Este protocolo es significativo porque la optimización del desarrollo y la transferencia de protocolos de inmunofluorescencia multiplex es compleja y desafiante. Para muchos laboratorios, la retención de un protocolo optimizado es invaluable. La inmunofluorescencia multiespectral nos permite evaluar tanto la ubicación como la identidad de múltiples tipos celulares dentro y alrededor del tumor.
Esta es una poderosa combinación de información en estudios de oncología inmune. El uso más convincente para la inmunofluorescencia multiplex es la oncología inmune. Pero la capacidad de examinar múltiples tipos de células inmunitarias en setu se puede aprovechar en todas las terapias autoinmunes e inflamatorias.
Conocer la ubicación y el fenotipo de las células inmunoitarias dentro y alrededor de las células sólidas es a la vez respuestas pronosticas y predecibles a la inmunoterapia específica del tumor. La optimización y validación del protocolo son pasos clave que no se deben apresurar. Los nuevos desarrolladores deben familiarizarse con los nuevos tipos de artefactos asociados con las imágenes multiespectrales.
Para localizar el protocolo multiplojo base, precarguelo en la mancha automatizada. Filtrar para all'instead de preferred'en la pantalla de protocolo. Antes de realizar cambios, guarde el protocolo original y haga clic en la pestaña de protocolos y haga clic con el botón derecho en Opal 6 Multiplex para seleccionar la copia.
Cambie el nombre a 7 Multiplex Protocol 1'in the new window y seleccione la pestaña asociada con el dispositivo correcto. Coincide con el protocolo en la tabla suplementaria S1'y haga clic en añadir reactivo para agregar un paso de inhibición de paroxidies de diez minutos, seleccionando el inhibidor de la peroxidasa como reactivo. Confirme que los pasos de bloqueo utilizan un tampón de bloqueo del inhibidor de la proteína quinasa, que cada anticuo primario se refiere al reactivo adecuado, que los pasos secundarios del cuerpo anticuaria utilizan un polímero de peroxidasa de rábano picante y que se utiliza el dapi espectral proporcionado con el kit de automatización multiespectral.
Asegúrese de que el protocolo contiene el inhibidor de la peroxidasa, seguido de seis manchas secuenciales que contienen cada una un paso de bloqueo de proteínas, un anticuerro primario, un anticuerro secundario, un suelo de tyramida y, a continuación, la recuperación de antígenos para eliminar los anticuos. Para agregar los controles de colocación, copie el 7 Multiplex Protocol 1'name y cámbielo a 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Cambie el reactivo anticuto CD68 a Mouse IgG y guarde el protocolo.
A continuación, cree seis protocolos nuevos más, uno para cada control de colocación y otro para el control de tipo iso completo de la misma manera. Haga un protocolo de control de caídas para cada objetivo de la misma manera que le he mostrado aquí. Para preparar un kit de detección de investigación, llene el recipiente abierto de 30 mililitros marcado para solución salina 1X tris-buffered con 1X de solución salina tamponada 1X, y coloque el recipiente en la posición más alejada del mango en el Kit de investigación Multiplex 1.
Etiquete dos recipientes abiertos de 30 mililitros de bloque muli-espectral' y secundario multiespectral, y llene el contenedor de bloques mutli-espectrales con 30 mililitros de diluyente de anticuerpos tampón de bloqueo del kit de tinción multiespectral. Llene el recipiente secundario multiespectral con 30 mililitros de polímero de anticuerpos secundarios anti-rabiosos anti-ratón del kit de tinción multiespectral y agregue 600 microlitros de diluyente de anticuerpos a cada uno de los diez contenedores abiertos de 7 mililitros. A continuación, añada el anticuerpo primario concentrado a los tubos apropiados en los volúmenes indicados en la tabla, y mezcle mediante un pipeteo suave.
Añadir 3 mililitros de agua doble destilada, más 12 gotas de dapi espectral en un recipiente abierto de 7 mililitros, y 3 mililitros de bloque de peroxidasa en un segundo recipiente abierto de 7 mililitros. Vuelva a suspender cada suelo con talatalizado con 75 microlitros de sulfóxido de dimetil y mezcle por pipeteo. A continuación, guarde las existencias de suelo de amplificación de señal de Tyramida a 4 grados centígrados hasta que estén listas.
Mientras se preparan las diluciones individuales del suelo de la TSA. Registre todos los reactivos en la mancha automática, luego coloque cada recipiente en un bastidor de reactivos y cargue todos los reactivos en la trituradora automatizada. El manchador detectará la presencia y confirmará el volumen de cada reactivo.
Una vez cargados todos los reactivos, active el protocolo para que se ejecute durante la noche. Al final del procedimiento de tinción, monte las muestras con resbalones de cubierta y cargue las muestras en el escáner de plataforma de imágenes multiespectral para escanear. Una vez escaneadas todas las muestras, las imágenes se formatearán como archivos qptiff.
Abra un programa de software de análisis qptiff adecuado y haga clic en load slide'to open a five filter whole slide scan of the slide of interest. Inicie sesión y utilice la herramienta de sello para seleccionar cinco regiones para imágenes multiespectrales. En Seleccionar para:seleccione Adquisición'en Tamaño en campos:seleccione 1x1 y, en Resolución de campo, seleccione 0,5 micrómetros 20x.
Basándose en esta tinción de citoqueracina, seleccione varias regiones con tejido tumoral positivo de citoqueracina y tejido estromal negativo de citoqueracina que se debe tomar imágenes de la exploración general. Cuando se hayan seleccionado todas las imágenes espectrales múltiples, cambie al software Vectra y cambie la tarea de scan'a multiespectral imaging'para cada diapositiva. A continuación, haga clic en escanear para realizar la colección de imágenes multiespectral.
Cuando se complete la adquisición de imágenes multiespectrales, utilice el software de desmezcla espectral para abrir archivos dentro de la carpeta de imágenes multiespectral. En el formato de imagen'seleccionar multiespectral'Bajo formato de muestra'seleccionar fluorescencia'Y en Origen de la biblioteca espectral'Seleccionar inForm'Para seleccionar los pisos, seleccionar y cargar los seis pisos, y dapi de las diapositivas de la biblioteca de muestra, y haga clic en preparar todo. El software de desmezcla espectral realizará la desmezcla espectral en todas las imágenes abiertas utilizando los perfiles espectrales proporcionados.
Identifique y anote el perfil espectral auto fluorescente. Asegúrese de comprobar la función de auto fluorescente para asegurarse de que se captura completamente en el canal auto fluorescente después de la desmezcla y para probar diferentes muestras hasta que se elimina de forma aceptable. A continuación, evalúe el patrón de tinción contra las manchas únicas cromogénicas del mismo objetivo en diapositivas secuenciales del mismo tejido con un patólogo.
Para evaluar la intensidad de fluorescencia de cada canal, utilice la herramienta recuentos para examinar las imágenes abiertas. A continuación, vuelva al protocolo de tinción y ajuste la concentración de TSA para abordar los recuentos normalizados que excedan o no alcancen el rango aceptable. En este análisis representativo, el tejido de la amígdala demostró una tinción de citoqueracina claramente definida dentro de la superficie de la amígdala, epitelio escamoso sin fondo en el tejido linfoide con citoqueracina y tinción PDL-1 aparente en el epitelio reticulado de las criptas.
Los centros germinales foliculares eran fácilmente reconocibles y ricos en linfocitos positivos Ki-67. Los macrófagos presentes dentro de los centros germinales fueron identificados por su expresión CD-68 con algunos macrófagos también observados fuera del centro germinal. Los linfocitos manchados de CD-8 con una distribución de células T y la expresión PD-1 teñiron fuertemente pequeños linfocitos agrupados en la periferia del centro germinal, así como dispersos por toda la región interfolicular.
Después de que se confirmó el patrón de tinción esperado en el control del tejido de las amígdalas, la misma tinción podría evaluarse en una muestra de cáncer de pulmón. También se deben evaluar los controles negativos de isotipo y los controles de caída;no sólo para la detección de fondo y autofluorescencia, sino también para efectos de paraguas y sangrado espectral. Los controles de caída son importantes para evaluar posibles artefactos en la tinción debido al método de inmunofluorescencia multipplex durante la optimización de un nuevo panel multi-plex.
Cada control de caída debe mostrar el mismo patrón de tinción que el panel multiplexo completo, excepto para el único anticuerpo primario que debe eliminarse en cada control específico. El perfilado de inmuno con inmunofluorescencia multiespectral permite la estratificación de tumores y regiones por criterios inmunológicos que luego pueden ser investigados por estudios genómicos, transcriptómicos y proteómicos de multiplexor masivo. He utilizado la inmunofluorescencia multiplojo para investigar mecanismos de acción en oncología y trastornos autoinmunes que permite la identificación y caracterización de células inmunitarias y patógenas en una sola sección en setu.
Se deben tomar precauciones generales cuando se trabaja con anti-cuerpos contra proteínas humanas, Tyramida y dapi, pero no se sabe que ningún reactivo o material en este protocolo es particularmente peligroso.
