La barrera hemato-médula espinal está fuertemente unida y tiene una permeabilidad limitada. Este protocolo permite a los investigadores abrir de forma segura y transitoria la barrera hemato-médula espinal, utilizando microburbujas y ultrasonidos focalizados. Esta técnica permite localizar la abertura de la barrera hemato-medular en el segmento objetivo de la médula espinal.
Además, la interrupción se puede confirmar fácilmente mediante observación visual o microscopía fluorescente. Este protocolo puede ser explorado por su potencial para mejorar la administración de terapias génicas o fármacos a la médula espinal para el tratamiento de tumores, atrofia o lesiones. La demostradora del procedimiento será Meghana Bhimreddy.
Un estudiante estelar de medicina de mi laboratorio, que a diario tiende un puente entre la ingeniería y la medicina. Para empezar, adquiera un sistema de transductor de ultrasonido focalizado con especificaciones suficientes para lograr la barrera hemato-médula espinal, o aberturas BSCB en ratas. Fije el soporte de la sonda impreso en 3D y el cono de agua en el transductor.
Asegúrese de que haya un sello hermético entre el cono y el transductor. Fije la membrana de poliéster esterilizada, de 50 micras de espesor, acústicamente transparente, al fondo del cono de agua con una banda elástica. Llene el cono de agua con agua desgasificada y desionizada utilizando los tubos de entrada y salida.
Evite las burbujas de aire dentro del cono, ya que pueden interrumpir el acoplamiento acústico entre el transductor y el objetivo. En esta etapa, la membrana de Mylar debe estar ligeramente inflada. Conecte el equipo de accionamiento que contiene el generador de ondas y el amplificador de accionamiento de radiofrecuencia al transductor.
Fije el brazo estereotáctico a la placa de fijación y fije el soporte de la sonda al brazo. Registre el peso de una rata hembra Sprague-Dawley anestesiada y realice una prueba de pellizco en los dedos de los pies y la cola para confirmar la anestesia. Coloque una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente estéril en la placa de fijación.
Coloque a la rata sobre la almohadilla absorbente. Aplique ungüento para los ojos y coloque un termómetro rectal para controlar la temperatura corporal. Palpar la última costilla de la rata, que está unida a la columna vertebral en la 13ª vértebra torácica.
Usa una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el pelaje de la superficie dorsal entre la última costilla y el cuello. Limpie la piel expuesta con una gasa humedecida en yodopovidona al 10%. Cree una incisión en la línea media con unas tijeras de iris y diseccione a través de la fascia hasta que las apófisis espinosas y la lámina queden expuestas.
Retire el hueso con unas pinzas para huesos desplazadas y unas tijeras de iris de hoja en ángulo, hasta que la médula espinal quede expuesta. Asegure la rata a la placa de fijación sujetando las apófisis espinosas adyacentes a la laminectomía. A continuación, tire ligeramente de las abrazaderas para tensar la columna vertebral.
Ajuste la posición del transductor con el brazo estereotáxico hasta que quede exactamente por encima de la laminectomía. Fije el aparato láser al fondo del cono de agua y bájelo hasta que el punto láser sea visible. A continuación, ajuste la posición lateral del transductor hasta que el punto láser esté por encima de la ubicación objetivo para la interrupción de BSCB.
Retire el aparato láser y rellene el espacio entre el cono y la médula espinal con gel de ultrasonido desgasificado, sin introducir burbujas de aire. Ajuste los parámetros de sonicación en la potencia de salida del transductor. Prepare una solución de microburbujas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para aumentar las posibilidades de éxito del cateterismo de las venas de la cola, sumerja la cola en agua tibia y coloque un torniquete en la base de la cola para agrandar el diámetro de las venas. A continuación, inserte un catéter de vena de cola de calibre 22 y enjuague con 0,2 mililitros de solución salina heparinizada. Inyecte un mililitro por kilogramo de colorante azul de Evans al 3 % o EBD en el catéter.
A continuación, enjuague el catéter con 0,2 mililitros de solución salina heparinizada. Confirme el cateterismo exitoso de la vena de la cola verificando si hay cambios de color azul en la piel, los ojos o la vena espinal dorsal de la rata. Inyectar un bolo de 0,2 mililitros de microburbujas en el catéter y enjuagar con suero fisiológico heparinizado antes de iniciar la sonicación.
Después de sacrificar a la rata, retire la médula espinal y colóquela en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, reemplace el paraformaldehído con PBS. Para visualizar la interrupción del BSCB, aísle una sección de dos centímetros que rodee el lugar de la sonicación, utilizando una cuchilla de afeitar.
Divida la sección en secciones de 10 micras de espesor con un micrótomo y tiña con tinción de hematoxilina eosina. Para microscopía de fluorescencia, desparafinar el portaobjetos que contiene la sección de la médula espinal y contratinción con 25 microlitros de DAPI disueltos en el medio de montaje. Incubar las secciones a cuatro grados centígrados durante 10 minutos en la oscuridad para evitar la decoloración.
Después de la incubación, use un microscopio fluorescente para obtener imágenes de todos los portaobjetos. Tome imágenes del portaobjetos teñido con hematoxilina y eosina con un microscopio óptico. La vasculatura de la médula espinal es visible después de la laminectomía y muestra la vena espinal posterior, con múltiples vasos más pequeños que irradian lateralmente.
Después de la inyección intravenosa de EBD, el tejido circundante y la vasculatura de la médula espinal aparecieron azules. Después de la sonicación, se hace visible una mancha azul sobre la ubicación objetivo, lo que indica la extravasación de la EBD en el parénquima blanco, debido a la interrupción del BSCB. La extirpación de la médula espinal de las ratas con ultrasonido focalizado de baja intensidad, o sonicación LIFU, confirmó la aparente extravasación de la EVE en la médula espinal.
Mientras que las ratas controladas negativas sin tratamiento con LIFU no mostraron extravasación de EBD. Las médulas espinales con sonicación LIFU mostraron una intensidad significativamente mayor de autofluorescencia de la EBD que las médulas que no recibieron sonicación. Con intensidades similares de DAPI presentes en ambos.
El análisis de hematoxilina y eosina no reveló daño neuronal, hemorragia o lesiones de cavidad en las localizaciones sonicadas. A modo de comparación, se muestran ejemplos de cordones lesionados debido a un mal manejo quirúrgico y a una sonicación de alta potencia. En las ratas que recibieron microburbujas y tratamiento LIFU, no se observaron cambios en las puntuaciones motoras, antes y después de la sonicación, y durante un período de supervivencia de cinco días.
Se observaron cambios mínimos en la temperatura de la médula espinal antes, durante y después del análisis de sonicación. Es importante limitar el daño quirúrgico a la médula durante la laminectomía. La visualización de las secciones teñidas H y E con microscopía, indicará si se ha producido algún daño.
Después de la ruptura de la barrera hemato-médula espinal, mediante ultrasonido focal, los animales pueden ser inyectados con agentes antineoplásicos o terapias génicas. El resultado determinará si esta técnica puede mejorar la administración de terapias y prolongar la supervivencia en el contexto de la patología de la médula espinal.
