Los fondos para este protocolo fueron proporcionados por el Programa Intramuros del NICHD a KWR (ZIA HD009002-01). Agradecemos a Jeff Farrell y a su laboratorio por sus esclarecedores comentarios, a Will Anderson por su excelente apoyo técnico, a Leanne Iannucci por realizar pruebas de estrés en el protocolo y medir la irradiancia, y a las instalaciones de pez cebra compartidas de los NIH por su arduo trabajo para mantener saludable al pez cebra.

Investigando el desarrollo de la manipulación de la señalización optogenética en el pez cebra

Los autores no tienen nada que revelar.

La inyección de ARNm es la estrategia actual para administrar bOpto-BMP/Nodal a embriones de pez cebra. Este método tiene varios inconvenientes. En primer lugar, la cantidad adecuada de ARNm varía de un laboratorio a otro. La cantidad utilizada debe ser suficiente para activar la señalización de forma robusta con la exposición a la luz, pero sin la activación inadvertida de la oscuridad. Es una buena idea probar varias cantidades para encontrar niveles óptimos de ARNm y, una vez establecidos, crear alícuotas de una mezcla maestra para introducir de forma reproducible la misma cantidad de ARNm. En segundo lugar, la distribución desigual del ARNm inyectado puede conducir a una activación desigual de la señalización. Se cree que la inyección en el centro de la célula (no en la yema) promueve una distribución uniforme del ARNm. Finalmente, debido a que el ARNm inyectado se degrada con el tiempo, este enfoque puede no ser adecuado para experimentos en embriones más viejos. En el futuro, estos problemas podrían abordarse mediante líneas transgénicas de pez cebra que expresen de forma ubicua bOpto-BMP/Nodal con un promotor materno o inducible por fármacos. Aunque trabajar con peces cebra adultos potencialmente sensibles a la luz puede ser un desafío en este contexto, se han desarrollado con éxito los transgénicos de pez cebra 61,62 y Drosophila 22,34,35,63 que albergan herramientas optogenéticas.
Evitar la fotoactivación inadvertida es un desafío general con las herramientas optogenéticas. Para simplificar, trate los embriones inyectados de más de 1,5 hpf como sensibles a la luz. La exposición inadvertida a la luz a menudo se puede evitar simplemente envolviendo platos o platos con papel de aluminio. Sin embargo, para los experimentos que requieren la observación visual de embriones vivos de más de 1,5 hpf, es posible utilizar fuentes de luz roja o cubrir las fuentes de luz blanca con papel de filtro de gel económico que bloquea las longitudes de onda de dimerización de LOV (Tabla de materiales).
La caja de luz descrita aquí está diseñada para aplicaciones específicas que requieren un control preciso sobre los niveles de irradiancia de la luz, la dinámica y las longitudes de onda (Figura 2). Otros beneficios de esta caja de luz incluyen una exposición uniforme a la luz, un calentamiento involuntario insignificante de la muestra, un amplio espacio para múltiples placas de 6 pocillos y fuentes de luz de larga duración y bien caracterizadas espectralmente. Sin embargo, pueden ser preferibles diferentes estrategias de exposición a la luz dependiendo de la aplicación de la investigación. Muchos laboratorios han desarrollado sistemas de exposición a la luz uniforme más simples y rentables con huellas más pequeñas, incluido el revestimiento de incubadoras con tiras de LED, la suspensión de paneles LED sobre las muestras o la incorporación de LED en las tapas de los platos de cultivo 32,38,39,40,64,65,66. Es importante destacar que la caja de luz utilizada en este protocolo no permite a los usuarios regular de forma independiente los pozos individuales (a diferencia de Bugaj et al.52) ni proporcionar control espacial sobre la exposición a la luz. La activación optogenética localizada espacialmente se ha demostrado con bOpto-BMP38 y bOpto-Nodal39 utilizando láseres en sistemas SPIM o confocal, respectivamente, y también se ha realizado con muchas otras estrategias optogenéticas en una variedad de sistemas modelo (discutidos en Rogers y Müller12). Algunos enfoques incluso han logrado una resolución espacial subcelular 29,30,31. Aunque la implementación de sistemas de exposición a la luz localizados espacialmente está fuera del alcance de este protocolo, los experimentos de activación espacial con bOpto-BMP/Nodal son teóricamente posibles con equipos especializados, como dispositivos de microespejos digitales o enfoques de enmascaramiento. Se anima a los lectores a explorar la extensa literatura sobre cajas de luz de bricolaje para experimentos optogenéticos antes de comprometerse con una estrategia de exposición a la luz (véase, por ejemplo, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar y Khammash 53 y más en https://www.optobase.org/materials/).
Las estrategias de optogenética molecular a menudo ofrecen un mayor grado de control espacio-temporal sobre los procesos biológicos en comparación con los enfoques históricos como los mutantes, la expresión génica ectópica, las proteínas recombinantes y los fármacos. Los lectores que estén interesados en los beneficios de los enfoques optogenéticos pueden explorar otras herramientas publicadas disponibles en el pez cebra y otros organismos. Estos incluyen herramientas para manipular vías de señalización adicionales 32,65,67,68, regular la expresión génica 61,64,66,69,70,71, alterar la localización de proteínas 31,72 y activar la apoptosis 62. Estas herramientas y muchas otras están convenientemente catalogadas en OptoBase, un recurso web curado para enfoques de optogenética molecular28. Para aquellos que se inspiran en la creación de nuevas herramientas optogenéticas, el recurso también presenta descripciones útiles de proteínas que responden a la luz que se han empleado en una amplia gama de estrategias, incluidas las proteínas que responden a la luz y a las longitudes de onda verde, roja e infrarroja cercana. Estamos entusiasmados de que la comunidad científica se dé cuenta de todo el potencial de los enfoques de optogenética molecular.

Las vías de señalización permiten que las células respondan a su entorno y coordinen actividades a escala de todo el tejido y el organismo. Las señales cruciales para el desarrollo embrionario incluyen los miembros de la superfamilia TGF-beta, la proteína morfogenética ósea (BMP) y el Nodal 1,2,3. Durante la embriogénesis, las vías reguladas por estas y otras señales modelan el plan corporal mediante el control de la expresión génica y procesos adicionales para garantizar que los diversos tejidos y órganos se desarrollen e interactúen adecuadamente. Las patologías, incluidos los defectos congénitos y el cáncer, pueden ocurrir cuando la señalización o las respuestas a la señalización se alteran 4,5,6,7. A pesar de la rigurosa investigación sobre la señalización, aún queda mucho por descubrir sobre cómo se decodifican los niveles y la dinámica en una variedad de contextos 8,9,10,11, especialmente durante el desarrollo 12,13,14,15,16,17,18,19.
Para comprender cómo se decodifica la señalización, un experimento ideal sería manipular los niveles de señalización, el tiempo y/o la dinámica, con un alto grado de control espacial y temporal, y evaluar los resultados. Por ejemplo, se proponen gradientes de señalización espacial precisos para modelar los tejidos en desarrollo20,21. La alteración de las distribuciones espaciales del gradiente de señalización ayudaría a probar esta hipótesis22. Además, la importancia de la dinámica de señalización en la generación de diversas respuestas celulares es cada vez más clara: la misma vía de señalización puede instruir a las células para que se diferencien o proliferen dependiendo de la frecuencia de señalización, por ejemplo 9,23. Los paradigmas experimentales en los que la dinámica de señalización puede ser fácilmente manipulada serán valiosos para explorar la relación entre la dinámica y las decisiones sobre el destino celular 8,12,13,14,15.
Históricamente, se han utilizado múltiples métodos para manipular la señalización en contextos de desarrollo, lo que ha llevado a descubrimientos fundamentales 1,2,3. La señalización se puede bloquear mediante mutantes de pérdida de función de la vía, expresión de inhibidores ectópicos o fármacos antagonistas. Los métodos para activar la señalización incluyen fármacos agonistas, ligandos recombinantes, expresión ectópica de ligandos o receptores constitutivamente activos y mutantes de pérdida de función inhibidores de vías. Estos métodos se extienden a lo largo de un continuo de control experimental. Por ejemplo, los mutantes y la expresión ectópica pueden caer en el lado del mazo del continuo: con estos enfoques, los cambios dramáticos y sistémicos en la actividad de la vía pueden causar una muerte prematura e impedir investigaciones en etapas posteriores, o con el tiempo pueden dar lugar a efectos pleiotrópicos que son difíciles de desentrañar. Además, a menudo es difícil manipular de forma independiente una característica de señalización a la vez, como el nivel o la duración. Hacia el otro extremo del continuo, algunos métodos ofrecen un control experimental más preciso, como los dispositivos microfluídicos que exponen las muestras a fármacos o proteínas recombinantes con control temporal y, a veces, espacial 18,24,25, o métodos genéticos, incluidos los promotores inducibles por choque térmico y específicos de tejido que pueden ofrecer beneficios similares16,26,27. Sin embargo, estos métodos pueden ser difíciles de ejecutar, pueden no ser reversibles, pueden tener una cinética relativamente lenta o una resolución deficiente, y pueden no estar disponibles en algunos sistemas modelo.
Los enfoques de optogenética molecular son una poderosa adición a este conjunto de herramientas. Estos enfoques utilizan proteínas que responden a diferentes longitudes de onda de luz para manipular procesos biológicos, incluida la señalización 8,12,13,14,15, y se han desarrollado durante décadas para su uso en una variedad de sistemas, desde cultivos celulares hasta animales enteros 12,13,28. En comparación con los enfoques históricos, la optogenética molecular a menudo puede ofrecer un mayor grado de control espacio-temporal sobre los procesos biológicos: el controlador en los sistemas optogenéticos es la luz, y el control de la longitud de onda, la intensidad, la duración y la frecuencia de exposición de la luz es relativamente sencillo. Con sistemas sofisticados como los microscopios confocales y de dos fotones, es posible el control espacial en el rango subcelular 29,30,31. Se han desarrollado y aplicado herramientas para manipular optogenéticamente la señalización en varios sistemas, incluyendo los descritos en Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 y Huang et al.34. Por ejemplo, aprovechando el control espacial que ofrece la optogenética, esta estrategia se ha utilizado recientemente para modificar un gradiente de señalización en embriones de Drosophila, demostrando que la embriogénesis de la mosca es sorprendentemente robusta a los cambios en este gradiente22. La reversibilidad y la rápida cinética de encendido/apagado de los activadores de señalización optogenética también los han convertido en herramientas atractivas para investigar la decodificación de la dinámica de señalización 8,12,13,14,15,34,35,36.
El embrión temprano de pez cebra es un sistema in vivo muy adecuado para estudios optogenéticos porque está fertilizado externamente, es transparente, amigable con la microscopía y genéticamente tratable. La exposición a la luz es más fácil de administrar a los embriones que se desarrollan fuera de la madre, la luz puede penetrar y acceder a sus tejidos no opacos, los embriones vivos de pez cebra toleran bien la obtención de imágenes (además de ser transparentes) y los métodos genéticos existentes brindan oportunidades directas para experimentos de derribo y sobreexpresión, además del desarrollo de transgénicos útiles37.
Recientemente, se desarrollaron herramientas optogenéticas para activar la señalización de BMP38 y Nodal39 en embriones de pez cebra con exposición a la luz azul (Figura 1). Nos referimos a estas herramientas como bOpto-BMP y bOpto-Nodal (b para activada por luz azul y Opto para optogenética). bOpto-BMP/Nodal se basan en mecanismos similares de activación de la vía. La unión de los ligandos BMP o Nodal a sus respectivos receptores serina-treonina quinasas impulsa las interacciones del dominio de la quinasa receptora que conducen a la fosforilación de los efectores de señalización (Smad1/5/9 para BMP y Smad2/3 para Nodal). A continuación, los efectores de señalización fosforilados se translocan al núcleo y regulan la expresión génica diana3 (Figura 1A, D). Estas interacciones de receptores quinasas se pueden hacer sensibles a la luz mediante el acoplamiento de receptores quinasas a proteínas dimerizantes sensibles a la luz: Con la exposición a la luz, estas proteínas quiméricas deberían dimerizarse, lo que hace que los dominios de los receptores quinasas interactúen y activen la señalización (Figura 1B, C, E, F). Es importante destacar que, a diferencia de los receptores endógenos, bOpto-BMP/Nodal no contienen dominios extracelulares de unión al ligando, lo que garantiza una actividad independiente del ligando (Figura 1C,F). Esta estrategia de activación optogenética se logró primero con el receptor tirosina quinasas40,41,42 y luego se aplicó al receptor serina-treonina quinasas.
bOpto-BMP/Nodal utilizan el dominio de detección de voltaje de luz-oxígeno homodimerizante (LOV) sensible a la luz azul (~450 nm) de la proteína AUREO1 del alga Vaucheria fridiga (VfLOV)43,44. Estas construcciones consisten en un motivo de miristoilación dirigido a la membrana seguido de dominios BMP o quinasa receptor nodal, fusionados con un dominio LOV (Figura 1B, E). La exposición a la luz azul debería causar homodimerización de LOV, lo que resulta en interacciones del dominio de la quinasa receptora que conducen a la fosforilación de Smad respectiva y a la activación de la vía (Figura 1C, F). En el caso de bOpto-BMP, se encontró que una combinación de construcciones con los dominios de la quinasa del receptor tipo I de Acvr1l (también conocido como Alk8) y BMPR1aa (también conocido como Alk3) y el dominio de la quinasa del receptor de tipo II de BMPR2a activan de manera óptima la señalización38 (Addgene #207614, #207615 y #207616). Para bOpto-Nodal, se utiliza una combinación de constructos con el dominio receptor quinasa tipo I de Acvr1ba y el dominio receptor quinasa tipo II de Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal se han introducido en embriones tempranos de pez cebra mediante la inyección de ARNm en la etapa de una célula, y se han utilizado para investigar el papel de la duración de la señalización en la interpretación nodal39, para determinar por qué el pez cebra pierde la capacidad de responder al Nodal45 y para examinar cómo los genes diana de BMP responden a diferentes niveles de señalización de BMP38. Es probable que estas herramientas continúen siendo útiles en una amplia gama de investigaciones futuras. Sin embargo, la fuerza de los activadores de señalización optogenética es también su debilidad: las muestras sensibles a la luz deben tratarse con cuidado para evitar la actividad de señalización ectópica inadvertida. La exposición a la luz ambiental o a la luz solar puede activar bOpto-BMP/Nodal.
Este protocolo proporciona sugerencias prácticas para el uso de activadores nodales y BMP basados en LOV codificados por ARNm en embriones tempranos de pez cebra. Comienza detallando una estrategia para construir una caja de luz para controlar la exposición a la luz y la temperatura uniformes (Figura 2, Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3, Archivo Suplementario 4, Archivo Suplementario 5, Archivo Suplementario 6, Archivo Suplementario 7, Archivo Suplementario 8). A continuación, se describen dos experimentos de control clave que determinan si un activador de señalización optogenética se comporta como se espera, es decir, activa la actividad de la vía solo cuando se expone a la luz (Figura 3). El primer ensayo de control consiste en examinar los fenotipos un día después de la fecundación en embriones expuestos a la luz y no expuestos (Figura 3A). Los embriones expuestos a la luz inyectados con ARNm, pero no los embriones no expuestos, deben fenocopiar BMP o sobreexpresión ganglionar (Figura 4A,B; Los fenotipos de BMP, en particular, son claramente distinguibles en este momento46). Este ensayo proporciona una lectura rápida de la actividad. En el segundo ensayo de control, para determinar si los fenotipos son causados específicamente por un exceso de señalización BMP o ganglionar y para observar directamente el cambio en los niveles de señalización, se utiliza la tinción de inmunofluorescencia para detectar efectores de señalización fosforilados (pSmad1/5/9 o pSmad2/3, respectivamente) después de una exposición a la luz de 20 minutos alrededor de la etapa tardía de blástula / gastrulación temprana, cuando la actividad de señalización ha sido bien descrita12, 16,17,47,48,49,50 (Figura 3B y Figura 4C). (Tenga en cuenta que, aunque se ha demostrado la activación localizada espacialmente tanto para bOpto-BMP38 como para bOpto-Nodal39, este protocolo solo describe la exposición uniforme a la luz y las estrategias de activación de la señalización). Es aconsejable ejecutar estos experimentos de control antes de aplicar bOpto-BMP/Nodal a preguntas de investigación específicas para determinar las condiciones experimentales locales ideales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

Las vías de señalización orquestan procesos biológicos fundamentales, como el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Se requieren métodos para manipular experimentalmente la señalización para comprender cómo se interpreta la señalización en estos contextos de amplio alcance. Las herramientas de optogenética molecular pueden proporcionar manipulaciones reversibles y sintonizables de la actividad de la vía de señalización con un alto grado de control espacio-temporal y se han aplicado in vitro, ex vivo e in vivo. Estas herramientas acoplan dominios proteicos que responden a la luz, como el dominio de detección de voltaje de luz-oxígeno homodimerizante de luz azul (LOV), con efectores de señalización para conferir un control experimental dependiente de la luz sobre la señalización. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de la proteína morfogenética ósea (BMP) basada en LOV y los activadores de señalización nodal bOpto-BMP y bOpto-Nodal en el embrión temprano de pez cebra ópticamente accesible. Describe dos experimentos de control: un ensayo rápido de fenotipo para determinar las condiciones experimentales apropiadas y un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar directamente la señalización. Juntos, estos experimentos de control pueden ayudar a establecer una línea para el uso de herramientas optogenéticas en embriones tempranos de pez cebra. Estas estrategias proporcionan una plataforma poderosa para investigar el papel de la señalización en el desarrollo, la salud y la fisiología.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

Autor destacado: Manipulación de la señalización en embriones de pez cebra para decodificar las decisiones sobre el destino de las células 

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

El objetivo de los dos experimentos de control descritos aquí es determinar si bOpto-BMP/Nodal activan sus respectivas vías en respuesta a la exposición a la luz azul sin afectar a la señalización en ausencia de luz, como se esperaba. Utilice estos controles para establecer el flujo de trabajo experimental adecuado en su laboratorio antes de aplicar bOpto-BMP/Nodal a sus preguntas de investigación de interés.
El ensayo de fenotipado se puede completar en solo 2 días y proporciona una indicación útil de la actividad de señalización y la fototoxicidad (Figura 3A). Los embriones inyectados expuestos a la luz azul deben fenocopiar un exceso de señalización de BMP (ventralización46; Figura 4A, panel izquierdo) o señalización ganglionar (defectos del desarrollo relacionados con el mesendodermo adicional 1,3,47,57,58,59,60 (Figura 4A, panel derecho)). Si se inyectan, los embriones expuestos a la luz son afenotípicos, pruebe la calidad del ARNm y considere inyectar más, y verifique dos veces la estrategia de exposición a la luz para garantizar una exposición constante a la luz brillante (la luz de ~ 450 nm con una irradiancia de 45 W / m2 debería activar fuertemente la señalización). Por el contrario, los embriones inyectados y no expuestos deben tener un aspecto idéntico al de los hermanos no inyectados. Si se inyectan, los embriones no expuestos exhiben fenotipos, se reduce la cantidad de ARNm inyectado y se vuelve a evaluar la configuración experimental para garantizar que los embriones no expuestos estén protegidos de la exposición a la luz. Los datos que se muestran en la Figura 4B muestran los resultados de los experimentos típicos de fenotipado con cantidades adecuadas de ARNm y condiciones de exposición: una fuerte actividad de señalización es evidente en los embriones inyectados y expuestos a la luz, con solo una pequeña fracción de los embriones inyectados y no expuestos que exhiben fenotipos.
El ensayo de fenotipado también brinda la oportunidad de evaluar la fototoxicidad. Si la fototoxicidad es insignificante, los embriones no inyectados y expuestos a la luz deben aparecer de tipo salvaje, similar a los embriones no inyectados y no expuestos. Si los embriones no inyectados y expuestos a la luz tienen defectos, pero no los embriones no inyectados y no expuestos, considere la posibilidad de disminuir la irradiación de la luz. Una irradiancia de 45 W/m2 activa de forma robusta la señalización sin fototoxicidad evidente. Los datos mostrados en la Figura 4B no muestran diferencias preocupantes entre los embriones no inyectados, expuestos a la luz y no inyectados, no expuestos, lo que indica una fototoxicidad insignificante.
Aunque los ensayos de inmunofluorescencia requieren más tiempo y esfuerzo (~1 semana) en comparación con el ensayo de fenotipado (2 días), la tinción de inmunofluorescencia proporciona una lectura directa de la actividad de la vía de señalización y puede revelar cambios sutiles en la señalización que podrían no reflejarse en la morfología macroscópica. La inmunofluorescencia es especialmente importante para evaluar las respuestas a bOpto-Nodal, ya que el exceso de señalización ganglionar a menudo da lugar a que los embriones se lisen en 1 dpf, lo que puede tener muchas causas, en contraste con los fenotipos específicos de ventralización característicos del exceso de señalización de BMP46 (Figura 4A). Los embriones inyectados expuestos a la luz azul deben exhibir un aumento uniforme en la fosforilación de Smad1/5/9 o Smad2/3 en comparación con los embriones no inyectados expuestos a la luz. Si los niveles no aumentan, o solo aumentan débilmente, pruebe la calidad del ARNm y considere inyectar más, y vuelva a verificar la estrategia de exposición a la luz. Una exposición de 20 minutos a la luz azul con una irradiancia de 45 W/m2 alrededor del 40% de epíbola debería activar fuertemente la señalización. Si la tinción de pSmad no es uniforme, intente inyectar ARNm en el centro de la célula (en lugar de en la yema), lo que puede dar lugar a una distribución más uniforme del ARNm.
Los embriones inyectados y no expuestos deben tener niveles de pSmad comparables a los de los embriones no inyectados. Como anécdota, hemos observado una fosforilación de Smad con fugas con bOpto-Nodal que con bOpto-BMP. Si los niveles de pSmad aumentan en embriones inyectados y no expuestos, reduzca la cantidad de ARNm inyectado. Además, vuelva a evaluar la configuración experimental para asegurarse de que 1) los embriones no expuestos no estén expuestos inadvertidamente a la luz, y 2) la exposición a la luz durante la fijación sea mínima. Durante la etapa de fijación, es fundamental dejar transcurrir no más de 45 segundos entre la extracción de la caja de luz y la inmersión en formaldehído. Además, durante este paso, minimice la exposición a la luz de la habitación y a la luz solar cerrando las persianas de las ventanas, apagando las fuentes de luz blanca, usando luces rojas o cubriendo las fuentes de luz blanca con papel de filtro de gel que bloquea la luz azul (Tabla de materiales).
Los datos de la Figura 4C muestran los resultados de los experimentos típicos de tinción de inmunofluorescencia con cantidades adecuadas de ARNm y condiciones de exposición a la luz: los niveles de pSmad son similares en embriones no inyectados y no expuestos, mientras que los embriones inyectados y expuestos a la luz exhiben niveles más altos de fosforilación de Smad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> Figura 1: Estrategia de activación de la señalización bOpto-BMP y -Nodal. (A) La vía de señalización endógena de BMP se activa mediante la unión al ligando BMP, lo que conduce a la formación de un complejo receptor de tipo I/II, la fosforilación de Smad1/5/9 y la expresión de genes diana de BMP. Los receptores tipo I BMPR1aa y Acvr1l también se conocen como Alk3 y Alk8, respectivamente. BMPR2a es un receptor de tipo II. (B) bOpto-BMPconstruye 38. Los dominios quinasas putativos de BMPR1aa y Acvr1l se fusionan con LOV; la fusión BMPR2a-LOV contiene el dominio quinasa putativo y el dominio C-terminal (CTD) del receptor. Todas las fusiones están dirigidas a la membrana con un motivo de miristoilación (Myr). Los dominios están separados por enlazadores de glicina-serina (GS). Las construcciones se etiquetan en el CTD con una etiqueta de epítopo de alta disponibilidad. Se encontró que esta combinación de tres constructos activa de manera óptima la señalización BMP. (C) Activación de la señalización de BMP mediada por bOpto-BMP. Cuando se exponen a la luz azul, los dominios LOV se dimerizan, lo que se cree que desencadena la formación de complejos y la activación de la señalización. (D) La vía de señalización nodal endógena se activa mediante la unión del ligando nodal, lo que conduce a la formación de un complejo receptor de tipo I / II, la fosforilación de Smad2/3 y la expresión de genes diana nodal. El receptor tipo I Acvr1ba y el receptor tipo II Acvr2ba también se conocen como Acvr1b y Acvr2b, respectivamente. (E) construcciones bopto-nodales39. Los dominios quinasas putativos de Acvr1ba y Acvr2ba se fusionan con LOV. Todas las fusiones están dirigidas a la membrana con un motivo de miristoilación (Myr). Los dominios están separados por enlazadores GS. Las construcciones se etiquetan en el CTD con una etiqueta de epítopo de alta disponibilidad. (F) Activación de señalización nodal mediada por bopto-nodal. Cuando se exponen a la luz azul, los dominios LOV se dimerizan, lo que se cree que desencadena la formación de complejos y la activación de la señalización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> Figura 2: Caja de luz con control de temperatura para experimentos optogenéticos . (A) Un iluminador de microplaca LED se monta en la parte superior de una incubadora utilizando un soporte LED hecho a medida. Los embriones de pez cebra en una placa de 6 pocillos en el primer estante se exponen a la luz a través de un orificio perforado en la parte superior de la incubadora. El estante inferior contiene un segundo conjunto de embriones de control no expuestos en una placa de 6 pocillos envuelta en papel de aluminio. La puerta de la incubadora está forrada con burletes para evitar la exposición inadvertida a la luz de la habitación o a la luz solar. (B) Detalle del procedimiento para crear un agujero en la incubadora usando un taladro escalonado. El modelo de incubadora utilizado aquí tiene un panel interno que requirió perforar un segundo orificio más grande (Tabla de materiales). (C) Detalle del soporte LED personalizado diseñado para un sistema de iluminación de tres longitudes de onda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> Figura 3: Flujo de trabajo del experimento bOpto-BMP/Nodal. Ensayo fenotípico y tinción de inmunofluorescencia pSmad para probar la actividad de bOpto-BMP/Nodal. Los embriones se inyectan con ARNm en la etapa de una célula y se transfieren a una caja de luz a más tardar 1,5 h después de la fertilización (hpf). (A) Ensayo fenotípico. Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se crían en la oscuridad o se exponen a una luz azul uniforme a partir de 1,5 hpf hasta 1 día después de la fertilización (dpf). La actividad de señalización optogenética se puede evaluar mediante la puntuación de los embriones para fenotipos consistentes con el exceso de actividad de la vía. (B) tinción de inmunofluorescencia pSmad. Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se crían en la oscuridad hasta un 40% de epibolía (~6 hpf). La mitad de los embriones inyectados y la mitad de los embriones no inyectados se exponen a una luz azul uniforme durante 20 minutos. Después de la exposición, todos los embriones se fijan y se someten a tinción de inmunofluorescencia para pSmad. Los niveles elevados de pSmad1/5/9 o pSmad2/3 reflejan la activación optogenética de la señalización de BMP o Nodal, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> Figura 4: Evaluación de las respuestas de señalización activadas por la luz en embriones de pez cebra. Los embriones de pez cebra se inyectaron en la etapa de una célula con ARNm que codifica bOpto-BMP/Nodal. (A) Los embriones se criaron en la oscuridad o se expusieron a una luz azul uniforme a partir de 1,5 h después de la fertilización (hpf). Los fenotipos se puntuaron 1 día después de la fecundación (dpf). Se muestran fenotipos representativos. El exceso de señalización de BMP conduce a la ventralización (panel izquierdo), mientras que el exceso de señalización ganglionar causa defectos de desarrollo asociados con el mesendodermo adicional (panel derecho). Barra de escala = 500 μm. (B) Cuantificación del fenotipo. Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se criaron en la oscuridad a partir de 1,5 hpf (bulbo negro). La mitad de los embriones inyectados y la mitad de los embriones no inyectados fueron expuestos a una luz azul uniforme (bombilla azul). (C) Los embriones inyectados y los hermanos no inyectados se criaron en la oscuridad a partir de 1,5 hpf (bulbo negro). Al 40% de epiboly (~6 hpf), la mitad de los embriones inyectados y la mitad de los no inyectados fueron expuestos a una luz azul uniforme (bombilla azul). Después de 20 min, todos los embriones se fijaron y se sometieron a tinción de inmunofluorescencia para Smad1/5/9 o Smad2/3 fosforilados. Las intensidades más altas de pSmad indican un aumento de la señalización BMP/Nodal, respectivamente. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Montaje completo de la caja de luz. Archivo PDF 3D que muestra una vista 3D del conjunto completo de la caja de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Despiece de caja de luz. Archivo PDF 3D que muestra una vista 3D del conjunto de la caja de luz despiezada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Junta de luz grande. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar la junta de luz grande para el soporte LED utilizando una cortadora láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: Junta de luz pequeña. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar la pequeña junta de luz para el soporte del LED utilizando una cortadora láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 5: Base de plataforma acrílica. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar la base de la plataforma acrílica del soporte LED utilizando una cortadora láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 6: Plataforma acrílica vertical. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar el soporte LED de la plataforma acrílica vertical utilizando una cortadora láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 7: Soporte acrílico a la izquierda. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar el soporte izquierdo acrílico del soporte LED mediante una cortadora láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo Complementario 8: Derecho de soporte acrílico. Archivo de dibujo CAD (. DWG) para fabricar el soporte derecho acrílico del soporte LED mediante una cortadora láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Para establecer el plan corporal del embrión durante el desarrollo, se cree que las células decodifican las intensidades de señalización, la dinámica y las combinaciones. Estamos utilizando la optogenética para manipular estas características de señalización en embriones de pez cebra. Este enfoque nos ayudará a comprender cómo las células embrionarias decodifican la señalización para tomar algunas de las primeras decisiones sobre el sulfato. Los enfoques optogenéticos discutidos aquí utilizan la luz como control remoto para activar la señalización ganglionar o BMP de forma rápida y reversible.Debido a que la exposición a la luz es fácil de dirigir, estos enfoques pueden ofrecer un mejor control experimental sobre la señalización. Nuestro protocolo introduce el uso de estas herramientas sensibles a la luz en embriones de pez cebra. Con este control temporal y espacial mejorado, ahora debería ser posible realizar modificaciones precisas de señalización durante el desarrollo del pez cebra.Esperamos que esto profundice nuestra comprensión de cómo las células decodifican la señalización para tomar decisiones débiles, lo que ayudará a revelar cómo se desarrolla el plan corporal embrionario.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K vistas.  NIH. Para establecer el plan corporal del embrión durante el desarrollo, se cree que las células decodifican las intensidades de señalización, la dinámica y las combinaciones. Estamos utilizando la optogenética para manipular estas características de señalización en embriones de pez cebra. Este enfoque nos ayudará a comprender cómo las células embrionarias decodifican la señalización para tomar algunas de las primeras decisiones sobre el sulfato. Los enfoques optogenéticos discutido...

Video: Autor destacado: Manipulación de la señalización en embriones de pez cebra para decodificar las decisiones sobre el destino de las células 

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Investigación

Biología del Desarrollo

Injecting bOpto-BMP&#47;Nodal Constructs into Zebrafish Embryos 

Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos   

To begin, use an incubator and an LED Microplate Illuminator to create a light box for controlling light exposure and temperature. Then, position a six well plate on the upper shelf of the incubator, and check whether the light beam evenly encompasses it. Use a sheet of paper to visualize the distribution of light coverage.Use a light meter to measure irradiance and spatial uniformity. At least one day before injections, make injection dishes and agarose-coated six well plates. Rinse an injection dish mold with embryo medium, and place gently onto molt and agarose.Once the agarose has solidified, delicately use the tab to remove the mold. Next, prepare flamed glass pipettes for immunofluorescence experiments on dechlorinated embryos. Place the end of a glass pipette into a bun and burner flame, and rotate continuously until the edges become smooth.Prepare an injection mix using the mRNAs shown here. For the phenotyping assay, introduce the needle through the corion directly into the center of the cell at the one cell stage, and inject one nanoliter of the injection mix. If conducting an immunofluorescence assay, target the center of the cell of coated embryos at the one cell stage.For both assays, prepare enough embryos for the unexposed non-injected, unexposed injected, exposed non-injected, and exposed injected embryos. Select at least 30 embryos per condition. For the immunofluorescence assay, prepare an additional dish containing non-injected embryos as a proxy to assess the progression of developmental stages.After injection, incubate the embryos in Petri dishes at 28 degrees Celsius.

Inyección de bOpto-BMP/construcciones nodales en embriones de pez cebra 

Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

To begin, incubate the injected zebrafish embryos at 28 degrees Celsius. Around 1.5 HPF at the four to 16 cell stage, remove unfertilized and unhealthy embryos. For the phenotyping assay, wrap the unexposed control plate with noninjected and injected embryos in aluminum foil.Position the foil covered plate on the lower shelf, and the exposed plate on the upper shelf of the 28 degrees Celsius light box. After confirming that the dish cover is in place, activate the blue light, and shut the light box door to prevent unintended room light exposure. For the immunofluorescence assay around 1.5 HPF, individually wrap the exposed and unexposed dishes in aluminum foil while keeping the proxy dish unwrapped.Put all the dishes in the 28 degrees Celsius light box without activating the LED. Close the light box door to prevent inadvertent exposure to room light. At approximately five HPF, use a dissecting scope to evaluate the developmental stage of the proxy embryos.Also remove the wrapped dishes to ensure uniform temperature exposure across all dishes. Once the proxy embryos reach 40%epiboly, uncover the exposed dish and place it on the upper shelf of the light box. Keep the unexposed dish covered on the lower shelf.Immediately activate the blue light, close the door, and set a timer for 20 minutes. To prepare for fixation, eliminate as much room light as possible. Just before fixation, take tubes containing 4%formaldehyde from four degrees Celsius and position them beside the light box.After 20 minutes, open the door of the light box and remove the dish that wasn't exposed to light. Use a flamed glass pipette tip to remove the light sensitive embryos from the dish. Then to immerse the embryos in 4%formaldehyde, submerge the flamed glass pipette tip in the formaldehyde, and allow the embryos to sink into the liquid.Store fixed embryos at four degrees Celsius overnight.

Experimento de exposición a la luz para activar BMP o señalización nodal en pez cebra

Evaluation of bOpto-BMP&#47;Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment  

For the phenotyping assay, perform the light exposure experiment on bOpto-BMP bOpto-Nodal expressing zebrafish embryos, and remove them from the light box at one day post-fertilization between 24 to 32 HPF. Using a dissecting scope, evaluate phenotypes and establish a scoring rubric. Assess embryos while they remain within the chorion for convenience.Utilize a pipette to probe to reposition embryos for viewing from different angles. For the immunofluorescence assay, after incubating embryos in 4%formaldehyde at four degrees Celsius overnight, remove the formaldehyde and rinse them three to five times with PBST. Discard the PBST and add 100%methanol.Seal the tubes and gently invert them to mix residual PBST and methanol. After washing the embryos two more times with methanol, store them at minus 20 degrees Celsius for at least two hours up to several years. Using a microscope equipped for optical sectioning, capture images of immunostained embryos.Immunofluorescent staining experiments with appropriate mRNA amounts and light exposure conditions showed that the pSmad levels were similar and non-injected in unexposed embryos, whereas injected light exposed embryos exhibited higher levels of Smad phosphorylation.