El análisis FISH de células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X es una técnica única para obtener información sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas en este grupo específico. Estas técnicas podrían ser útiles para aprender más sobre el potencial reproductivo en mujeres con aberraciones cromosómicas X. Es importante mencionar que ambos métodos están destinados a facilitar futuras investigaciones, y no están diseñados para ser utilizados como una herramienta de diagnóstico en la práctica clínica.
Demostrando el procedimiento estarán Ronald Peek, investigador principal de nuestro laboratorio de fertilidad, y Milad Intezar, analista de nuestro departamento de patología. Para comenzar, corte el tejido de la corteza ovárica criopreservado o descongelado en trozos pequeños de uno por uno por milímetro con un bisturí. Digiere enzimáticamente los fragmentos de tejido en cuatro litros de L15 precalentado durante 75 minutos a 37 grados centígrados.
Pipetear la mezcla de digestión hacia arriba y hacia abajo cada 15 minutos. Detenga la digestión enzimática agregando cuatro mililitros de L15 frío suplementado con 10% de suero bovino fetal, o FBS. Lavar el tejido disociado una vez con ocho mililitros de medio L15 frío por centrifugación a 500 g antes de volver a suspender en 500 microlitros de medio L15.
Transfiera la suspensión celular que contiene células estromales en gran parte individuales y folículos pequeños a una placa de Petri de plástico, y examine la suspensión bajo un microscopio estéreo. Elija manualmente los folículos de menos de 50 micrómetros de tamaño utilizando una pipeta de plástico de 75 micrómetros y transfiéralos a la gota de medio L15 suplementada con 10% FBS a cuatro grados centígrados. Luego transfiera los folículos purificados a una solución de 0.06% de tripsina, un miligramo por mililitro EDTA y un miligramo por mililitro de glucosa, e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, obtenga células del estroma ovárico de la suspensión celular de la corteza utilizando una pipeta de plástico de 75 micrómetros. Para la hibridación fluorescente in situ, o análisis FISH de células ováricas individuales, transfiera los folículos ováricos tratados con tripsina / EDTA / glucosa, o células estromales a gotitas de cinco microlitros de cloruro de potasio milimolar de 0.15 y 15 microlitros de DPBS en un portaobjetos, e incubar durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Seque y fije previamente el portaobjetos en 300 microlitros de cloruro de potasio milimolar 0.05, ácido acético al 7.5% y metanol al 22.5% durante dos minutos.
Cubra el portaobjetos con ácido acético metanol de tres a uno durante dos minutos para finalizar la fijación. Después de la fijación, lave la muestra dos veces en SSC recién preparado a 73 grados centígrados. Cúbralo con 100 microlitros de 2% de proteinasa K y séllelo con un cubreobjetos.
Incubar el tobogán durante 10 minutos a 37 grados centígrados en la estación de hibridación. Después de la incubación, retire el cubreobjetos y lave el portaobjetos durante cinco minutos en DPBS a temperatura ambiente bajo agitación. Fijar la muestra durante cinco minutos con formaldehído al 1%.
Luego lave el portaobjetos en DPBS y deshidrate en serie en concentraciones crecientes de etanol durante dos minutos cada uno. Seque al aire la muestra antes de hibridarla con sondas marcadas con fluorescencia. A continuación, agregue un microlitro de CEPX, un microlitro de CEP18 y 18 microlitros del tampón de hibridación a la muestra y selle con un cubreobjetos que esté pegado al portaobjetos.
Transfiera el portaobjetos a la estación de hibridación para su desnaturalización a 73 grados centígrados durante tres minutos, seguido de la hibridación durante una incubación nocturna a 37 grados centígrados. Después de la hibridación, retire el deslizamiento de la cubierta y cualquier pegamento restante de la diapositiva. Lave el portaobjetos en 0.4X SSC, 0.3% Tween-20 a 72 grados Celsius durante dos minutos, seguido de incubación durante un minuto en 2X SSC y 0.1% Tween-20.
Deshidrate el portaobjetos como se muestra y séquelo al aire en la oscuridad antes de cubrirlo con un medio de montaje que contenga DAPI. Coloque el portaobjetos a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos antes del análisis por microscopía de fluorescencia. Para hibridar secciones de parafina, seleccione nuevas secciones antes o después de la sección que contiene folículos de la cinta de parafina.
Monte una sección en un tobogán de vidrio y séquelo durante 45 minutos en una estufa a 56 grados centígrados. Desparafinar la sección en xileno durante 10 minutos, luego sumergir el portaobjetos en etanol al 99,5% y enjuagarlo durante cinco minutos en agua del grifo. Pretrate el portaobjetos con la solución de recuperación del objetivo durante 10 minutos a 96 grados centígrados.
Después de enfriar, enjuague el tobogán con agua destilada. Trate el portaobjetos durante cinco minutos con ácido clorhídrico molar 0.01, seguido de digestión de pepsina durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Enjuague el portaobjetos nuevamente en ácido clorhídrico y posteriormente en PBS.
Fije la diapositiva en PBS de formaldehído al 1% durante cinco minutos. Luego enjuague brevemente el portaobjetos en PBS, y nuevamente en agua desmineralizada antes de deshidratarlo en etanol al 99.5%. Aplique cinco microlitros de sonda CEP18 y CEPX en el portaobjetos pretratado.
Luego aplique un cubreobjetos y selle el área con pegamento fotográfico. Coloque el portaobjetos en un hibridador para la desnaturalización a 80 grados centígrados durante 10 minutos y la hibridación durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague el portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada una en SSC a 42 grados centígrados, seguido de un enjuague de dos minutos y un minuto en Nonidet P-40 al 0,3% a 73 grados centígrados.
Nuevamente, enjuague el portaobjetos en 2X SSC seguido de enjuague con agua destilada antes de deshidratarlo con etanol al 99.5%. Seque al aire la corredera y móntela en un medio de montaje que contenga DAPI. El tejido de la corteza ovárica criopreservada en el paciente A mostró que el 50% de los linfocitos tenía un cariotipo 45, X y el 50% tenía 46, XX.In el paciente B, el 38% de los linfocitos eran 45, X, el 28% eran 46, XX, y el 34% eran 47, XXX.
Las células estromales circundantes también se analizaron para determinar el contenido del cromosoma X. La digestión enzimática del tejido de la corteza ovárica resultó en una suspensión de células en gran parte disociadas, pero dejando los folículos primordiales, que consisten en un ovocito intacto rodeado por una sola capa de células de granulosis. Los folículos pequeños proporcionaron dificultades para interpretar las señales después de FISH, debido a la aglutinación de las células de granulosis.
La digestión adicional de los folículos con tripsina antes de FISH dio como resultado que las células de granulosis individuales se contrajeran en una morfología esférica en la superficie de los folículos. La tinción con hematoxilina con eosina mostró folículos secundarios y antrales morfológicamente normales en el tejido de la corteza ovárica después de cinco meses de xenoinjerto. El contenido cromosómico X de las células de granulosis de estos folículos se determinó mediante análisis FISH.
La fijación del tejido de la corteza ovárica injertada en la solución de Bouin dio lugar a señales fluorescentes borrosas y en gran parte oscurecidas en las células foliculares debido a una neblina verde. En contraste, el tejido de la corteza ovárica fijado en formaldehído proporcionó excelentes señales fluorescentes. El principal reto de este protocolo radica en el aislamiento de las células ováricas y la digestión enzimática del tejido.
Desviarse de este protocolo puede causar una pérdida sustancial de células ováricas durante el proceso, y esto debe evitarse especialmente en mujeres que ya tienen una reserva ovárica baja. El perfil adicional de la expresión génica podría ser útil para aprender más sobre el impacto de las células ováricas aneuploides en la foliculogénesis y, por lo tanto, el proceso de insuficiencia ovárica prematura en mujeres con aberraciones cromosómicas X.
