Este protocolo presenta un método multinivel, tanto para la detección de EST como para la figura de fagos. También introdujo un gran índice de guardado para comparar los niveles de EMR de diferentes tecnologías de control. Esta técnica rentable es inteligente, de alto rendimiento y multifuncional.
Ha permitido la creación de VAMS, una red de vigilancia veterinaria que ha recogido 20.000 genes epidémicos y fagos analíticos. Este método también se puede utilizar para monitorear y controlar bacterias patógenas en medicina, agricultura, baterías cardíacas de animales y pesquerías. Este protocolo y este documento de la empresa deben proporcionar que sea un.
Contamos con guía de capacitación técnica. Seguirlo ayudaría a cualquiera a dominar la técnica en un corto período de tiempo. Comience incubando el organismo de control de calidad E. coli y 93 cepas de salmonela de prueba en placas de agar Mueller-Hinton.
A continuación, diluya el inóculo preparado de cada cepa 10 veces. Transfiera 200 microlitros de solución salina normal estéril al pocillo a-1 de una placa de 96 pocillos como control negativo. A continuación, pipetee dos suspensiones de E. coli en los pocillos a-2 y a-3 como controles positivos y de calidad, respectivamente.
A los 93 pocillos restantes, agregue 200 microlitros de la cepa de prueba diluida. Para la preparación de las placas de agar antimicrobiano. En primer lugar, establezca los rangos de concentración para los diferentes agentes antibacterianos que se están probando, según el índice LAR.
Realice un esquema de dilución de duplicación log-dos para la solución antibiótica siguiendo el método de dilución en agar estándar CLSI. Ahora agregue dos mililitros de la solución antimicrobiana a una botella de vidrio esterilizada que contenga 18 mililitros de medio de agar Mueller-Hinton fundido. Después de mezclar bien, vierta en platos dentro de un gabinete de bioseguridad.
Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente. Asegúrese de dejar un espacio debajo de la tapa de las placas para permitir el secado de la superficie del agar. Etiquete los tipos de agentes antimicrobianos y sus respectivas concentraciones en la parte inferior de las placas incubadas.
Coloque las múltiples placas incubadas para cada agente antimicrobiano en una pila dispuesta en el orden de dilución de duplicación logarítmica dos. Por último, prepare dos placas de agar sin fármacos para que actúen como controles de cada agente. Instale una placa de clavija de inoculación esterilizada sobre el soporte de un inoculador de matriz de 96 puntos dentro de un gabinete de bioseguridad.
A continuación, coloque el bloque de semillas preparado con cepas probadas y una placa de incubación en agar en el portador móvil. Empuje el transportador móvil hasta que el bloque de semillas esté debajo de la placa de clavijas de inoculación. Ahora presione la manija de operación y baje la placa de clavijas de inoculación, guiando las 96 clavijas hacia el inóculo en los 96 pocillos del bloque de semillas.
Suelte la manija de operación de manera controlada y reinicie automáticamente la placa del pasador de inoculación para agitar bien cada inóculo y sumergirlo, empuje la manija de operación dos o tres veces. Después, mueva y coloque la placa portadora de modo que la placa de incubación quede debajo de la placa del pasador de inoculación. Presione hacia abajo la manija de operación, bajando la placa del pasador de inoculación y dejándola durante uno o dos segundos para asegurar un contacto total con la superficie de la placa incubada.
Suelte la manija de operación para completar una ronda de inoculación. Vuelva a colocar la placa incubada y repita el proceso hasta completar el lote de placas de agar antimicrobiano. Cambie a una nueva placa de clavijas de inoculación y bloque de semillas para inocular otro grupo de cepas probadas.
Incubar las placas de agar antimicrobiano inoculadas a temperatura ambiente hasta que la humedad de las manchas de inóculo sea completamente absorbida por el agar. Después de la incubación, invierta las placas y continúe la incubación para permitir que las bacterias desinhibidas formen colonias. Para realizar la adquisición de imágenes y estadísticas de datos, comience haciendo clic en el sistema de adquisición de imágenes AST de matriz de 96 puntos para iniciar el programa.
En la barra de tareas, seleccione información de prueba. Haga clic en nuevo para crear una nueva tarea de prueba y rellene los detalles necesarios. A continuación, pulse recopilación de datos seguido de fotografía y elemento de prueba para seleccionar la tarea recién creada.
Elija antibióticos para seleccionar el nombre del antibiótico y el gradiente para seleccionar la concentración inicial del antibiótico. Por último, haga clic en conectar para establecer una conexión con el convertidor de adquisición de imágenes. A continuación, coloque las placas incubadas en la base de la placa de detección e insértelas en el convertidor de adquisición de imágenes.
Haga clic en la colección para capturar imágenes de las placas. Presione antibióticos y seleccione el siguiente juego de placas. Elija degradado para identificar el degradado inicial y, a continuación, continúe con la siguiente ronda de recopilación de imágenes.
Finalice el procedimiento haciendo clic en enviar para determinar la formación de colonias y convertir las imágenes en concentraciones inhibitorias mínimas, es decir, valores de MIC. Haga clic en la consulta para acceder a todos los resultados de MIC. Comience utilizando el método de agar de doble capa para producir diferentes fagos.
Diluir los fagos a una concentración paralela adecuada y añadir 200 microlitros del inóculo de fagos en el bloque de semillas de 96 pocillos. A continuación, prepare una placa de incubación de doble capa para cada cepa que se vaya a examinar. Deje un espacio debajo de la tapa de la placa de doble capa para permitir el secado.
Coloque el bloque de semillas de fagos preparado y la placa de doble capa en el soporte móvil del inoculador de matriz de 96 puntos. Transfiera todos los fagos inoculares a la superficie de semiagar. Deje que las placas permanezcan a temperatura ambiente hasta que toda la humedad ocular haya sido absorbida por el semiagar.
A continuación, incube las placas a 37 grados centígrados para las cepas probadas durante cuatro a seis horas. Utilice el convertidor de adquisición de imágenes para obtener y guardar la imagen del resultado experimental de cada placa de doble capa. Registre el número y las morfologías de las diferentes formas de puntos en una hoja de cálculo basada en las imágenes obtenidas y calcule las proporciones respectivas de los diferentes tipos de fagos.
El estudio morfológico del crecimiento de salmonella en placas con ampicilina mostró que el control negativo en a-1 no mostró crecimiento. La CMI de la cepa de salmonela en a-4 fue de 64 microgramos por mililitro, mientras que la de a-5 fue de 16 microgramos por mililitro. Los valores porcentuales de resistencia de ampicilina, ciprofloxacina y amoxicilina-ácido clavulánico fueron superiores al 50%, mientras que los de doxiciclina, florfenicol, cefotaxima y enrofloxacina fueron del 30% al 50%Gentamicina, amikacina y meropenem mostraron valores porcentuales de resistencia inferiores al 30%Los índices LAR de ciprofloxacina y amoxicilina-ácido clavulánico se difirieron significativamente.
Los análisis morfológicos del crecimiento de salmonela en placas de doble capa mostraron que se observaron cuatro morfologías principales de los fagos. La mancha lítica clara redonda era de un fago que podía matar de manera confiable al huésped en la placa, pero que puede o no replicarse con éxito a expensas de ese huésped. La colección de placas estaba formada por placas verdaderas.
La mancha lítica turbia fue el resultado de un fago que no mató de manera confiable al huésped en la placa, y que puede o no replicarse con éxito a expensas de ese huésped. La mancha no lítica indicaba naturaleza no lítica. Esta técnica transfiere fácilmente y de manera eficiente la lente de agar 96 a la vez y los instrumentos reconocen automáticamente las imágenes y luego calculan los dados de línea.
Se espera que esta tecnología promueva la investigación y la industrialización de los fagos y la aplicación de fagos es una de las formas sorprendentes de reducir y resolver el problema de la resistencia a los antimicrobianos.
