Damos las gracias a Fumi Kubo, Thiele y Tod HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) para el asesoramiento sobre los experimentos de comportamiento y DPSS láser establecidos; Heesoo Kim y Chiara Cerri de la MBL Curso de Neurobiología de ayudar en Chef-tdTomato experimentos; PetronellaKettunen (Universidad de Gotemburgo ) para la colaboración inicial de los experimentos optogenético; BaljitKhakh, Eric Hudson, Baca Mike y John Milligan (UCLA) para el asesoramiento técnico, y Roger Tsien (UCSD) para el chef-tdTomato construir. Este trabajo fue apoyado por un NRSA (5F31NS064817) Premio a AMSP y una subvención de la NSF (RIG: 0819010) a AS.

Preparar el siguiente antes de tiempo. 1. Prepare el cable óptico <ol><li> Crear una unidad de almacenamiento para el cable de fibra óptica por fusión del cuello cónico de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un mechero de Bunsen para crear un ángulo de ~ 150 °. </li><li> Usando un cortador de alambre o una hoja de afeitar, corte con cuidado el cable de fibra óptica en dos partes. Cada pieza debe tener un extremo con una FC / adaptador de PC y un extremo expuesto. La tienda de una sola pieza como un cable de reserva. </li><li> Pelar el cable de fibra óptica hasta el revestimiento mediante la eliminación de la cubierta de la fibra y fibras de refuerzo (Figura 1A) de 5,0 cm de extremo cortado del cable. </li><li> Inserte el cable óptico en preparados pipeta Pasteur. Asegúrese de cable puede moverse fácilmente dentro y fuera de la punta de la pipeta. </li><li> Con cable de fibra óptica que sobresale de la punta de pipeta Pasteur, corte con cuidado y retire revestimiento de fibra de alrededor de la fibra de vidrio, ~ 2 mm del extremo del corte. </li><li> El uso de un lápiz de diamante / cristal de corte, corte la fibra de vidrio y se rompen off al final para crear un corte limpio / superficie en el extremo de la fibra (Figura 1B). </li><li> Retirar cable óptico en pipeta Pasteur para su almacenamiento. Repita el paso (1,6) si la punta de la fibra óptica se astilla o rompe de manera desigual. </li><li> Cable óptico en posición pipeta Pasteur utilizando un micromanipulador (Figura 1C). </li></ol> Procedimientos 2-8 describen un método para la inyección de transgenes en embriones generalmente aplicables a muchos experimentos de pez cebra. Variaciones sobre este método, como los descritos en otros vídeos Jové 6, 7, 8, 9, 22 son igualmente eficaces. 2. Tire de agujas de inyección <ol><li> El uso de un extractor de aguja, tire de tubos de vidrio borosilicato en dos agujas con punta afilada gradualmente. Extractor de configuración pueden variar. (En un extractor de aguja Sutter Instruments usamos valores: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, velocidad = 70 y el Tiempo = 150). Cada tirador de aguja es diferente, así optimizar la configuración del extractor emempíricamente. Para obtener más agujas afiladas, aumente el calor y / o de extracción. Para agujas afiladas menos, aumentar el tiempo y / o Pull disminución. </li><li> Agujas Almacenar en un contenedor seguro (es decir, una placa de Petri con una cinta enrollada, de un lado adhesivo). </li></ol> 3. Vierta Moldes de Inyección <ol><li> Derretir 0,5 g de agarosa en embrión de 30 ml / agua azul, hasta que agarosa se disuelva por completo. </li><li> Vierta en la mitad inferior de una placa de Petri. </li><li> Coloque molde rectangular con pozos de montaje (Figura 2) en agarosa, teniendo cuidado de limitar la formación de burbujas alrededor de los pozos. </li><li> Permitir agarosa para solidificar. </li><li> Retire el molde y llenar placa de Petri con azul / agua embrión. </li><li> Guardar en posición vertical, llenado con agua limpia, a la temperatura ambiente para su uso el mismo día o a 4 ° C para su uso futuro. </li></ol> 4. Hacer la mezcla de ADN plasmídico para inyecciones <ol><li> Diluir plásmido de ADN a una concentración de 50 ng / ml con rojo fenol 1:10 en ddH 2 O. Paraejemplo: <table border="1"><tbody><tr><td> 1,0 ml </td><td> ADN de plásmido (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0,5 ml </td><td> rojo fenol </td></tr><tr><td> 3,5 ml </td><td> ddH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Mezcla de ADN se pueden mantener a temperatura ambiente si se utiliza inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C durante varios días. </li></ol> 5. Configure parejas de apareamiento Esto se debe hacer la noche antes de que usted planea hacer inyecciones. <ol><li> Llene los tanques de cría con agua de la instalación y el lugar peces machos y hembras juntos. Si las inyecciones no puede realizarse tan pronto como las luces se encienden en las instalaciones, pescado separado hombres y mujeres con un divisor. </li></ol> 6. Preparar para inyecciones (puede hacerse mientras se espera para embriones) <ol><li> Encienda el inyector de presión de perforación. Asegúrese de que el sistema se ajusta a pulso. Comience con la duración del impulso conjunto a 1. </li><li> Encienda la válvula de aire yAjustar la presión del inyector de aproximadamente 20 psi. </li><li> El uso de un microscopio de disección con el máximo aumento, romper la punta de la aguja con un fórceps o de póquer para crear una abertura ~ 2 micras (Figura 3, Movie 1). </li><li> Rellenar con la mezcla de las agujas del ADN a través de: 1. La colocación de la aguja, lado de la punta hacia arriba, en la mezcla de DNA y dejando que la aguja de llenar por acción capilar o 2. Utilizando una punta de largo alcance para pipetear 1-2 l de la DNA mezclar directamente en la aguja. </li><li> Lugar lleno aguja en un lugar seguro hasta que esté listo para inyectar. </li></ol> 7. Recoger embriones <ol><li> Después de las luces de las instalaciones se han encendido, quitar separadores (si corresponde). Recoge los embriones con un colador / tamiz pequeño y transferirlos a una placa de Petri con azul fresca / agua embrión. </li></ol> 8. Se inyecta embriones en la etapa de célula 1-2 <ol><li> La transferencia de embriones recolectados para moldes de inyección utilizando una pipeta de plástico. </li><li> El uso de un microscopio de disección, empuje suavemente embriones enpozos con fórceps o un póker romo (Figura 4, Movie 2). </li><li> Coloque la aguja cargada en un micromanipulador y posición sobre embriones. </li><li> Calibrar el volumen de inyección mediante el ajuste de la duración del pulso en incrementos de 1-paso hasta conseguir el volumen deseado (1 ~ nl). Esto podría ser calibrado con un micrómetro de portaobjetos, tal como se describe en algunos vídeos anteriores Jove 8, 22, pero para este experimento precisión no es necesaria, ya que una amplia gama de volúmenes de inyección se traducirá en una expresión adecuada. </li><li> Inyectar 1 ~ nl ADN mezclar directamente en la célula y repita para todos los embriones. El ADN también se puede inyectar en la yema de huevo, pero esto tiende a ser menos eficiente (Figura 5, la película 3). </li><li> Retire los embriones inyectados de molde con un chorro suave de azul / agua embrión. </li><li> Tienda inyectado embriones a 28,5 ° C en la oscuridad. </li><li> Retire fecundados, embriones dañados o muertos de forma periódica. </li><li> Tratar a los embriones wiª PTU entre 18-24 HPF para evitar la pigmentación. </li></ol> 9. Pantalla para la expresión transgénica <ol><li> Manualmente dechorionate 24-48 HPF embriones utilizando fórceps. </li><li> Anestesie larvas utilizando 0,02% tricaína. </li><li> El uso de un microscopio de fluorescencia de disección, identificar las larvas con RB o expresión de neuronas del trigémino y transferirlos a un nuevo plato con dulce PTU azul / embrión agua. Los embriones con escasa expresión en las células fácilmente identificables son óptimas, pero las neuronas individuales se orientarán para la activación con un cable de fibra óptica para una amplia gama de la densidad de expresión es aceptable. </li><li> Tienda de embriones a 28,5 ° C en la oscuridad hasta la etapa experimental deseado. </li></ol> 10. Monte larvas para experimentos de comportamiento <ol><li> Hacer un 1,5% de agarosa de baja fusión en ddH 2 O y guárdelo en un bloque de 42 ° C de calor para evitar que se solidifique. </li><li> Uso de una pipeta Pasteur de vidrio, la transferencia de una de las larvas pre-seleccionados en una tinae del 1,5% de agarosa de baja fusión con tan poco azul / embrión agua como sea posible. </li><li> Transferir las larvas en una gota de agarosa en una pequeña placa Petri. </li><li> Bajo un microscopio de disección, larva posición dorsal hacia arriba. </li><li> Cuando agarosa se ha solidificado, cortar la agarosa con una navaja fina (# 11 bisturí), dejando un trozo de agar alrededor de la larva completa. </li><li> Haga dos cortes diagonales en ambos lados de la yema de huevo, tomar cuidado de no mellar la larva. </li><li> Llene el área que rodea a la agarosa con embrión / agua azul. </li><li> Tire de agarosa de distancia del tronco y la cola de la larva (Figura 6). </li></ol> 11. Preparar cámara de alta velocidad y software de imágenes <ol><li> Monte de alta velocidad de la cámara en la disección de alcance. </li><li> Conecte la cámara al ordenador. </li><li> Encienda el ordenador. </li><li> Encienda cámara de alta velocidad. </li><li> Abrir video / imágenes de software (Utilizamos software AOS imagen y se describen los procedimientos para su uso aquí, pero las imágenes de otrosoftware es igualmente aceptable). </li><li> Ajuste la configuración de la cámara en consecuencia (es decir, 1.000 fotogramas por segundo (fps), el 50% de amortiguamiento gatillo u otros ajustes preferidos). </li><li> Inicie la grabación. </li></ol> 12. Activa las neuronas individuales utilizando un láser 473 nm <ol><li> Conecte estimulador, láser y cable óptico. </li><li> Encienda el estimulador. </li><li> Establecer estimulador a un máximo de 5 voltios y una duración de pulso de 5 ms. </li><li> Activar el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> El uso de un microscopio de disección para colocar la punta del cable óptico cerca del cuerpo celular de una neurona con Chef-tdTomato expresión (Figura 6). </li><li> Entregar pulso de luz azul para activar la neurona sensorial. </li><li> Comportamiento de grabación con una cámara de alta velocidad en 500 o 1.000 imágenes por segundo. </li><li> Repetir el experimento como se desee, a la espera 1 min entre cada activación para evitar la habituación. (Hemos registrado un mínimo de tres respuestas para cada neurona). </li><li> Alarvas de liberación, separarlas de agarosa con pinzas, cuidando de no lastimar al animal. Este animal se puede permitir seguir desarrollando y el procedimiento se puede repetir en una etapa anterior para caracterizar el desarrollo del comportamiento. El embrión también puede volver a montar de alta resolución de imagen confocal de células activadas por la que se correlacionan con el comportamiento de la estructura celular, como se describe a continuación. </li><li> Traslado larva a la placa de cultivo con azul fresca / agua embrión. Utilizamos una placa de 24 pocillos para realizar un seguimiento de las larvas individual. </li></ol> 13. Imagen Neuron (s) con un microscopio confocal <ol><li> Anestesie larvas con 0,02% tricaína. </li><li> Larvas Mount, lado dorsal hacia arriba, en agarosa al 1,2% bajo punto de fusión o en un molde dorsal. </li><li> Imagen Chef-tdTomato neuronas con un láser nm 543 y filtro apropiado y objetivo. Nosotros utilizamos un objetivo de 20x. </li><li> Eliminar las larvas de agarosa y volver al bienestar individual con el azul / agua embrión. </li><li> Almacenar a 28,5 ° C en la oscuridad durante further análisis. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún interés en competencia financiera.

Hemos descrito un enfoque para la activación de las neuronas optogenético RB individuales en el pez cebra en vivo. Nuestro método emplea transgénesis transitorio para expresar una variante fluorescente etiquetados canalrodopsina, Chef-tdTomato 13, en determinadas neuronas somatosensoriales. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para el uso en otras poblaciones de larvas de pez cebra celulares. Usando este enfoque consistente suscitó respuestas conductuales 34 a 48 larva...

El desarrollo de métodos optogenética para promover o inhibir la excitabilidad neuronal con longitudes de onda definidas de luz ha permitido estudiar la función de las distintas poblaciones de neuronas en los circuitos neurales que controlan el comportamiento de 1, 19, 21. Esta técnica se utiliza a menudo para activar grupos de neuronas, pero también puede ser usado para activar las neuronas individuales. Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles a estos métodos ya que son translúcidas, su sistema nervioso se desarrolla rápidamente, y la creación de animales transgénicos es rápido y de rutina. Sin embargo, importantes obstáculos técnicos se debe superar para lograr fiablemente activación única neurona. Para optimizar un procedimiento para la activación de las neuronas optogenético pez cebra individuales, nos hemos centrado en las neuronas somatosensoriales. Larvas de pez cebra detectar una variedad de estímulos somatosensoriales utilizando dos poblaciones de neuronas: las neuronas del trigémino, que inervan la cabeza, y Rohon-(BeardRB), las neuronas que inervan el resto del cuerpo. Cada trigémino y RB neurona proyecta un axón periférico que se ramifica extensamente en la piel para detectar los estímulos y un axón central que se conecta aguas abajo a los circuitos neuronales. Los animales responden a tocar tan pronto como 21 horas después de la fertilización (hpf), lo que indica que los circuitos somatosensoriales coherentes han formado 5, 18. Durante el desarrollo larvario al menos algunas sinapsis las neuronas del trigémino y RB sobre la célula de Mauthner para activar respuestas clásicas de escape, pero la acumulación de evidencia sugiere que hay varias clases de neuronas somatosensoriales con diferentes patrones de conectividad que pueden provocar variaciones en el comportamiento de escape 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Nuestra motivación para el desarrollo de este método fue caracterizar la función de comportamiento de las diferentes clases de neuronas somatosensoriales, pero este enfoque podría en principio ser usado para estudiar la función de la neurona o casi cualquier población de neuronas en LARval pez cebra. Douglass et al. Descrito previamente un método para activar canalrodopsina-2-expresando neuronas somatosensoriales con luz azul, provocando comportamiento de escape 3. Su enfoque utiliza un elemento potenciador del gen ISL1 para conducir la expresión de ChR2-EYFP en las neuronas somatosensoriales. Este transgén, sin embargo, se informó de que muestran una fluorescencia relativamente débil, lo que requiere la co-inyección de un segundo reportero, UAS :: GFP, para permitir la visualización de células que expresan ChR2-EYFP. Este enfoque se utilizó para obtener respuestas de comportamiento entre 24-48 HPF, pero nunca pudo obtener una respuesta más allá de 72 HPF. Por lo tanto, mientras que este método funciona para el estudio de los circuitos neuronales en las fases larvarias tempranas (24-48 hpf), es insuficiente para la caracterización de circuitos neurales y las respuestas de comportamiento en las larvas mayores, cuando haya más diversas respuestas de comportamiento son evidentes y circuitos neuronales son más maduros. Se buscómejorar la sensibilidad de esta técnica con el fin de caracterizar la función de las subpoblaciones de neuronas RB larvales. Para mejorar la expresión se utilizó un potenciador somatosensorial-específico (CREST3) 20 para conducir la expresión de LexA-VP16 y un tramo de secuencias del operador LexA (4xLexAop) 11 para amplificar la expresión de un marcado fluorescentemente y activado por la luz de canal. Esta configuración amplificado expresión del canal, eliminando la necesidad de co-expresión de un segundo reportero y que nos permite determinar directamente la abundancia relativa de la canal en cada neurona. Usando la secuencia de LexA / LexAOp tenía la ventaja adicional de que permite introducir el transgén en líneas indicadoras de pez cebra que utilizan el sistema GAL4/UAS. La expresión transitoria de este transgén resultó en niveles variables de expresión, pero generalmente era lo suficientemente robusta como para visualizar tanto el cuerpo de la célula y las proyecciones axonales de las neuronas individuales en varios días. Para optimizar la sensibilidaddad a la luz se utilizó la luz activado canal Chef, una variante canalrodopsina que consiste en una quimera de channelopsin-1 (Chop1) y channelopsin-2 (Chop2) con un sitio de cruce en hélice bucle EF 13. Este canal se activa a la misma longitud de onda como ChR2, pero requiere una menor intensidad de luz para la activación, por lo que es más sensible que los otros canales de uso común, incluyendo ChR2. La proteína chef fue fusionado a la proteína fluorescente de color rojo, tdTomato, lo que nos permite cribar para la expresión de proteínas sin activar el canal. Como fuente de luz, se utilizó un diodo bombeado de estado sólido (DPSS) láser acoplado a un cable de fibra óptica para proporcionar una precisa, de alta potencia del pulso de luz azul a una región específica de las larvas. Esto nos permitió enfocar la luz láser sobre las neuronas individuales, eliminando la necesidad de encontrar raros animales transgénicos que expresan el canal en una sola neurona. El uso de este enfoque, hemos sido capaces de activar las neuronas individuales RB, registre la respuesta conductuals con una cámara de vídeo de alta velocidad, y la imagen de las neuronas activadas en alta resolución con microscopía confocal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiales </td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 1367820B </td><td> o equivalente (10-15 mm de diámetro) </td></tr><tr><td> 200 m de fibra óptica </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, longitud: 3 m, Final A: FC / PC, Final B: FC / PC, Chaqueta: FT030 </td></tr><tr><td> 50 de fibra óptica micras </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, longitud: 3 m, Final A: FC / PC, Final B: FC / PC, Chaqueta: FT030 </td></tr><tr><td> Pelacables ajustable </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> o de tres agujeros Stripping Tool (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamond escriba Wedge </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Tubos de vidrio borosilicato con filamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Molde de inyección </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figura 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de centrífuga </td><td> Cualquier </td><td> Cualquier </td><td></td></tr><tr><td> Placa de Petri (100x15 mm) </td><td> Cualquier </td><td> Cualquier </td><td></td></tr><tr><td> Placa de Petri (60x15 mm) </td><td> Cualquier </td><td> Cualquier </td><td></td></tr><tr><td> Presión del inyector </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Micromanipulador y stand de metal </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Pipetas de plástico desechables </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Poker (titular Pin pin Insecto) </td><td> Fine Ciencia Tools, Inc. </td><td> 26018-17 y 26000-70 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fine Ciencia Tools, Inc. </td><td> 11255-20 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Microloader puntas de pipeta </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28,5 ° C incubadora </td><td> cualquier </td><td> cualquier </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C bloque de calor </td><td> Cualquier </td><td> Cualquier </td><td></td></tr><tr><td> No estériles hojas de bisturí # 11 </td><td> Bellas Herramientas Científicas, Inc. </td><td> 10011-00 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Disección shacer frente a </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Fluorescente microscopio de disección con filtro estándar </td><td> Cualquier </td><td> cualquier </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 o 710 </td><td> u objetivos equivalentes con láser para las buenas prácticas agrarias y RFP, y 10x, 20x y 40x </td></tr><tr><td> Cámara de alta velocidad </td><td> Tecnologías de la AOS, Inc. </td><td> X-PRI (130.025-10) </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> 473 nm láser portátil </td><td> Láseres de cristal </td><td> CL-473-050 </td><td> o poder superior, con la opción TTL </td></tr><tr><td> S48 estimulador </td><td> Astro-Med, Inc. Grass Instrument división </td><td> S48K </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> FC / PC con el manguito de acoplamiento FC / PC </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> May need para la conexión de cable óptico </td></tr><tr><td> Seguridad de láser Gafas </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> 24 placas de cultivo </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Diapositivas individuales depresión </td><td> Pescador </td><td> S175201 </td><td> O el equivalente </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Instantánea océano </td><td> Ecosistemas Acuáticos </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de metileno </td><td> Pescador </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> o equivalente </td></tr><tr><td> Agarosa de bajo Melt </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; o equivalente </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaína </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> agua azul / embrión </td><td></td><td></td><td> 10 L ddH 2 O 0,6 g Instant Ocean 6 gotas de azul de metileno </td></tr><tr><td> rojo fenol </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml en 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml ddH 2 O disolver a 70 ° C y agitar con frecuencia alicuotar y almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml azul / peces de agua </td></tr><tr><td> Tricaína solución madre </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaína 97,9 ddH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml de Tris 1 M, pH 9,0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; ajustar el pH a 7,0 ~ tienda en 4 ° C o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Larvas de pez cebra se están convirtiendo en un modelo para describir el desarrollo y la función de simples circuitos neuronales. Debido a su fertilización externa, el rápido desarrollo, y la translucidez, en particular el pez cebra se presta a los enfoques optogenético para investigar la función de circuitos neuronales. En este enfoque, sensibles a la luz los canales de iones se expresan en neuronas específicas, permitiendo que el experimentador para activar o inhibir a voluntad y por lo tanto evaluar su contribución a comportamientos específicos. La aplicación de estos métodos en larvas de pez cebra es conceptualmente simple, pero requiere la optimización de los detalles técnicos. Aquí se demuestra un procedimiento para la expresión de una variante en larvas de pez cebra canalrodopsina neuronas somatosensoriales, foto-activación de las células individuales, y el registro de los comportamientos resultantes. Mediante la introducción de algunas modificaciones a los métodos previamente establecidos, este enfoque podría ser utilizado para provocar respuestas de comportamiento de neuronas individuales activados hastaa por lo menos 4 días después de la fertilización-(DPF). En concreto, hemos creado un transgén utilizando una neurona somatosensorial potenciador, CREST3, para conducir la expresión de la variante etiquetados canalrodopsina, Chef-tdTomato. Inyectando este transgén en los embriones de 1-etapa de células resulta en una expresión mosaico en las neuronas somatosensoriales, que se pueden obtener imágenes de microscopía confocal. Illuminating identificado células en estos animales con la luz de un láser DPSS 473 nm, guiado a través de un cable de fibra óptica, provoca comportamientos que se pueden grabar con una cámara de vídeo de alta velocidad y analizados cuantitativamente. Esta técnica podría adaptarse a las conductas de estudio provocados por la activación de cualquier neurona pez cebra. La combinación de este método con perturbaciones genéticas o farmacológico será una manera poderosa para investigar la formación del circuito y la función.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cable óptico configurado. (A) Capas de un cable de fibra óptica. (B) de fibra óptica por cable pelado en una pipeta Pasteur. (C) El cable de fibra óptica en pipeta Pasteur coloca utilizando un micromanipulador. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Inyección plantil...

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Técnicas optogenético han hecho posible el estudio de la contribución de las neuronas específicas de comportamiento. Se describe un método en larvas de pez cebra para la activación de las neuronas somatosensoriales individuales que expresan una variante canalrodopsina (Chef) con un bombeado por diodos de estado sólido (DPSS) láser y el registro de los comportamientos provocados con una cámara de vídeo de alta velocidad.

Optogenético La activación de las neuronas somatosensoriales pez cebra utilizando Chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K vistas.  University of California, Los Angeles. Técnicas optogenético han hecho posible el estudio de la contribución de las neuronas específicas de comportamiento. Se describe un método en larvas de pez cebra para la activación de las neuronas somatosensoriales individuales que expresan una variante canalrodopsina (Chef) con un bombeado por diodos de estado sólido (DPSS) láser y el registro de los comportamientos provocados con una cámara de vídeo de alta velocidad.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Investigación

Neurociencias

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

Utilizando asequible Estructuras de LED para fotos-estimulación de las neuronas

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

Potenciales evocados somatosensoriales de piel Stretch Estimulación Orofacial

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...