Este protocolo ELISA modificado permite la purificación y cuantificación precisa de CGRP en plasma humano. Se ha sometido a los experimentos de validación necesarios y puede servir para estandarizar futuras metodologías de cuantificación. Este protocolo ofrece las ventajas de incluir el procesamiento de muestras antes de la degradación significativa de la proteasa, la purificación mediante extracción en fase sólida y la limitación de la unión no específica mediante la aplicación de tampón de bloqueo a las placas de microtitulación.
CGRP juega un papel punitivo en la fisiopatología de la migraña y tal vez un candidato para el estado de biomarcador. También se ha implicado en procesos de enfermedades cardiológicas, dermatológicas, virales e incluso relacionadas con COVID-19. Para comenzar, recolecte 5 mililitros de sangre entera de la vena antecubital a través de métodos de venopunción estándar en un tubo de EDTA vacutainer de 6 mililitros.
Para bloquear la lisis del péptido objetivo, agregue 0,5 mililitros de inhibidor de la serina proteasa competitiva de aprotinina. Invierta el tubo 10 veces y guárdelo en hielo hasta el siguiente paso. Luego centrifugar el tubo a 600 4g durante cuatro minutos a 4 grados centígrados.
Y transfiera la fracción plasmática a un vial criogénico estéril de fondo redondo de 2 mililitros. Guarde inmediatamente el vial criogénico a menos 80 grados centígrados durante un máximo de dos semanas. Para extraer la muestra de plasma, coloque un cartucho de extracción dentro de un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros.
Pase 5 mililitros de 100% de metanol, luego 10 mililitros de agua ultrapura a través del cartucho para activarlo. El fluido se recogerá en el tubo a medida que pasa a través del cartucho por flujo impulsado por gravedad. Deseche el exceso de líquido acumulado para evitar que envuelva el cartucho y asegúrese de que no se seque durante el experimento.
Diluya 250 microlitros de plasma en 750 microlitros de ácido acético al 4% y páselo lentamente a través del cartucho. Luego lave el cartucho con 10 mililitros de ácido acético. Una vez que se elimine el exceso de líquido, transfiera el cartucho a un nuevo tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros.
Prepare 3 mililitros de solución de ácido acético de metanol para eluyer el péptido relacionado con el gen de la calcitonina o CGRP. Pase 1 mililitro a través del cartucho y espere 25 minutos entre cada elución. Después de la última elución, el tubo contiene 3 mililitros de eluyente total.
Transfiera 1 mililitro del eluyente a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros y gírelo en una mini centrífuga durante un segundo para asentar el eluyente. Luego seque la muestra en una centrífuga de vacío a 1, 400 RPM y 4 grados centígrados. Inmediatamente antes del ensayo, reconstituir la muestra seca con inmunoensayo enzimático descongelado o tampón EIA.
Para bloquear la placa, agregue 250 microlitros de tampón de bloqueo de gelatina de pescado TBS a cada pocillo. Coloque una hoja de cubierta sobre el plato e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire la hoja de cubierta y vacíe la placa invirtiéndola.
Luego seque la placa en una toalla de papel para desechar cualquier líquido traza y séquela en una campana de flujo laminar durante 10 minutos. Una vez que la placa esté visiblemente seca, colóquela en una bolsa de aluminio sellada con un sobre desecante de gel de sílice. Guárdelo a menos 20 grados centígrados durante 24 horas.
Antes de realizar el ensayo, descongele todas las muestras y los reactivos preparados a temperatura ambiente. Para enjuagar los pocillos de la placa de bloque, agregue 300 microlitros de tampón de lavado y déjelo reposar durante 30 segundos. Luego deseche el tampón de lavado y repita el enjuague cinco veces.
Después del último enjuague, seque el plato como se demostró anteriormente. A continuación, dispense 100 microlitros de tampón EIA a los dos pozos dedicados de unión no específica o NSB. Agregue 100 microlitros de los estándares CGRP, seguido de la muestra reconstituida y el control de calidad por duplicado en pozos apropiados.
Agregue 100 microlitros de trazador CGRP a cada pozo, excepto los pocillos en blanco. Finalmente, selle la placa con una hoja de cubierta transparente, asegurándose de que las muestras y los reactivos no se evaporen, e incube la placa durante 16 a 20 horas a 4 grados centígrados. Cuando termine el período de incubación, prepare el reactivo de Ellman según las instrucciones del fabricante.
Una vez decantada la placa, lavar cada pocillo tres veces como se demostró anteriormente. Después del último enjuague, agite el plato a 120 RPM durante dos minutos. Nuevamente, enjuague el plato tres veces y séquelo.
Golpee la placa invertida hasta que el líquido se retire visiblemente de los pocillos. Luego agregue 200 microlitros de reactivo de Ellman en cada pozo, excepto en los pozos en blanco. Una vez que la placa esté cubierta, envuélvala en papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz e incubarla en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora antes de registrar la absorbancia.
El presente estudio demostró que la adición del paso de bloqueo, las tasas de recuperación en cada muestra de pico CGRP estaban dentro del rango aceptable. Sin embargo, cuando se excluyó el paso de bloqueo, la unión no específica dio lugar a tasas de recuperación superiores al límite superior del 125%Es importante agregar aprotinina para mantener las muestras de sangre poco después de la recolección para limitar la degradación de CGRP. Además, el tampón de bloqueo debe agregarse a la placa de microtitulación antes de ELISA para reducir aún más la unión no específica.
Por lo tanto, este protocolo se puede utilizar para explorar la candidatura de CGRP como un biomarcador para la migraña vestibular mediante la cuantificación de los niveles de CGRP en los pacientes plasmáticos con migraña y migraña vestibular versus controles.
