0.Nuestro protocolo describe un método optimizado y reproducible para generar osteoclastos in vitro que se puede utilizar para investigar los mecanismos subyacentes a su proceso de diferenciación y funcionalidad. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar un alto número de osteoclastos funcionalmente activos en solo una semana. El alto rendimiento de diferenciación se logra mediante el uso de monocitos purificados y la adición de citoquinas a tiempo.
Los osteoclastos son responsables de la destrucción ósea en todas las formas de artritis, y este método proporciona las herramientas para detectar nuevos compuestos terapéuticos que pueden modular su diferenciación y / o funciones. Demostrando el procedimiento estará Patricia Riedlova, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar, aísle las PBMC transfiriendo la sangre a un nuevo tubo de 50 mililitros.
Dilúyalo con PBS estéril en un volumen igual para sangre fresca, o una proporción de 1:3 para conos leucocitarios y capas leucocitarias. Mezclar suavemente la sangre por inversión. Prepare tubos de 15 mililitros que contengan tres mililitros de medio de gradiente de densidad, y coloque lentamente de ocho a 10 mililitros de sangre diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad, evitando mezclar.
Centrifugar el tubo a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno. A continuación, deseche con cuidado la capa superior con una pipeta Pasteur. Recoja la capa de interfase inferior que contiene los PBMC y transfiera esta capa a un nuevo tubo de 50 mililitros.
Suspender las celdas hasta 50 mililitros con PBS estéril y lavar el medio de gradiente de densidad residual centrifugando a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente con el freno completo. Para eliminar las plaquetas residuales, repita el proceso de centrifugación como se describe en el manuscrito, resuspenda las PBMC aisladas y purificadas en 20 mililitros de PBS y cuéntelas con un hemacitómetro siguiendo el método estándar. Para enriquecer CD14+ monocitos, transfiera 1 x 10 a las séptitas PBMC a un tubo de fondo redondo de poliestireno adecuado y granule las células a 300 x g durante cinco minutos.
Después de desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el tampón de separación celular, incubar las células con 10 microlitros de cóctel de anticuerpos por 100 microlitros con la tapa puesta durante 10 minutos. Al final de la incubación, agregue 10 microlitros de las perlas de nanopartículas magnéticas por cada 100 microlitros e incube durante tres minutos con la tapa puesta. Recargue el volumen a 2,5 mililitros con el tampón de separación celular.
Coloque el tubo en un imán e incube durante tres minutos con la tapa cerrada. Ahora, descarte la población de células negativas con un movimiento continuo por inversión mientras el tubo todavía está en el imán. Retire el tubo del imán, Lave los monocitos CD14+ enriquecidos unidos a las perlas magnéticas resuspendiéndolas en 2,5 mililitros del tampón de suspensión celular y vuelva a colocar el tubo en el imán.
Cuente las celdas aisladas como se demostró anteriormente. Centrifugar las células recogidas a 300 x g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspender las células a 1 millón de células por mililitro en medio esencial alfa mínimo completo con 10% FBS.
Para diferenciar el osteoclasto, agregue M-CSF a una concentración final de 25 nanogramos por mililitro a la suspensión celular y mezcle pipeteando a fondo para homogeneizar la suspensión celular. Placa de 100 microlitros de la suspensión por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, agregue 200 microlitros de agua destilada estéril por pocillo alrededor de las celdas plateadas para evitar la evaporación media y los efectos de borde en el sistema de cultivo.
Incubar las células durante la noche durante aproximadamente 18 a 20 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Prepare medios frescos complementados con M-CSF y ligando RANK. Después de la incubación, retire cuidadosamente la mitad del medio por aspiración con una pipeta P200 y reemplácelo con un medio completo fresco y cálido suplementado con M-CSF y ligando RANK a una concentración final de 25 nanogramos por mililitro.
Diferenciar las células en osteoclastos durante siete a 14 días con un reemplazo completo del medio cada tres días. Después de retirar el medio, fije los osteoclastos adherentes diferenciados con 100 microlitros por pocillo de la solución fijadora preparada e incube durante un minuto. No toque el fondo de los pocillos para evitar rayar las células adherentes.
Una vez que los pozos se lavan tres veces con 300 microlitros de agua destilada estéril, seque las placas y agregue 100 microlitros de solución de tinción recién preparada a cada pozo. Incubar el plato a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 20 minutos. Después de la incubación, retire la solución de tinción por inversión y lave la placa tres veces con 300 microlitros por pocillo de agua destilada.
Retire el exceso de agua golpeando los platos con toallas de papel, y deje los platos abiertos y protegidos de la luz para secar al aire durante la noche. Usando un microscopio de campo claro con una opción de mosaico, tome imágenes a 10x o 20x para capturar toda la superficie del pozo. Cuente manualmente los osteoclastos identificados como células teñidas TRAP+púrpura con más de tres núcleos utilizando un software de análisis de imágenes con un complemento de contador de células.
Placa de 100 microlitros de monocitos CD14+ aislados por pocillo en un portaobjetos de cámara de 18 pocillos con una densidad celular de 1 x 10 a la quinta célula por pocillo. Diferenciar los osteoclastos en presencia de ligando M-CSF y RANK como se demostró anteriormente con un cambio completo de medio cada tres días. En el punto final, retire suavemente el medio y lave cada pocillo dos veces con 200 microlitros de PBS precalentado a pH 7.4.
No deje que los pozos se sequen entre los pasos. Fijar la muestra con 100 microlitros por pocillo de solución de formaldehído al 4% en PBS, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital con agitación suave. Después de la incubación, lave las células dos veces con 200 microlitros por pocillo de PBS.
Permeabilizar las células con 100 microlitros por pocillo de solución Triton x-100 al 0,1% diluida en PBS, e incubar durante 10 minutos como se mostró anteriormente. Lave dos veces con 200 microlitros por pocillo de PBS. Para bloquear la unión no específica y aumentar la señal, agregue 100 microlitros de solución de bloqueo hecha con albúmina sérica bovina al 2% y solución de PBS.
Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital con una agitación suave. Después de retirar la solución de bloqueo, agregue 100 microlitros de solución de faloidina conjugada fluorescentemente diluida en solución BSA/PBS al 2% a cada pocillo. Lave dos veces con 200 microlitros por pocillo de PBS.
Teñir los núcleos con 100 microlitros por pocillo de una solución de PBS que contenga 300 DAPI nanomolares. Después de 10 a 15 minutos, retire la solución DAPI y reemplácela con PBS de 100 microlitros por pozo. Visualice la tinción usando inmunofluorescencia apropiada o microscopios confocales de cuatro a 40x.
Los osteoclastos maduros se definen como TRAP+múltiples células nucleadas. La adición del ligando RANK produjo un número creciente de grandes osteoclastos TRAP+multinucleados de una manera dependiente de la dosis. La cinética de la diferenciación de osteoclastos de monocitos se investigó durante un período de cultivo de dos a 14 días.
Los osteoclastos multinucleados fueron visibles desde el quinto día en adelante, y la diferenciación óptima se alcanzó en el séptimo día. La diferenciación de osteoclastos sobre superficies mineralizadas permite evaluar su actividad de reabsorción mediante el análisis de la formación de agujeros redondos o pozos de reabsorción. El porcentaje de reabsorción aumenta significativamente en presencia de M-CSF y ligando RANK en comparación con M-CSF solo.
Además, el tratamiento con rotenona dependiente de la dosis inhibió la reabsorción de la superficie mineralizada en comparación con el pozo de control no tratado. La inhibición dependiente de rotenona de la reabsorción de osteoclastos se asoció con la inhibición de la producción de ATP. La fragmentación del anillo de actina derivado del ligando RANK del OCS maduro se observó en presencia de rotenona.
Es importante asegurarse de que los monocitos enriquecidos no contengan plaquetas, que las células estén chapadas en la densidad correcta y que los pozos circundantes estén llenos de agua para evitar el efecto borde. Este protocolo es particularmente útil para interrogar mecánicamente cómo se forman los osteoclastos y qué influye en su funcionalidad tanto en la ciencia básica como en la traslacional. Por ejemplo, mediante el uso de compuestos o proteínas que pueden modular estos procesos.
