üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak ATP ile aynı sırayla 20 mikrolitre malakit yeşil reaktif ekleyerek reaksiyonu durdurun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, plakanın emilimini bir plaka okuyucuda 620 nanometrede ölçün.
Ek olarak, plaka A, her bir kuyucuğa 90 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Ek olarak, B plakası, her bir kuyucuğa Hsp90 ile 90 mikrolitre tampon ekleyin. Ek olarak, C plakası, 90 mikrolitre ATP ekleyin ve ayrıca D plakası, her bir oyuğa 90 mikrolitre malakit yeşil reaktifi ekleyin.
40 mikrolitre çözeltiyi her bir ek plaka A kuyusundan bir ve iki ana plakaya ve B plakasını üç ve dört ana plakaya aktarmak için otomatik bir çok kanallı dağıtım sistemi kullanın. Bileşik plakanın her bir kuyucuğundan çözeltinin 20 mikrolitresini ana plakalara bir, ana plakalar iki, ana plakalar üç ve ana plakalar dört olarak aktarın. Plakaları 200 rpm'de bir çalkalayıcıda bir dakika çalkalayın.
C ilavesi plakalarının her bir kuyucuğundan çözeltinin 20 mikrolitresini bir, iki, üç ve dört ana plakaya aktarın. Plakaları 200 rpm'de bir çalkalayıcıda bir dakika çalkalayın. Plakaları üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve daha sonra 20 mikrolitre malakit yeşil reaktifini ek plaka D'den bir, iki, üç ve dört ana plakaların kuyucuklarına aktarın.
Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakanın emilimini bir plaka okuyucuda 620 nanometrede ölçün. Malakit yeşilinin yapısı ve malakit yeşil reaktifi A'nın serbest fosfatla reaksiyonları ve ardından B reaktifi ile reaksiyonu burada gösterilmiştir. Standart fosfat konsantrasyonu için standart bir grafik bu şekilde temsil edilmektedir.
Burada, x ekseni mikromolardaki serbest fosfat veya pi konsantrasyonunu temsil eder ve 620 nanometredeki absorbans y ekseninde tasvir edilir. Hata çubukları, iki örnek numarası arasındaki sapmayı temsil eder. ATPaz aktivitesinin yüzdesi, proteinin geldanamisin tarafından doza bağımlı inhibisyonunu ölçmek için kullanılır.
Geldanamisinin proteini doza bağımlı bir şekilde IC50 değeri 0.85-mikromolar ile inhibe ettiği gözlenmiştir. Burada, her nokta iki belirlemenin ortalamasıdır. Malakit yeşili maddenin eklenmesinden bir sonra ana plakadaki renk gelişimi bu resimde gösterilmiştir.
A11 kuyusundaki pembe renk, bileşik renkten kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, ana plaka ikideki renk gelişimi burada gösterilmiştir. A11 kuyusundaki pembe renk, bileşiğin renkli doğasından kaynaklanmaktadır.
Malakit yeşil reaktifinin ana plaka üçe ve ana plaka dördüncüye eklenmesinden sonraki renk gelişimi burada gösterilmiştir. ATP ve malakit yeşil reaktifinin her kuyucuğa aynı zaman aralığında eklenmesi, bu prosedürü denerken hatırlanması gereken önemli bir şeydir.
