Este protocolo es significativo porque es un método optogenético, o activado por la luz, para inducir la expresión génica, en un organismo intacto. En nuestro caso, un embrión de pez cebra. La ventaja de esta técnica, es que utiliza la luz, como agente inductor, lo que permite un control muy preciso, espacial y temporal de la inducción.
Este protocolo sería útil para cualquier situación en la que la expresión génica inducible sería útil. Esto incluye cosas como el rastreo de linaje, ensayos de ganancia de función o experimentos de rescate. Para empezar, coloque el panel LED en relación con las placas de Petri que contienen embriones para entregar 1,5 milivatios por centímetro cuadrado de potencia de luz a varios embriones a la vez.
Para reducir el riesgo de daño fotográfico al activador transcripcional de la cola, coloque la luz a intervalos de una hora de encendido y apagado utilizando un relé de temporizador, si se ilumina durante más de tres horas. Retire las tapas de las placas de Petri para minimizar la dispersión de la luz de la condensación. Coloque placas de Petri que contengan embriones de control y una caja a prueba de luz para controles oscuros.
Retire los embriones de la iluminación, después de la duración de activación deseada. Para la extracción total de ARN, utilice un kit de extracción de ARN. Transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y elimine el exceso de agua de huevo.
Después de agregar el tampón de lisis, homogeneice los embriones con el mortero de plástico. Transfiera el lisato a una columna provista del kit y siga las instrucciones del fabricante para purificar el ARN. Almacene el ARN purificado, a menos 20 a menos 80 grados Celsius, hasta que use o sintetice inmediatamente el ADNc a partir de un microgramo, ARN total utilizando el kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Agregue un microgramo de ARN en una pared delgada de 0,2 mililitros, tubo de PCR, que contiene cuatro microlitros, de cinco veces la mezcla maestra de reacción de ADNc, seguido de la adición de un microlitro, de 20 veces la solución enzimática de transcriptasa inversa. A continuación, conscierre un volumen final de 20 microlitros, con agua libre de nucleasas. Coloque el tubo en un termociclador programado para la síntesis de ADNc.
Almacene el ADNc sintetizado a menos 20 grados centígrados hasta su uso o úselo inmediatamente para la evaluación cuantitativa. Configure las reacciones cuantitativas de PCR que contienen una mezcla maestra de enzimas verdes cibernéticas. Cinco cebadores diluidos de ADNc y GFP a una concentración nanomolar de 325 en triplicados y conducen la reacción en una máquina de PCR programada en tiempo real.
Al finalizar la reacción, analice la curva de fusión para determinar la especificidad de la reacción. Calcule la inducción activada por la luz como cambio de pliegue en relación con los embriones de control utilizando el método de TC Delta doble. Y use software estadístico para determinar la significación.
Después de retirar los embriones de la iluminación, inmovilice los embriones para obtener imágenes en metilcelulosa al 3% que contiene 0,01% de tricaína en portaobjetos de depresión de vidrio. Adquiera imágenes de fluorescencia y campo brillante en un microscopio estéreo fluorescente conectado a una cámara digital utilizando la configuración estándar del filtro GFP. Fusione imágenes de campo brillante y fluorescencia después de la adquisición con el software de procesamiento de imágenes.
La cuantificación de la expresión de GFP indicó la inducción de la expresión tan pronto como 30 minutos después de la exposición a la luz azul. Los niveles de expresión de GFP continuaron aumentando hasta seis horas, después de la activación de manera constante. La inducción de GFP también se evaluó cualitativamente examinando la intensidad de la fluorescencia en los mismos puntos de tiempo posteriores a la activación.
La fluorescencia GFP por encima de los niveles de fondo se observó por primera vez a las tres horas posteriores a la activación y se volvió notablemente más brillante a las seis horas después de la activación. En contraste, los embriones de control para todos los puntos de tiempo, mantenidos en la oscuridad, no exhibieron ninguna fluorescencia GFP apreciable. La luz activadora debe estar en el rango azul del espectro de luz visible.
Tanto la luz de la habitación como la luz solar contienen algo de luz azul. Así que tenga cuidado de proteger sus controles negativos de cualquier fuente de luz ambiental. El sistema TAEL C120, está codificado genéticamente y es modular y puede impulsar la expresión de cualquier gen de interés.
Por lo tanto, combinado con otras técnicas, se puede utilizar para responder a una variedad de preguntas biológicas.
