Estamos muy agradecidos con el Sr. Roger Ackroyd, el Sr. Andrew Wyman y el Sr. Chris Stoddard, Consultor cirujanos en Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, por su ayuda en la adquisición de las muestras de tejido del esófago y su apoyo a nuestro trabajo. Agradecemos Ashraful Haque por su ayuda que incorpora líneas de células tumorales en el modelo. Agradecemos el apoyo financiero para este estudio por las subvenciones del Bardhan Investigación y Educación Trust (BRET) y Yorkshire Cancer Research (YCR).

Células esofágicas humanas se obtuvieron a partir de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. Se obtuvo el consentimiento informado para que el tejido se puede utilizar con fines de investigación, y el tejido utilizado de forma anónima bajo las aprobaciones éticas adecuadas (SSREC 165/03, Tejido humano de investigación del Banco de licencia 12179). 1. Aislamiento de células humanas epiteliales del esófago <ol><li> Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, preparar el medio de cultivo epitelial mediante la mezcla de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y F12 de Ham en una relación 3: 1 (v: v). Añadir 10% (v / v) de FCS, 10 ng del factor de crecimiento epidérmico / ml, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 g / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 2 x 10 -7 M triyodotironina, 1 x 10 -10 M toxina del cólera, 2 x 10 -3 M glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B. </li><li> El uso estándartécnicas estériles, pusieron 11 ml de DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B en un matraz de cultivo de tejido T75. Añadir 1 x 10 6 irradiados letalmente fibroblastos 3T3 de ratón 12 en 1 ml del mismo medio y se incuba durante la noche a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. Esto producirá una capa de alimentación para el posterior cultivo de células epiteliales. </li><li> Con un bisturí y siguiendo las recomendaciones de un anatomopatólogo, diseccionar una muestra de aproximadamente 2 cm 2 de tejido de la región de fondo libre de enfermedad de la mucosa escamosa esofágica obtenidos de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. El transporte al laboratorio en un recipiente de 50 ml de medio de transporte estéril (PBS 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,625 g / ml de anfotericina B) a temperatura ambiente. </li><li> En este punto, almacenar el tejido en el transportemedio para un máximo de 12 horas (durante la noche) a 4 ° C, por conveniencia; Sin embargo, no use los períodos de almacenamiento más largos que son fruto de la viabilidad celular reducida. </li><li> Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, esterilizar una hoja de bisturí por inmersión en etanol al 70% durante 5 min. Enjuague en PBS estéril. </li><li> Coloque el tejido en una placa de Petri estéril y utilizar el bisturí para cortar en tiras de 0,5 cm. Añadir 5 ml de 0,1% (w / v) de tripsina en PBS a la placa de Petri, colocar la tapa sobre el plato y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Añadir 5 ml de FCS al tejido en la placa de Petri para inhibir la tripsina. Sosteniendo la tira de tejido con pinzas estériles, raspar suavemente la superficie epitelial con la hoja del bisturí durante 1-2 min por tira para eliminar las células epiteliales en el medio circundante. Retire el tejido raspado y reservar. Repita el proceso para todas las tiras de tejido. </li><li> Recoger el medio que contiene las células epiteliales desprendidas en un tubo de centrífuga de 15 mly centrifugar (5 min, 200 xg). Verter el sobrenadante y resuspender el precipitado en 12 ml de medio epitelial (descrito en el paso 1.1). </li><li> Retirar y desechar el medio de la capa de células de alimentación en el matraz T75 preparado en la etapa 1.2. Usar una pipeta estéril para añadir la suspensión de células que contiene las células epiteliales recién aisladas al matraz y se incuba a 37 ° C en un 5% de CO 2, atmósfera humidificada. </li><li> Después de 24 horas verter y desechar el medio de cultivo, que también contendrá restos celulares, y reemplazar con 12 ml de medio epitelial fresco. Continuar la incubación a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. Colonias comenzarán a aparecer durante el próximo de 24 a 48 horas y pueden ser vistos por colocar el frasco de cultivo bajo un microscopio óptico estándar. Retirar el medio de cultivo gastado y reemplazar con un volumen igual de medio fresco cada 2 a 3 días. </li><li> Una vez que el frasco se ha alcanzado el 80% de confluencia, el paso de las células 13. Dividir la cells en una proporción de 1: 5 para aumentar el número de células para su uso en el modelo. Siga el paso 1.2 para establecer capas de alimentación de las células irradiadas 3T3 en cada matraz que recibirá las células epiteliales de las 24 horas anteriores a pases de las células. Nota: Utilice las células epiteliales en el modelo de esófago se describe a continuación entre los pasos 1 y sólo el 4. </li></ol> 2. Aislamiento de fibroblastos humanos esofágicas <ol><li> Trabajando en una cabina de flujo laminar y utilizando una técnica estéril, tome el tejido a un lado en el paso 1.7. Colocar en una placa de Petri estéril y picar finamente cortando con una hoja de bisturí estéril. Añadir 10 ml de 0,5% (w / v) Una solución de colagenasa y coloque la tapa en la caja de Petri y se incuba a 37 ° C durante la noche en una de CO 2, ambiente humidificado 5%. </li><li> Transferir el resumen a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar (10 min, 200 xg), cuidadosamente verter y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de medio de cultivo de fibroblastos (DMEM 10% de FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamina, 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,625 g / ml de anfotericina B). </li><li> Coloque la suspensión en un matraz T75 e incubar a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. Después de 24 horas se vierte fuera el medio, que contendrá los escombros y reemplazar con 12 ml de medio de fibroblastos fresco. Reemplazar el medio de cultivo cada 2 a 3 días y las células de paso una vez que han alcanzado 80% de confluencia 13, la división de las células en una proporción 1: 5 para aumentar el número de células. Nota: Utilice las células de fibroblastos en el modelo descrito a continuación entre los pasos 4 y sólo el 10. </li></ol> 3. Preparación de la cellularized-De esofágica Andamios <ol><li> Obtener esófagos porcina intacta en un matadero de cerdos Landrace recién sacrificados que se utilizan para la producción de alimentos. Uno esófago única proporcionará andamios suficientes para aproximadamente 30 construcciones independientes. Nota: Debido a la extensa y hora consuming requiere protocolo de esterilización, normalmente es digno de obtención y procesamiento de un mínimo de 10 esófagos a la vez. </li><li> Colocar inmediatamente el esófago recién extirpado en una olla estéril 180 ml que contenía aproximadamente 150 ml de solución de povidona yodada 10% durante 5 min para reducir cualquier carga microbiana contaminante. Transferir el esófago a un segundo bote que contiene aproximadamente 100 ml de PBS estéril que contiene 200 IU / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B. <ol><li> Vuelva a colocar la tapa sobre el recipiente y transportar el esófagos al laboratorio a temperatura ambiente. Dos o tres esófagos pueden ser transportados en cada recipiente, dependiendo de su tamaño. </li></ol></li><li> Una vez en el laboratorio, manipular el tejido en una campana de flujo laminar utilizando una técnica aséptica para minimizar la contaminación microbiana. Esterilizar pinzas, tijeras y hojas de bisturí por inmersión durante 5 min en etanol al 70%, y lavado en PBS estéril. </li><li> Manejar los esophagus con unas pinzas estériles. Usando las tijeras, corte abierta longitudinalmente el esófago. Enjuague el tejido colocando el esófago en un bote estéril 180 ml que contenía aproximadamente 100 ml de PBS estéril y agitando suavemente para eliminar los residuos. </li><li> Limpiar un tablero de corcho disección rociando etanol generosamente con 70% y dejar secar. </li><li> Retire el esófago del PBS, y el uso de agujas estériles, precisar el esófago en el tablero, más alta superficie de la mucosa. Sujete la superficie de la mucosa en un extremo del esófago con pinzas estériles y alejarse de la junta. Esto separará la mucosa de la submucosa subyacente. <ol><li> A continuación, utilice una hoja de bisturí estéril para diseccionar el esófago longitudinalmente a lo largo de la lámina propia, quitando los alfileres a medida que la disección avanza para permitir que la mucosa que se levante de distancia. </li></ol></li><li> Conserve la mucosa diseccionado y deseche la submucosa subyacente. </li><li> Corte y deseche las más proximales y distales 2 cm de tél mucosa ya que hay un mayor número de glándulas submucosas y una lámina propia más gruesa en esas zonas, respectivamente 7. </li><li> Utilice un bisturí para cortar el tejido restante en 5 cm 2. Coloque todo el tejido cortado en una olla estéril 180 ml que contenía aproximadamente 150 ml de PBS estéril y agitar suavemente para enjuagar el tejido. Si el procesamiento de más de cinco esófagos a la vez puede ser necesario utilizar varias ollas de este y los tres pasos siguientes. </li><li> Utilizando pinzas estériles, transferir el tejido cortado en una olla de 180 ml que contiene 150 ml de estéril M NaCl 1, 200 UI / ml de penicilina, 200 mg / ml estreptomicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B. Incubar durante 72 horas a 37 ° C. </li><li> Coloque el tejido en un bote de 180 ml fresco que contiene 150 ml de PBS estéril. El epitelio se han comenzado a separar visiblemente del tejido subyacente. Pelar suavemente el epitelio separar desde el esófago cerdo usando pinzas estériles y deseche. <ol><li> Coloque el restante ttema en un 180 ml olla fresca y añadir 150 ml de PBS estéril. Agite suavemente durante 5 min para lavar. Vierta el PBS y repetir dos veces más con PBS fresco. </li></ol></li><li> Colocar todo el tejido en una botella de vidrio de 500 ml que contiene 400 ml de estéril 80% (v / v) de solución de glicerol durante 24 horas a temperatura ambiente. Transferencia a 400 ml de estéril 90% (v / v) para una solución de glicerol 24 horas más. </li><li> Almacenar en 400 ml de solución de glicerol al 100% estéril a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 meses para deshidratar y esterilizar el tejido mientras que preserva la integridad de la membrana basal. </li></ol> 4. Producción de la Cultura de Medios <ol><li> Preparar suero de ternero recién nacido quelado para su uso en el medio de cultivo. <ol><li> Verter 100 g de Chelex 100 en una botella de vidrio de 1 L y añadir agua de-ionizada. El volumen exacto no es crítico pero suficiente agua debe añadirse para cubrir el polvo Chelex. Añadir un agitador magnético y esterilizar en autoclave (121 ° C durante15 min). </li><li> Permita que la botella se enfríe y el Chelex se asiente. En una cabina de flujo laminar verter el exceso de agua, añadir 500 ml de suero de ternero recién nacido (NCS) y dejar agitar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Deja de agitar y permitir que el Chelex para resolver, esto puede tardar hasta 30 minutos. En una cabina de flujo laminar se decanta el suero quelado con una pipeta estéril, teniendo cuidado de no perturbar el Chelex, y almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 ° C. </li></ol></li><li> Prepare tres medios diferentes en una cabina de flujo laminar, comenzando con la pro-proliferativa y terminando con formulaciones pro-diferenciadores. <ol><li> Preparar Composite Medio I compuesto por DMEM y Hams F12 en una proporción 3: 1 (v: v), 4 x 10 -3 M de L-glutamina, 0,5 mg / ml de hidrocortisona, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triyodotironina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesterona, 10 mg / ml eninsulina, 10 mg / ml de transferrina, 10 ng / ml de selenio, 1 x 10 -3 M etanolamina y 0,1% (v / v) quelado NCS. </li><li> Preparar Compuesto II como Medium Medium Compuesto I, excepto reemplazar el suero quelado con 0,1% (v / v) no quelados NCS. </li><li> Preparar Composite Medium III como compuesto Medium II excepto progesterona omitir y aumento de suero a 2% (v / v) no quelados NCS. </li></ol></li></ol> 5. La producción de la mucosa esofágica Modelo Humano <ol><li> Realizar todos los trabajos en una campana de flujo laminar, utilizando una técnica aséptica para mantener un ambiente estéril. Esterilizar todas las herramientas por inmersión en etanol al 70% durante 5 min, antes de enjuagar en PBS estéril. </li><li> El día antes de que sea necesario, a rehidratar el andamio esofágico porcina acelular. Se requiere un pedazo de andamio para construir cada uno para estar preparados. <ol><li> Para rehidratar el lugar del tejido pedazos suficientes de andamio porcina en una olla que contiene 100 ml de PBS estéril, agitar y remojo durante 10 min. Decant el PBS y reemplazar con PBS fresco. Repita el proceso de lavado cinco veces para asegurar la eliminación de todo rastro de glicerol. </li></ol></li><li> Pruebe la esterilidad andamio incubando el tejido rehidratado durante la noche en 100 ml de DMEM a 37 ° C. Si no hay cambio en el color o turbidez del medio de cultivo al final del periodo de incubación el andamio se supone que es estéril. Una vez que se ha confirmado la esterilidad, coloque el 5 cm andamio 2 acelular en una placa de 6 pocillos, con el lado superior de la submucosa. </li><li> Colocar un anillo de grado médico estéril de acero inoxidable (diámetro interno 10 mm, diámetro externo 20 mm) en el centro de cada andamio y presionar suavemente hacia abajo con pinzas estériles, para asegurar un sellado adecuado con el tejido. </li><li> Cosecha de los fibroblastos usando tripsina-EDTA 13 para producir una suspensión celular. Contar las células utilizando un hemocitómetro 14. Centrifugar la suspensión de células (10 min, 200 xg). Resuspender el sedimento celular en una apropiaciónvolumen te de medio de fibroblastos para producir un recuento final de células de 2,5 x 10 6 células por ml. </li><li> Añadir 0,2 ml de medio de fibroblastos, que contiene 5 x 10 5 fibroblastos esofágicas humanos, dentro de cada anillo. Inundar el área alrededor de la parte exterior del anillo con aproximadamente 2 ml de medio de fibroblastos. Se incuba a 37 ° C en un CO 2, ambiente humidificado 5%. </li><li> Después de 24 hr eliminar el medio de anillos y de fibroblastos y añadir al menos 5 ml de medio de fibroblastos fresco a cada pocillo, asegurando que el andamio está totalmente sumergido en un medio. Cultura durante 1 semana, a 37 ° C en un 5% de CO 2, atmósfera húmeda reemplazando el medio cada 2 a 3 días. </li><li> Después de 1 semana quitar las placas de 6 pocillos que contienen los andamios a una campana de inundación laminar, retire el medio e invertir cada andamio usando pinzas estériles, la colocación de la superficie de la mucosa hacia arriba. Este punto de tiempo se conoce como Día 0. </li><li> Coloque los anillos de acero sobre la superficie de la mucosa en el centro deel tejido como en el paso 5.4. </li><li> Preparar los frascos T75 de células epiteliales de tripsinización 13. Después de lavar el PBS y antes de la adición de solución de tripsina-EDTA, añadir 2 ml de solución estéril de 0,02% (w / v) solución de EDTA a cada matraz. Incubar durante 2 minutos a 37 ° C. Toque en el frasco suavemente para separar selectivamente la capa alimentadora i3T3 dejando las células epiteliales adjuntos. Nota: Por lo general, no es práctico o necesario a paciente coincide con las células epiteliales de los fibroblastos ya incorporadas en el modelo de la semana anterior. </li><li> Retirar la solución de EDTA que contiene la capa de alimentación y añadir solución de tripsina-EDTA para cosechar las células epiteliales 13. Contar las células utilizando un hemocitómetro 14. Centrifugar la suspensión de células (10 min, 200 xg). Resuspender el sedimento celular en un volumen apropiado de Composite Medium 1 para producir un recuento final de células de 5 x 10 6 células por ml. </li><li> Añadir 0,2 ml de compuesto medio I, que contiene 1 x 10 6 células epiteliales, dentro del anillo. Inundar el área alrededor de la parte exterior del anillo con aproximadamente 2 ml de compuesto medio I y colocar las construcciones en la incubadora a 37 ° C en un 5% de CO 2, atmósfera húmeda. </li><li> Después de 24 horas (día 1) quitar los anillos y medio y agregar al menos 5 ml de Compuesto fresca Medio I, asegurando los andamios están completamente sumergidos y volver a la incubadora. Después de un 24 horas más (Día 2) eliminar el medio y se sustituye con al menos 5 ml de Compuesto Medio II, asegurando de nuevo los andamios están totalmente sumergidas y regresan a la incubadora. </li><li> En el Día de grado médico estéril rejillas de malla de acero inoxidable 4 lugar (2 cm de ancho x 2 cm de largo x 0,5 cm de altura), en placas de 6 pocillos frescos, uno por cada constructo. Use pinzas estériles para transferir las construcciones en la parte superior de las rejillas de acero, superior superficie de la mucosa. <ol><li> Añadir suficiente Composite Medium III de manera que el líquido alcanza la parte inferior del compuesto, pero la superficie esexpuesta al aire, esto asegura que la muestra se mantiene a una interfase aire-líquido. El volumen exacto de medio requerida variará dependiendo del espesor del andamio, el volumen del pozo y la altura precisa de la rejilla de acero inoxidable. </li></ol></li><li> Mantener los materiales compuestos en una interfase aire-líquido para entre 10 y 20 días (día 14 a día 24), dependiendo de los requisitos del experimento. Sustituya el medio compuesto III con medio fresco cada 2 a 3 días (Lunes, Miércoles, Viernes es un régimen de fácil uso). Nota: Después de 5 días en una interfaz aire-líquido (día 9) las construcciones tienen un epitelio esofágico suficientemente maduro como para ser utilizado en los experimentos sobre el impacto de los factores ambientales en el epitelio esofágico. </li><li> Al final del experimento, fijar los constructos para el análisis histológico y la tinción inmunohistoquímica 7, o extracto de proteína o ARN 11,16 15 desde el epitelio para más analyses. Si es necesario, retener el medio de cultivo acondicionado para el análisis de moléculas de señalización extracelular 17. </li></ol>

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H., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+in+human+epidermal+cells+of+a+soluble+protein+precursor+of+the+cross-linked+envelope:+activation+of+the+cross-linking+by+calcium+ions.">Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions.</a> Cell. 18 (3), 681-694 (1979).</li><li>Eves, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+invasion+in+reconstructed+human+skin+is+influenced+by+skin+cells+-+investigation+of+the+role+of+proteolytic+enzymes.">Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este manuscrito describe la producción y caracterización de un modelo de la mucosa esofágica humana biológicamente relevante adecuado para uso como una plataforma experimental para estudiar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en el epitelio esofágico. Los pasos más críticos para el éxito de la producción de un modelo de la mucosa esofágica humana son: asegurar que la mayoría de las células epiteliales permanecen proliferativa y no lo ha comenzado a dife...

La mucosa esofágica comprende un epitelio escamoso estratificado por encima de una capa de tejido conectivo, la lámina propia, y es uno de los primeros sitios para encontrar factores de estrés ambiental ingeridos. La exposición a las toxinas alimentarias está implicado en el desarrollo del carcinoma escamoso de esófago, mientras que el reflujo esofágico duodenogastro es un factor crítico en la patogénesis de la metaplasia de Barrett, que se asocia con un mayor riesgo de progresión a adenocarcinoma esofágico. Carcinomas esofágicos son la 8ª tumor maligno más común en los hombres del Reino Unido y el adenocarcinoma de esófago está aumentando rápidamente en el mundo occidental 1. Por otra parte, ha habido pocas mejoras en el pronóstico de la enfermedad, con una tasa de supervivencia global a 5 años de alrededor del 15%. En consecuencia, existe una necesidad de plataformas experimentales para investigar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en este epitelio esofágico y su potencial implicación en la Developo de metaplasia o neoplasia. Aunque las líneas celulares inmortalizadas o tumorales permiten a los investigadores para estudiar la respuesta de las células epiteliales a estos factores de estrés in vitro, siguen siendo proliferativa y fallan a diferenciarse en las células epiteliales maduros que se encuentran en las capas superiores de la mucosa esofágica. Además, las líneas de células que ya han sido sometidos a la tumorigénesis pueden proporcionar información limitada sobre las respuestas iniciales de las células normales dentro del epitelio a factores ambientales; y esta es la etapa en la que el potencial para la intervención terapéutica puede ser más alto. Finalmente, los sistemas de cultivo de células convencionales no logran captar las interacciones potencialmente importantes entre células epiteliales y mesenquimales y entre estas células y la matriz circundante que ocurren dentro de los tejidos in vivo. Los modelos animales proporcionan un microambiente más realista para el estudio de las respuestas de la epitheli esofágicoum y puede incorporar la inducción artificial de la enfermedad de reflujo gastro-esofágico 2. Sin embargo, puede ser más difícil de manipular los factores de estrés ambientales en estos modelos y que puede no representar plenamente la respuesta dentro del esófago humano. Otros modelos esofágicas humanos experimentales se han desarrollado que utilizan células primarias, células inmortalizadas o líneas de células tumorales en un colágeno, fibroblastos o combinado colágeno / Matrigel, andamio que contienen 3,4. Es menos mano de obra para generar estos andamios que el andamio de esófago acelular descrito en este manuscrito, y estos modelos organotípicos proporcionan una herramienta útil, en particular en el estudio de la invasión tumoral 5,6, donde la infiltración de células tumorales en el gel de colágeno puede ser fácilmente observado. Sin embargo, estos geles de colágeno tienen propiedades mecánicas no nativos y carecen de ciertas características del tejido original, incluyendo una membrana basal específico y el appropriattopografía de la superficie e. Esto puede influir en el comportamiento de las células resultantes en, por ejemplo, más pobre adhesión entre el epitelio y el andamio cuando se utiliza un andamio de gel de colágeno 7. Como consecuencia de ello se desarrolló el andamio de esófago porcino acelular, con la ventaja de ser un andamio biológicamente más realista y por lo tanto más apropiado para su uso como una plataforma experimental. También se ha demostrado que es mejor para incorporar células primarias en las construcciones de esófago que inmortalizadas líneas de células epiteliales del esófago, tales como Het-1A, ya que estas células forman un epitelio multicapa, pero no para estratificar o diferenciar 4,7,8 . En consecuencia, este protocolo ha sido adaptado de un método ya en uso en el laboratorio MacNeil para la fabricación de tejidos de la piel y mucosa oral ingeniería 9,10 e incorpora un andamio de esófago porcino-de cellularized combinado con células esofágicas humanas primarias epiteliales y fibroblastos. Thiprotocolo s produce un epitelio estratificado maduro, similar a la de la esófago humano normal como se demuestra por CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción. El modelo resultante proporciona una plataforma experimental para estudiar las respuestas a factores de estrés ambiental, y se ha utilizado eficazmente para investigar los cambios en la expresión génica en el epitelio esofágico en respuesta a el reflujo componentes 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">215240</td>
			<td>Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-D1112</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>LM-H1236</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Labtech</td>
			<td>FB-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R+D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Prepare 200 &#181;g/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydorcortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0396</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2767</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2036</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2752</td>
			<td>Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Prepare stock solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td>Brand name Fungizone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td>Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td>10830E</td>
			<td>Brand name Videne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">433209</td>
			<td>Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Autoclave to sterilise before use (121 &#730;C for 15 min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26010074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-phosphorylethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0503</td>
			<td>Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin, transferrin, selenium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-838Z</td>
			<td>Used for composite media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.02% solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">11819650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml universal tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>SLS7504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 ml pot</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SLS</td>
			<td align="right">150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steel mesh grids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ki67</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>KI67-MM1-L-CE</td>
			<td>Clone MM1 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9004</td>
			<td>Clone 6B10 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK14</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>LL002-L-CE</td>
			<td>Clone LL002 Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>INV</td>
			<td>Clone&#160; SY5 Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE21</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96062201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OE33</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">96070808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Het-1A</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse 3T3 fibroblasts</td>
			<td>ATCC-LGC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>previously growth arrested by irradiation (60 Gy)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, characterization and potential uses of a 3d tissue-engineered human esophageal mucosal model

La incidencia tanto de adenocarcinoma de esófago y su precursor, metaplasia de Barrett, están aumentando rápidamente en el mundo occidental. Además adenocarcinoma esofágico generalmente tiene un pronóstico pobre, con pocas mejoras en las tasas de supervivencia en los últimos años. Estas son las condiciones difíciles de estudiar y no ha habido una falta de plataformas experimentales adecuados para investigar los trastornos de la mucosa esofágica. Un modelo de la mucosa esofágica humano ha sido desarrollado en el laboratorio MacNeil que, a diferencia de los sistemas de cultivo de células 2D convencionales, recapitula las interacciones célula-célula y célula-matriz presentes in vivo y produce un epitelio estratificado maduro similar a la de la humano normal esófago. Brevemente, el modelo utiliza células no transformadas normales fibroblastos humanos primarios esofágicas y epiteliales cultivadas dentro de un andamio acelular de esófago de origen porcino. Caracterización inmunohistoquímica de este modelopor CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción demuestra recapitulación apropiado de la histología de la mucosa esofágica humano normal. Este modelo proporciona un modelo experimental robusto, biológicamente relevante de la mucosa esofágica humano. Puede ser fácilmente manipulado para investigar una serie de preguntas de investigación, incluyendo la eficacia de agentes farmacológicos y el impacto de la exposición a factores ambientales tales como el alcohol, las toxinas, alta temperatura o componentes el reflujo gastro-esofágico. El modelo también facilita períodos prolongados de cultivo no alcanzables con cultivo celular 2D convencional, lo que permite, entre otras cosas, el estudio del impacto de la exposición repetida de un epitelio maduro para el agente de interés para un máximo de 20 días. Además, una variedad de líneas celulares, tales como las derivadas de tumores de esófago o metaplasia de Barrett, se puede incorporar en el modelo para investigar procesos tales como la invasión tumoral y responsivene drogasss en un entorno más biológicamente relevante.

Este manuscrito describe el proceso requerido, que se muestra en forma esquemática en la Figura 1, para cultivo de modelos 3D del epitelio esofágico humano con éxito. Para confirmar la idoneidad del modelo como una plataforma experimental histológico y estudios inmunohistoquímicos han llevado a cabo la comparación de los tejidos cultivados con mucosa escamosa esofágica humano normal. Evaluación histológica del epitelio producido por el método descrito muestra una, ...

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Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

production-characterization-potential-uses-3d-tissue-engineered-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K vistas.  University of Sheffield.  Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal. 

Video: Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocolo para la evaluación relativa hidrodinámico de Tri-lámina polimérica Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Investigación

Bioingeniería

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Un 3D Cultura Modelo sensibles a hormonas de la glándula mamaria humana epitelio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desarrollo de un Modelo Organotípicos multicelular tridimensional de la mucosa intestinal humanas cultivadas en condiciones de microgravedad

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...