OLA es una plataforma microfluídica versátil útil para la comunidad de biología sintética. en particular, para biodiseñar células artificiales. Los liposomas basados en OLA pueden ayudarnos a comprender los principios de autoorganización en biología y construir ensamblajes que imitan a las células.
OLA produce liposomas monodispersos, unilaminares y de tamaño celular de una manera de alto rendimiento y con una excelente eficiencia de encapsulación. Requiere volúmenes de muestra muy pequeños, del orden de 50 microlitros, y los liposomas formados están disponibles inmediatamente para una mayor experimentación en chip. OLA es útil para estudiar reacciones biológicas dentro de microconfinamientos, dinámica de vesículas y condensados biomoleculares y sus interacciones con membranas.
OLA también se ha aplicado como una plataforma de alto rendimiento para la detección de drogas, por ejemplo, para probar la permeabilidad y la actividad membránica de los antimicrobianos. La funcionalización de la superficie, que es el tratamiento fotovoltaico, es un paso crítico para el protocolo y debe realizarse cuidadosamente para evitar que la solución fotovoltaica ingrese a la acua interna y a los canales orgánicos que transportan lípidos. Además, el canal de postproducción debe ser lo suficientemente largo como para que la separación de las bolsas de octanol forme liposomas.
Ketan Ganar, un estudiante de doctorado de mi laboratorio, ayudará a Chang Chen a demostrar el procedimiento. Para comenzar, tome una oblea de silicio limpia de cuatro pulgadas de diámetro y límpiela más con aire presurizado para eliminar cualquier partícula de polvo. Monte la oblea en una recubridora de centrifugado y dispense suavemente alrededor de cinco mililitros de una fotorresistencia negativa en el centro de la oblea.
Para obtener una capa fotorresistente de 10 micrómetros de espesor, ajuste la configuración de la capa de centrifugado a 500 RPM durante 30 segundos con una aceleración de 100 RRP por segundo para la propagación inicial, seguido de un giro de 60 segundos a 3, 000 RPM con una aceleración de 500 RPM por segundo. Luego, gira la oblea. Hornea la oblea en una placa calefactora durante dos minutos a 65 grados centígrados, y luego durante cinco minutos a 95 grados centígrados.
Una vez que la oblea se enfríe, monte la oblea en la cámara de impresión de la máquina de litografía óptica directa derecha y alimente el conjunto de liposomas asistido por octanol o el diseño OLA en el software. Una vez que se imprima el diseño, hornee la oblea a 65 grados centígrados durante un minuto, seguido de 95 grados centígrados durante tres minutos. Para lavar la fotorresistencia sin curar, sumerja la oblea en un vaso de precipitados de vidrio que contenga la solución reveladora hasta que la fotorresistencia sin curar se elimine por completo.
Hornea la oblea a 150 grados centígrados durante 30 minutos para asegurarte de que el diseño impreso esté firmemente adherido a la superficie de la oblea y no se desprenda en el proceso de fabricación posterior. Para preparar el dispositivo microfluídico, coloque la oblea maestra en una pieza cuadrada de aluminio y envuelva el papel de aluminio alrededor de la oblea, formando una estructura bien parecida. Vierta suavemente la mezcla de PDMS en la oblea maestra.
Incubar el conjunto en un horno a 70 grados centígrados durante al menos dos horas. Saque la oblea maestra del horno y deje que se enfríe. Para eliminar el polidimetilsiloxano solidificado, o bloque PDMS, retire el papel de aluminio y luego retire con cuidado el bloque PDMS del borde de la oblea.
Tome un deslizamiento de cubierta de vidrio transparente, vierta aproximadamente 0,5 mililitros de PDMS en el centro del portaobjetos de vidrio y extiéndalo a través del deslizamiento de cubierta inclinando suavemente el portaobjetos de vidrio, asegurando una cobertura total del portaobjetos de vidrio con el PDMS. Monte la corredera de vidrio en el recubridor giratorio. Asegúrese de que esté colocado centralmente de modo que el centro de la corredera se superponga con el centro del eje de presión.
Luego gire la diapositiva de vidrio a 500 RPM durante 15 segundos en un incremento de 100 RPM por segundo y 1, 000 RPM durante 30 segundos en un incremento de 500 RPM por segundo. Coloque el portaobjetos de vidrio recubierto de PDM con el lado recubierto hacia arriba en una plataforma elevada como un bloque de PDMS en una placa de Petri cubierta. Hornea a 70 grados centígrados durante dos horas.
Coloque el bloque PDMS con los canales grabados hacia arriba y la corredera de vidrio recubierta de PDM con el lado recubierto hacia arriba en la cámara de vacío de la limpiadora de plasma. Encienda el vacío y exponga el contenido al plasma de aire a una frecuencia de radio de 12 megahercios durante 15 segundos para activar las superficies. El plasma de oxígeno se puede ver en forma de un tono rosado.
Inmediatamente después del tratamiento con plasma, coloque el portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS sobre una superficie limpia con el lado PDMS hacia arriba. Coloque suavemente el bloque PDMS con el patrón microfluídico ahora orientado hacia el portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS, lo que les permite unirse. Hornea los dispositivos unidos a 70 grados centígrados durante dos horas.
Dispense 200 microlitros de alcohol polivinílico al 5%, o solución OVA, en un tubo de 1,5 mililitros y conéctelo al soporte del depósito microfluídico. Inserte el tubo de tal manera que un extremo se sumerja en la solución de PVA y el otro extremo esté conectado a la entrada del canal acuoso externo del dispositivo microfluídico. Aumentar la presión de la fase acuosa externa a 100 milibares para hacer fluir la solución de PVA en los canales acuosos externos.
Aumentar las presiones de las fases acuosa interna y orgánica portadora de lípidos a 120 milibares para evitar el reflujo de la solución de PVA dentro de estos canales. Fluya la solución de PVA de esta manera durante aproximadamente cinco minutos, asegurando la funcionalización completa del canal de salida. Aumente la presión en los canales acuosos orgánicos e internos que transportan lípidos a dos barras para eliminar la solución de PVA, e inmediatamente separe el tubo de la entrada acuosa externa.
Simultáneamente, use un tubo conectado a un canal de presión negativa para eliminar el exceso de PVA del canal de salida. Hornea el dispositivo a 120 grados centígrados durante 15 minutos y deja que se enfríe antes de usarlo. El dispositivo se puede almacenar en condiciones ambientales durante al menos un mes.
Dispense las soluciones en tres tubos de 1,5 mililitros y montarlos. Conéctelos al chip microfluídico tratado con PVA y aplique presión positiva en los tres canales, alrededor de 100 milibares en los canales acuosos internos y orgánicos portadores de lípidos y alrededor de 200 milibares en el canal acuoso externo. Una vez que las tres fases comiencen a cofluir en la unión, asegúrese de que comience la producción de doble emulsión y ajuste la presión de acuerdo con su calidad.
A medida que fluyen las gotas de doble emulsión, las bolsas de octanol se vuelven cada vez más prominentes y finalmente se pellizcan, formando liposomas. Aquí se muestra una imagen de campo brillante de la rápida generación de gotas de doble emulsión. El canal lipídico fluorescente muestra la formación de una bolsa octanol debido a la deshumectación parcial.
El canal acuoso interno muestra la encapsulación de la proteína fluorescente amarilla. La deshumectación de la bolsa de octanol en el canal de salida que forma un liposoma se muestra en esta figura. Esta imagen representa el esquema de la transición dependiente del pH de la solución homogénea de polilisina y ATP encapsulada dentro del liposoma a coacervados de polilisina separada en fase.
El ambiente ácido inicial en el liposoma hace que la carga molecular del ATP sea neutra, inhibiendo la coacervación. Cuando el pH dentro de los liposomas se equilibra con el aumento del pH aplicado externamente, el ATP gana una carga negativa, desencadenando la coacervación. La distribución espacial de la polilisina y la membrana y las imágenes de lapso de tiempo de la formación de polilisina ATP coacervados dentro de los liposomas se muestran en esta figura.
La edición externa de un tampón básico eleva el nivel de pH dentro de los liposomas en el transcurso de minutos e inicia la coacervación. T es igual a cero minutos se refiere al tiempo justo antes de la ocurrencia del primer evento de coacervación. Al demostrar el procedimiento, es crucial ajustar pacientemente la presión del canal para generar una producción constante de doble emulsión.
OLA y sus variaciones se han empleado en diversos estudios, por ejemplo, el crecimiento y la división de liposomas que comprenden la dinámica de los condensados biomoleculares, la expresión libre de células de proteínas, así como la encapsulación de bacterias. Entonces, en contusión, creemos que OLA es una plataforma versátil para la biología sintética.
