이 프로토콜은 EST 검출과 파지 수치 모두에 대한 다단계 방법을 제공합니다. 또한 다양한 제어 기술의 EMR 수준을 비교하기 위해 저장에 대한 큰 인덱스를 도입했습니다. 이 비용 효율적인 기술은 지능적이고 처리량이 높으며 다기능입니다.
그것은 VAMS의 설립을 가능하게 했다 20, 000의 전염병 유전자 및 분석적인 파지를 모은 수의 감시 네트워크. 이 방법은 의학, 농업, 동물 심장 배터리 및 어업에서 병원성 박테리아를 모니터링하고 제어하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜과 이 회사 논문은 다음을 제공해야 합니다.
우리는 기술 교육 가이드와 함께. 그것을 따르면 누구나 짧은 시간에 기술을 마스터하는 데 도움이 될 것입니다. 품질 관리 유기체인 대장균과 93개의 테스트 살모넬라 균주를 Mueller-Hinton 한천 플레이트에서 배양하는 것으로 시작합니다.
다음으로, 각 균주의 제조된 접종물을 10회 희석한다. 200마이크로리터의 멸균 생리식염수를 음성 대조군으로 96웰 플레이트의 a-1 웰로 옮깁니다. 그런 다음 대장균 현탁액 2개를 a-2 및 a-3 웰에 각각 양성 및 품질 관리로 피펫팅합니다.
나머지 93개의 웰에 희석된 테스트 균주 200마이크로리터를 추가합니다. 항균 한천 플레이트의 제조용. 먼저 LAR 지수에 따라 테스트 중인 다양한 항균제의 농도 범위를 설정합니다.
CLSI 표준 한천 희석 방법에 따라 항생제 용액에 대해 log-two doublebling 희석 계획을 수행합니다. 이제 18ml의 용융된 Mueller-Hinton 한천 배지가 들어 있는 멸균된 유리병에 2ml의 항균 용액을 추가합니다. 완전히 혼합한 후 생물 안전 캐비닛 내부의 플레이트에 붓습니다.
한천이 실온에서 응고되도록 합니다. 한천 표면이 건조될 수 있도록 접시 뚜껑 아래에 틈을 두십시오. 항균제의 종류와 각각의 농도를 배양 플레이트의 밑면에 표시하십시오.
각 항균제에 대해 여러 개의 배양된 플레이트를 로그 2배 희석 순서로 정렬된 스택에 배열합니다. 마지막으로, 각 약제에 대한 대조군 역할을 할 두 개의 약물이 없는 한천 플레이트를 준비합니다. 생물 안전 캐비닛 내의 96 도트 매트릭스 접종기 지지대에 멸균된 접종 핀 플레이트를 설치합니다.
다음으로, 준비된 종자 블록을 테스트 된 균주와 한천 배양 플레이트를 이동 통신사에 배열합니다. 시드 블록이 접종 핀 플레이트 아래에 올 때까지 이동 통신사를 밉니다. 이제 작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 내려 96개의 핀을 종자 블록의 96개 웰에 있는 접종 쪽으로 안내합니다.
제어된 방식으로 작동 핸들을 풀고 접종 핀 플레이트를 자동으로 재설정하여 각 접종물을 잘 저어주고 담그고 작동 핸들을 2-3회 누릅니다. 그런 다음 캐리어 플레이트를 이동하여 배양 플레이트가 접종 핀 플레이트 아래에 오도록 합니다. 작동 손잡이를 아래로 눌러 접종 핀 플레이트를 내리고 1-2초 동안 그대로 두어 배양된 플레이트의 표면에 완전히 닿도록 합니다.
작동 핸들을 놓으면 1회 접종이 완료됩니다. 배양된 플레이트를 교체하고 항균 한천 플레이트 배치가 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 새로운 접종 핀 플레이트와 시드 블록으로 전환하여 테스트된 균주의 다른 그룹을 접종합니다.
접종 부위의 수분이 한천에 완전히 흡수될 때까지 접종된 항균 한천 플레이트를 실온에서 배양합니다. 배양 후 플레이트를 뒤집고 배양을 계속하여 억제되지 않은 박테리아가 군체를 형성할 수 있도록 합니다. 이미지 수집 및 데이터 통계를 수행하려면 먼저 96 도트 매트릭스 AST 이미지 수집 시스템을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
작업 표시줄에서 테스트 정보를 선택합니다. 새로 만들기를 클릭하여 새 테스트 작업을 만들고 필요한 세부 정보를 입력합니다. 그런 다음 데이터 수집을 누른 다음 사진 및 테스트 항목을 눌러 새로 생성된 작업을 선택합니다.
항생제 이름을 선택하려면 항생제를 선택하고 초기 농도를 선택하려면 그라데이션을 선택합니다. 마지막으로 연결을 클릭하여 이미지 획득 변환기와 연결합니다. 다음으로, 배양된 플레이트를 검출 플레이트 베이스에 놓고 이미지 획득 변환기에 삽입합니다.
컬렉션을 클릭하면 플레이트의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 항생제를 누르고 다음 플레이트 세트를 선택하십시오. 그라디언트를 선택하여 시작 그라디언트를 식별한 후 다음 이미지 컬렉션 라운드로 진행합니다.
submit(제출)을 클릭하여 콜로니 형성을 결정하고 이미지를 최소 억제 농도, 즉 MIC 값으로 변환하여 절차를 마무리합니다. 쿼리를 클릭하여 모든 MIC 결과에 액세스합니다. 이중층 한천 방법을 활용하여 다양한 파지를 생산하는 것으로 시작합니다.
파지를 적절한 평행 농도로 희석하고 200 마이크로 리터의 파지 접종물을 96 웰 시드 블록에 첨가합니다. 다음으로, 검사할 각 균주에 대해 이중층 배양 플레이트를 준비합니다. 건조를 위해 이중판의 뚜껑 아래에 틈을 두십시오.
준비된 파지 시드 블록과 이중층 플레이트를 96도트 매트릭스 접종기의 이동체에 놓습니다. 모든 파지 inocular 를 semi agar 표면으로 옮깁니다. 모든 안구 수분이 반 한천에 흡수될 때까지 플레이트를 실온에 두십시오.
이제 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 테스트된 균주를 위해 플레이트를 배양합니다. 이미지 획득 변환기를 사용하여 각 더블 레이어 플레이트의 실험 결과 이미지를 얻고 저장합니다. 획득한 이미지를 기반으로 스프레드시트에 다양한 스폿 모양의 수와 형태를 기록하고 다양한 유형의 파지의 각 비율을 계산합니다.
암피실린이 함유된 플레이트에서 살모넬라균 성장에 대한 형태학적 연구는 a-1의 음성 대조군이 성장을 보이지 않는다는 것을 보여주었습니다. a-4에서 살모넬라 균주의 MIC는 밀리리터당 64마이크로그램인 반면, a-5의 MIC는 밀리리터당 16마이크로그램이었습니다. 암피실린, 시프로플록사신, 아목시실린-클라불란산의 저항성 백분율 값은 50% 이상이었고, 독시사이클린, 플로르페니콜, 세포탁심 및 엔로플록사신의 저항성 값은 30%에서 50%로 나타났으며, 겐타마이신, 아미카신, 메로페넴은 30% 미만의 저항성 백분율 값을 보였으며, 시프로플록사신과 아목시실린-클라불란산의 LAR 지수는 유의하게 지연되었다.
이중층 플레이트에서 살모넬라균 성장의 형태학적 분석은 파지의 4가지 주요 반점 형태가 관찰되었음을 보여주었습니다. 둥글고 투명한 용해 반점은 접시 위의 숙주를 안정적으로 죽일 수 있는 파지에서 나온 것이지만 숙주의 비용으로 성공적으로 복제될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 명판의 수집은 진정한 명판으로 형성되었습니다.
탁한 용해 반점은 플레이트에서 숙주를 안정적으로 죽이지 않고 숙주를 희생시켜 성공적으로 복제할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 파지로 인해 발생했습니다. 용해 반점이 없는 것은 비용해 특성을 나타냅니다. 이 기술은 한 번에 96개의 한천 렌즈를 효율적으로 쉽게 전송하고 기기가 자동으로 이미지를 인식한 다음 라인 주사위를 계산합니다.
이 기술은 파지의 연구와 산업화를 촉진할 것으로 예상되며 파지의 적용은 AMR 문제를 줄이고 해결하는 놀라운 방법 중 하나입니다.
