El laboratorio del GSCh se financia en parte con IN201222 de apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.

Este procedimiento se esquematiza en la Figura Suplementaria 1. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Detección de mRL y dRL en sobrenadantes de cultivo de P. aeruginosa mediante TLC
<ol><li>Comenzar con el caldo centrifugado de la cepa de interés P . aeruginosa , cultivado en medio líquido durante 24 h (para llegar a la fase estacionaria de crecimiento donde se produce RL). Por lo general, estos cultivos contienen 1 x 109 bacterias por ml.</li>
	<li>Ajuste el pH del cultivo a 2 utilizando HCl concentrado.</li>
	<li>Poner 5 mL del sobrenadante de cultivo acidificado en un tubo de polipropileno de 50 mL y añadir 5 mL de una mezcla 2:1 de cloroformo: metanol.</li>
	<li>Agite el tubo por inversión tres veces, cada vez durante 10 s, y deje el tubo sin inversión durante 2 minutos entre cada agitación.</li>
	<li>Deje el tubo sin agitación durante aproximadamente 3 h hasta que se separen las dos fases, o centrifugue el tubo durante 10 min a 3.000 x g a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera la fase orgánica (capa inferior) a un tubo limpio y deje el tubo en una campana de extracción hasta que se seque.</li>
	<li>Repita el proceso a partir del paso 1.3, colocando la fase orgánica del segundo cloroformo: extracción con metanol, en el tubo que se utilizó en la primera extracción.</li>
	<li>Evaporar la fase orgánica hasta que queden 1 mL o 1,5 mL. Transfiera este volumen a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y evapore el solvente hasta que se seque durante la noche.</li>
	<li>Agregue 50 μL de metanol al tubo seco para resuspender RL.</li>
	<li>Realice cromatografía en capa fina en placas de gel de sílice. NOTA: El tamaño de la placa TLC debe cortarse de acuerdo con el número de muestras que se analizarán. Cada muestra debe aplicarse a 1,5 cm, y el punto de aplicación debe estar a 1 cm del borde de la placa (dibuje una línea horizontal con un lápiz).</li>
	<li>Aplique 5 μL de cada muestra con una micropipeta de 10 μL.</li>
	<li>La fase líquida de TLC consiste en una mezcla 65:15:2 de cloroformo: metanol y ácido acético. Para preparar 35 mL de esta mezcla, mezcle 26 mL de cloroformo, 6 mL de metanol y 0,8 mL de una solución madre al 20% de ácido acético. Mezcle estos solventes y colóquelos en la cámara TLC cerrada durante al menos 10 minutos antes de comenzar la cromatografía, de modo que la atmósfera esté saturada con los solventes volátiles.</li>
	<li>Coloque la placa TLC en la cámara, evitando el contacto con el punto donde se aplicaron las muestras.</li>
	<li>Cierre la cámara y deje el TLC hasta que el solvente alcance 1 cm antes del borde de la placa. En este punto, retire la placa y déjela secar (se puede aplicar un flujo de aire para acelerar el proceso).</li>
	<li>Prepare una solución de α-naftol disolviendo 5 g de este compuesto en 33 mL de etanol. Una vez disuelto, añadir 127,5 mL de etanol, 12,6 mL de agua y 20,5 mL de H2SO4 frío.</li>
	<li>Para detectar la presencia de mRL y dRL, rocíe la solución de α-naftol sobre la placa en la campana de extracción y coloque la placa rociada en un horno a 85 °C durante varios minutos hasta que la marca rosada de RL sea evidente.</li>
	<li>Utilice una imagen del TLC para calcular la proporción de mono- y di-RL presentes en cada muestra utilizando un software que detecte la densidad de cada mancha.</li>
</ol>2. Cuantificación de la cantidad total de RL midiendo los equivalentes de ramnosa presentes en el biosurfactante
<ol><li>Colocar 1,2 mL de un cultivo en fase estacionaria (cultivado durante 24 h) en un tubo de centrífuga de 1,5 mL y centrifugar durante 3 min a 3.000 x g a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo limpio.</li>
	<li>Transfiera 333 μL a un tubo limpio (realice este paso por triplicado) y agregue 1 mL de éter.</li>
	<li>Mezcle vigorosamente en un vórtice durante 30 s. Repita este procedimiento con un tubo a la vez.</li>
	<li>Centrifugar durante 2 min a 3.000 x g a 4 °C. Recoja la fase orgánica (fase superior), transfiérala a un tubo limpio y déjela abierta en la campana de extracción hasta que se produzca la sequedad.</li>
	<li>Repita la extracción con éter como se describe en el paso 2.2. Repita los pasos 2.3 y 2.4.</li>
	<li>Una vez que esté completamente seco, agregue 1 mL de agua a cada tubo. Deje los tubos durante 12 h para permitir que el RL se hidrate, luego agite vigorosamente en el vórtice.</li>
	<li>Coloque un matraz limpio en hielo durante 5 min (ya que es una reacción exotérmica). Preparar una solución de 60% H2SO4 (proteger el matraz de la luz).</li>
	<li>En un tubo limpio, prepare una solución de orcinol al 1,6% en agua destilada. Para preparar el reactivo de orcinol, mezcle 4,4 mL de la solución de H2SO4 al 60% con 0,6 mL de la solución de orcinol al 1,6%.</li>
	<li>Calcular el volumen final del reactivo de orcinol necesario. Añadir 900 μL de este reactivo a cada muestra y a cada concentración de la curva de calibración, utilizando diferentes concentraciones de ramnosa (normalmente, se utilizan 9 concentraciones de ramnosa en el rango de 1 μg/mL a 9 μg/mL), y una con 100 μL de agua, asegurándose de que todas se realicen por triplicado.</li>
	<li>Añada 100 μL de cada muestra de RL a 900 μL del reactivo de orcinol en un tubo de vidrio y mezcle las dos soluciones.</li>
	<li>Incubar durante 30 min en un baño de agua precalentado a 80 °C.</li>
	<li>Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lea la absorbancia de las muestras y la curva de calibración a 421 nm utilizando una celda de cuarzo.</li>
	<li>Calcule la concentración de ramnosa en cada muestra interpolando la absorbancia en la curva de calibración y considerando el volumen utilizado para la determinación.</li>
	<li>Para calcular la concentración en μM, divida la concentración obtenida en μg/mL por 182,2 (el peso molecular de la ramnosa) y multiplíquela por 1000.</li>
</ol>

Análisis comparativo de la producción de ramnolípidos en cepas de Pseudomonas aeruginosa

<ol>
	<li>Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lifestyle:+A+paradigm+for+adaptation,+survival,+and+persistence.">Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence.</a> Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa:+New+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses.">Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li><li>Williams, P., C&#225;mara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+environmental+adaptation+in+Pseudomonas+aeruginosa:+a+tale+of+regulatory+networks+and+multifunctional+signal+molecules.">Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).</li><li>Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., Gonz&#225;lez-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Ya&#241;ez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+produced+by+Pseudomonas:+From+molecular+genetics+to+the+market.">Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market.</a> Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).</li><li>Freschi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+pan-genome+provides+new+insights+on+its+population+structure,+horizontal+gene+transfer,+and+pathogenicity.">The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).</li><li>Quiroz-Morales, S. E., Garc&#237;a-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+origins+of+Pseudomonas+aeruginosa+phylogroups+by+diversity+and+evolutionary+analysis+of+important+pathogenic+marker+genes.">Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes.</a> Diversity. 14 (5), 345 (2022).</li><li>D&#233;ziel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/mass+spectrometry+analysis+of+mixtures+of+rhamnolipids+produced+by+Paeudomonas+aeruginosa+strain+57RP+grown+on+mannitol+or+naphthalene.">Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene.</a> Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).</li><li>Abdel-Mawgoud, A. M., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids:+Diversity+of+structures,+microbial+origins,+and+roles.">Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).</li><li>Toribio, J., Escalante, A. E., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+rhamnolipids+in+bacteria+other+than+Pseudomonas+aeruginosa.">Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).</li><li>Filbig, M., et al., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+process+engineering+on+the+edge-Rhamnolipids+are+a+true+challenge:+A+review.">Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review.</a> Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. , 157-181 (2023).</li><li>Noll, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+for+sustainable+biosurfactant+production:+Techno-economic+and+environmental+assessment+of+a+rhamnolipid+production+process.">Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process.</a> Bioresource Technology. 25, 101767 (2024).</li><li>Garc&#237;a-Reyes, S., Cocotl-Ya&#241;ez, M., Gonz&#225;lez-Valdez, A., Serv&#237;n-Gonz&#225;lez, L., Sober&#243;n Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PqsR-independent+quorum-sensing+response+of+Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+outlier-strain+reveals+new+insights+on+the+PqsE+effect+on+RhlR+activity.">The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity.</a> Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).</li><li>Grosso-Becerra, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+is+a+non-virulent+strain+suitable+for+mono-rhamnolipids+production.">Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).</li><li>Guti&#233;rrez-G&#243;mez, U., Soto-Aceves, M. P., Serv&#237;n-Gonz&#225;lez, L., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+of+rhamnolipids+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+by+redirection+of+the+carbon+flux+from+polyhydroxyalcanoate+synthesis+and+overexpression+of+the+rhlAB-R+operon.">Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon.</a> Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).</li><li>Zibek, S., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., Hausmann, R., Henkel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+on+glycosylated+lipids+produced+by+bacteria+and+fungi:+Rhamno-,+Sophoro-,+Mannosylerythritol+and+Cellobiose+Lipids.">Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids.</a> Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. , 181 (2022).</li><li>Twigg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biosurfactant+research:+time+to+improve+the+rigour+in+the+reporting+of+synthesis,+functional+characterization+and+process+development.">Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development.</a> Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).</li><li>Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+colony+thin+layer+chromatography+and+rapid+characterization+of+Serratia+marscescens+wetting+agents.">Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents.</a> Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).</li><li>Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constituent+analyses+of+glycosaminoglycans.">Constituent analyses of glycosaminoglycans.</a> Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).</li><li>Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rhamnolipids+by+liquid+chromatography/mass+spectrometry+after+solid-phase+extraction.">Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction.</a> Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).</li><li>Rahim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+rhlC+gene+that+encodes+rhamnosyltransferase+2,+an+enzyme+responsible+for+di-rhamnolipid+biosynthesis.">Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis.</a> Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).</li><li>Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+rhamnolipid+production:+A+critical+re-evaluation+of+published+data+and+suggested+future+publication+criteria.">Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).</li><li>Holloway, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Recombination+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).</li><li>Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+investigaction+into+the+origin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA14-old+but+not+lost.">Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).</li><li>Roy, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+multiresistant+taxonomic+outlier+Pseudomonas+aeruginosa+PA7.">Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7.</a> PLoS ONE. 5, e8842 (2010).</li><li>Zhang, Y., Miller, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+octadecane+dispersion+and+biodegradation+by+a+Pseudomonas+rhamnolipid+surfactant+(biosurfactant).">Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant).</a> Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in Molecular Genetics. , 352-355 (1992).</li><li>Abdel-Mawgoud, A. M., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/mass+spectrometry+for+the+identification+and+quantification+of+rhamnolipids.">Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids.</a> Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).</li><li>Lee, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+reveals+that+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+is+combinatorial.">Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial.</a> Genome Biology. 7 (10), 90 (2006).</li><li>Kubicki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+assay+for+screening+and+quantification+of+biosurfactants+in+microbial+culture+supernatants.">A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El método más preciso para detectar y cuantificar el RL es la HPLC acoplada a la espectrometría de masas (MS)7,8,27; Sin embargo, requiere equipos especializados y costosos que pueden no ser accesibles para muchos investigadores. Los métodos descritos aquí se pueden realizar de forma rutinaria con materiales y equipos básicos de laboratorio para detectar y estimar las concentraciones de RL, pero tienen algunas limitaciones...

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental y un patógeno oportunista de gran preocupación debido a su producción de rasgos asociados a la virulencia y su alta resistencia a los antibióticos 1,2. Un metabolito secundario característico producido por esta bacteria es el biosurfactante RL, que se produce de forma coordinada con varios rasgos asociados a la virulencia como la fenazina piocianina, un antibiótico con actividad redox, y la proteasaelastasa 3. Las propiedades tensioactivas y emulsificantes de RL han sido explotadas en diferentes aplicaciones industriales y actualmente se comercializan4.
La mayoría de las cepas de P. aeruginosa, pertenecientes a los filogrupos 1 y 2, producen dos tipos de RL: mRL, que consiste en una fracción de ramnosa unida a un dímero de ácidos grasos principalmente de 10 carbonos, y dRL, que contiene una fracción de ramnosa adicional unida a la primera ramnosa4 (ver Figura 1). Sin embargo, se ha reportado que dos filogrupos menores de P. aeruginosa (grupos 3 y 5) solo producen mRL 5,6. Los dos tipos de RL contienen una mezcla de dímeros de ácidos grasos, que, como se mencionó, son principalmente C10-C10, pero también se producen proporciones más pequeñas de moléculas que contienen dímeros C12-C10, C12-C12 y C10-C12:1. Se ha reportado la caracterización de los congéneres RL producidos por diferentes cepas utilizando HPLC MS/MS 7,8. Los métodos descritos en este trabajo solo pueden diferenciar entre mRL y dRL, pero no se pueden utilizar para la caracterización de los congéneres de RL.
P. aeruginosa y algunas especies de Burkholderia son productoras naturales de RL9, pero la primera bacteria es la productora más eficiente. Sin embargo, actualmente se produce RL de uso comercial en derivados de Pseudomonas putida KT2440 que expresan genes de P. aeruginosa para evitar el uso de este patógeno oportunista10,11. La detección y cuantificación de RL producida por P. aeruginosa son de gran importancia para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de rasgos relacionados con la virulencia12, en la caracterización de cepas pertenecientes a los clados 3 o 513, y para la construcción de derivados de P. aeruginosa que sobreproduzcan estos biosurfactantes y tengan una virulencia reducida14. La producción de biosurfactantes por parte de diferentes microorganismos se ha detectado a partir de algunas características generales de estos compuestos, como el método de la gota de colapso o el índice de emulsificación15, pero estos métodos no son precisos ni específicos16.
En este trabajo se describe el protocolo para la detección de mRL y dRL mediante la extracción líquida de RL total a partir de los sobrenadantes de cultivo de diferentes cepas de tipo P. aeruginosa y la separación de ambos tipos de RL mediante TLC. En este método, los RL extraídos del sobrenadante de cultivo se separan por su solubilidad diferencial en los disolventes utilizados para el TLC, lo que provoca una migración diferencial en la placa de gel de sílice. Por lo tanto, los mRL tienen una migración más rápida que los dRL, y se pueden detectar como puntos separados cuando las placas se secan y se tiñen con α-naftol.
El método descrito aquí para la detección de mRL y dRL por TLC se basa en un artículo17 publicado anteriormente, que es fácil de realizar y no requiere equipos costosos. Este método ha sido útil para detectar RL en varios aislados de P. aeruginosa 13 utilizando controles apropiados, como un mutante derivado de P. aeruginosa incapaz de producir RL. Sin embargo, no es el método preferido para caracterizar nuevos biosurfactantes producidos por bacterias distintas de Pseudomonas aeruginosa debido a su falta de especificidad.
Además, se presenta un método para cuantificar los equivalentes de ramnosa de RL total extraído de un sobrenadante de cultivo de P. aeruginosa . Este método cuantifica estos biosurfactantes a partir de la reacción del orcinol con azúcares reductores, dando como resultado un producto que puede medirse espectrofotométricamente a 421 nm, como se ha descrito anteriormente18. Dado que la reacción con orcinol no es específica de la ramnosa, es importante realizar este método con RL extraído del sobrenadante del cultivo que no contenga cantidades significativas de otras moléculas que contengan azúcares, como los lipopolisacáridos (LPS). Aquí se utiliza una mezcla acidificada de cloroformo y metanol para la extracción líquida de RL18, pero también se puede utilizar acetato de etilo, y la extracción en fase sólida (SPE) da muy buenos resultados19. El método de orcinol descrito aquí no requiere equipos sofisticados y puede proporcionar resultados confiables si se realiza con especial cuidado en la preparación de las muestras analizadas, como se discutió. Para garantizar una preparación adecuada de la muestra, es importante incluir un mutante de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapaz de producir RL20 y realizar tres réplicas biológicas y tres técnicas para cada determinación.
Ha existido una importante controversia en la literatura16,21 en relación a la determinación de RL por el método de orcinol, con algunos estudios que sugieren que la producción de RL está sobreestimada y que el ensayo carece de especificidad para la ramnosa, potencialmente detectando otros azúcares. Sin embargo, demostramos aquí que los métodos descritos pueden ser precisos y específicos en las condiciones adecuadas. Además, para la comparación con los procedimientos descritos en este artículo, utilizamos la detección UPLC-MS/MS de un estándar dRL y demostramos que se obtienen resultados similares con el método orcinol. El protocolo detallado para cuantificar el RL utilizando este método se incluye en el Archivo Complementario 1.
Estos protocolos se ejemplifican utilizando las cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) y PA7 (filogrupo 3). Se eligieron estas cepas porque están bien caracterizadas y producen diferentes perfiles de RL.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-NAPHTHOL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>70442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACETIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENTRIFUGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging tubes 1.5 mL and&#160; 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9180-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRYING OVEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHER</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9244-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS PIPETTE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>CLS706510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYDROCHLORIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>5622-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-RHAMNOSE MONOHYDRATE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R-3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METHANOL</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9049-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCINOL MONOHYDRATE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>O1875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGAS Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),&#160; Peptone (1%), pH 7.4&#160;&#160; Autoclaved. Add&#160; Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUARTZ CELL (CUVETTE)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z276669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>K4161801020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHAMNOLIPIDS&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROPHOTOMETER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRAYER</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z529710-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFURIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9681-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES TUBES 5mL</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC SILICA GEL 60 F254</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WATER BATH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#62; 80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of mono-rhamnolipids and di-rhamnolipids produced by pseudomonas aeruginosa

La bacteria ambiental Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista con alta resistencia a los antibióticos que representa un peligro para la salud. Esta bacteria produce altos niveles de biosurfactantes conocidos como ramnolípidos (RL), que son moléculas con un importante valor biotecnológico pero que también se asocian a rasgos de virulencia. En este sentido, la detección y cuantificación de RL puede ser útil tanto para aplicaciones biotecnológicas como para proyectos de investigación biomédica. En este artículo, demostramos paso a paso la técnica para detectar la producción de las dos formas de RL producidas por P. aeruginosa mediante cromatografía en capa fina (TLC): mono-ramnolípidos (mRL), moléculas constituidas por un dímero de ácidos grasos (principalmente C10-C10) unido a una fracción de ramnosa, y di-ramnolípidos (dRL), moléculas constituidas por un dímero de ácido graso similar unido a dos partes de ramnosa. Además, presentamos un método para medir la cantidad total de RL basado en la hidrólisis ácida de estos biosurfactantes extraídos de un sobrenadante de cultivo de P. aeruginosa y la posterior detección de la concentración de ramnosa que reacciona con el orcinol. La combinación de ambas técnicas se puede utilizar para estimar la concentración aproximada de mRL y dRL producida por una cepa específica, como se ejemplifica aquí con las cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) y PA7 (filogrupo 3).

Pseudomonas aeruginosa is an environmental bacterium and an opportunistic pathogen of great concern due to its production of virulence-associated traits and its high antibiotic resistance1,2. A characteristic secondary metabolite produced by this bacterium is the biosurfactant RL, which is produced in a coordinated manner with several virulence-associated traits such as the phenazine pyocyanin, an antibiotic with redox activity, and the protease elastase3. The tensio-active and emulsification properties of RL have been exploited in different industrial applications and are currently commercialized4.
Most P. aeruginosa strains, belonging to phylogroups 1 and 2, produce two types of RL: mRL, which consists of one rhamnose moiety linked to a fatty acid dimer mainly of 10 carbons, and dRL, which contains an additional rhamnose moiety linked to the first rhamnose4 (see Figure 1). However, it has been reported that two minor P. aeruginosa phylogroups (groups 3 and 5) only produce mRL5,6. The two types of RL contain a mixture of fatty acid dimers, which, as mentioned, are mainly C10-C10, but smaller proportions of molecules containing C12-C10, C12-C12, and C10-C12:1 dimers are also produced. The characterization of the RL congeners produced by different strains using HPLC MS/MS has been reported7,8. The methods described in this work can only differentiate between mRL and dRL but cannot be used for the characterization of the RL congeners.
P. aeruginosa and some Burkholderia species are natural producers of RL9, but the former bacterium is the most efficient producer. However, commercially used RL is currently produced in Pseudomonas putida KT2440 derivatives expressing P. aeruginosa genes to avoid the use of this opportunistic pathogen10,11. The detection and quantification of RL produced by P. aeruginosa are of great importance for studying the molecular mechanisms involved in the expression of virulence-related traits12, in the characterization of strains belonging to clades 3 or 513, and for constructing P. aeruginosa derivatives that overproduce these biosurfactants while having reduced virulence14. The production of biosurfactants by different microorganisms has been detected based on some general characteristics of these compounds, such as the collapse drop method or emulsification index15, but these methods are neither accurate nor specific16.
Here, we describe the protocol to detect mRL and dRL using the liquid extraction of total RL from the culture supernatants of different P. aeruginosa-type strains and the separation of both types of RL using TLC. In this method, the RL extracted from the culture supernatant is separated by their differential solubility in the solvents used for TLC, causing differential migration on the silica gel plate. Thus, mRL have a more rapid migration than dRL, and they can be detected as separate spots when the plates are dried and stained with &#945;-naphthol.
The method described here for detecting mRL and dRL by TLC is based on a previously published article17, which is easy to perform and does not require expensive equipment. This method has been useful for detecting RL in various P. aeruginosa isolates13 using appropriate controls, such as a P. aeruginosa-derived mutant unable to produce RL. However, it is not the preferred method for characterizing novel biosurfactants produced by bacteria other than Pseudomonas aeruginosa due to its lack of specificity.
Additionally, a method for quantifying the rhamnose equivalents of total RL extracted from a P. aeruginosa culture supernatant is presented. This method quantifies these biosurfactants based on the reaction of orcinol with reductive sugars, resulting in a product that can be measured spectrophotometrically at 421 nm, as previously described18. Since the reaction with orcinol is not specific to rhamnose, it is important to perform this method with RL extracted from the culture supernatant that does not contain significant amounts of other sugar-containing molecules, such as lipopolysaccharides (LPS). An acidified chloroform/methanol mixture is used here for liquid extraction of RL18, but ethyl acetate can also be used, and solid-phase extraction (SPE) yields very good results19. The orcinol method described here does not require sophisticated equipment and can provide reliable results if performed with special care in preparing the analyzed samples, as discussed. To ensure proper sample preparation, it is important to include a Pseudomonas aeruginosa rhlA mutant unable to produce RL20 and to perform three biological and three technical replicates for each determination.
There has been significant controversy in the literature16,21regarding RL determination by the orcinol method, with some studies suggesting that RL production is overestimated and that the assay lacks specificity for rhamnose, potentially detecting other sugars. However, we demonstrate here that the methods described can be accurate and specific under the appropriate conditions. Furthermore, for comparison with the procedures outlined in this article, we utilize UPLC-MS/MS detection of a dRL standard and demonstrate that similar results are obtained with the orcinol method. The detailed protocol for quantifying RL using this method is included in Supplementary File 1.
These protocols are exemplified using the type strains PAO1 (phylogroup 1), PA14 (phylogroup 2), and PA7 (phylogroup 3). These strains were chosen because they are well-characterized and produce different RL profiles.

Autor destacado: Comprensión de la regulación de ramnolípidos en Pseudomonas aeruginosa

Detección y cuantificación de mono-ramnolípidos y di-ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa

The aim of our research is to understand the regulatory mechanisms involved the expression of the different virulence factors produced by the opportunistic pathogen, Pseudomonas aeruginosa, that include the biosurfactants rhamnolipids. Rhamnolipids are non-toxic and environmental-friendly, and have several biotechnological applications, so they are now in the market. We have reported the rhamnolipids biosynthetic root and the regulation of their expression in different isolates that are atypical, and refractory to alternative therapeutic approaches based on antivirulence strategies.In addition, we have reported the construction of strains that produce high levels of rhamnolipids and are non-virulent. The technique describe, enable the detection and quantification of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. This protocol is accurate and reproducible and do not need expensive equipment.

En este artículo, se utilizaron tres cepas diferentes de P. aeruginosa para representar tres filogrupos, cada uno con diferentes niveles de producción de RL y proporciones de mRL y dRL. Estas cepas incluyen PAO1 (un aislado de herida de Australia, 195522), PA14 (un aislado de planta de los EE. UU., 197723) y PA7 (un aislado clínico de Argentina, 201024). Como control negativo, se empleó el mutante PAO1 rhlA, que es incapaz de producir RL...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Understanding Rhamnolipid Regulation in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Pseudomonas aeruginosa produce los biosurfactantes ramnolípidos. La cromatografía en capa fina detecta y determina la proporción de mono y di-ramnolípidos producidos por cada cepa. La cuantificación de los ramnolípidos totales implica la evaluación de los equivalentes de ramnosa presentes en estos biosurfactantes extraídos de los sobrenadantes de cultivo mediante el método de orcinol.

The environmental bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with high antibiotic resistance that represents a health hazard. This ...

El objetivo de nuestra investigación es comprender los mecanismos reguladores implicados en la expresión de los diferentes factores de virulencia producidos por el patógeno oportunista, Pseudomonas aeruginosa, entre los que se encuentran los biosurfactantes ramnolípidos. Los ramnolípidos no son tóxicos y son respetuosos con el medio ambiente, y tienen varias aplicaciones biotecnológicas, por lo que ahora están en el mercado. Hemos reportado la raíz biosintética de ramnolípidos y la regulación de su expresión en diferentes aislados que son atípicos y refractarios a enfoques terapéuticos alternativos basados en estrategias de antivirulencia.Además, hemos reportado la construcción de cepas que producen altos niveles de ramnolípidos y no son virulentas. La técnica descrita permite la detección y cuantificación de ramnolípidos por Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo es preciso y reproducible y no necesita equipos costosos.

detection-quantification-mono-rhamnolipids-di-rhamnolipids-produced

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection and Quantification of Mono-Rhamnolipids and Di-Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa

722 vistas.  Universidad Nacional Autónoma de México. El objetivo de nuestra investigación es comprender los mecanismos reguladores implicados en la expresión de los diferentes factores de virulencia producidos por el patógeno oportunista, Pseudomonas aeruginosa, entre los que se encuentran los biosurfactantes ramnolípidos. Los ramnolípidos no son tóxicos y son respetuosos con el medio ambiente, y tienen varias aplicaciones biotecnológicas, por lo que ahora están en el mercado. Hemos reportado la raíz biosintética de ramnolípidos y la...

Video: Autor destacado: Comprensión de la regulación de ramnolípidos en Pseudomonas aeruginosa

The environmental bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with high antibiotic resistance that represents a health hazard. This bacterium produces high levels of biosurfactants known as rhamnolipids (RL), which are molecules with significant biotechnological value but are also associated with virulence traits. In this respect, the detection and quantification of RL may be useful for both biotechnology applications and biomedical research projects. In this article, we demonstrate step-by-step the technique to detect the production of the two forms of RL produced by P. aeruginosa using thin-layer chromatography (TLC): mono-rhamnolipids (mRL), molecules constituted by a dimer of fatty acids (mainly C10-C10) linked to one rhamnose moiety, and di-rhamnolipids (dRL), molecules constituted by a similar fatty acid dimer linked to two rhamnose moieties. Additionally, we present a method to measure the total amount of RL based on the acid hydrolysis of these biosurfactants extracted from a P. aeruginosa culture supernatant and the subsequent detection of the concentration of rhamnose that reacts with orcinol. The combination of both techniques can be used to estimate the approximate concentration of mRL and dRL produced by a specific strain, as exemplified here with the type strains PAO1 (phylogroup 1), PA14 (phylogroup 2), and PA7 (phylogroup 3).

Pseudomonas aeruginosa&#160;produces the rhamnolipid biosurfactants. Thin-layer chromatography detects and determines the proportion of mono- and di-rhamnolipids produced by each strain. Quantification of total rhamnolipids involves assessing rhamnose equivalents present in these biosurfactants extracted from the culture supernatants using the orcinol method.

Investigación

Bioquímica

Rhamnolipid Detection in Pseudomonas aeruginosa Supernatants Using TLC

To begin, transfer five milliliters of an acidified culture supernatant of pseudomonas aeruginosa into a 50-milliliter polypropylene tube. Add five milliliters of chloroform methanol mixture into this tube. Invert the tube three times for 30 seconds to agitate and mix the solution.Leave the tube without inversion for two minutes between each agitation. Centrifuge the tube for 10 minutes at 3000 G at four degrees Celsius, then transfer the organic phase into a clean tube. Leave the tube in an extraction hood until it is dried.Next, use a 10-microliter pipette to apply five microliters of the samples onto a TLC plate. To prepare the liquid phase, mix 26 milliliters of chloroform, six milliliters of methanol, and 0.8 milliliters of 20%acetic acid. Place the solvent mix in a closed TLC chamber for at least 10 minutes to saturate it.Transfer the TLC plate into the chamber, avoiding contact with the sample application points. Leave the TLC plate in the closed chamber until the solvent reaches one centimeter before the edge of the plate. At this point, remove the plate and let it dry.To detect the presence of rhamnolipids, spray alpha naphthol solution onto the plate in the extraction hood, then place a sprayed plate in an oven at 85-degrees Celsius for several minutes until the pinkish mark of the rhamnolipid lipid is visible. All three pseudomonas aeruginosa strains produce different amounts of mono and di-rhamnolipids.

Detección de ramnolípidos en sobrenadantes de Pseudomonas aeruginosa mediante TLC

Quantification of Rhamnolipids Present in the Biosurfactant of Pseudomonas aeruginosa

To begin pipette 1.2 milliliters of a 24-hour culture of Pseudomonas aeruginosa into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 3000 G for four degrees Celsius for three minutes. Collect the supernatant in a clean tube.Pipette 333 microliters of the supernatant into a clean tube. Then add one milliliter of ether into the tube. Mix the solution in a vortex for 30 seconds.After all the tubes have been vortexed, centrifuge them at 3000 G at four degrees Celsius for two minutes. Then collect the organic phase and transfer it into a clean tube tube. Place the solution in an extraction hood until it is dried.Next place a clean flask covered with foil paper in ice for five minutes to prepare a 60%sulfuric acid solution. Use this sulfuric acid solution to prepare the orcinol reagent. Add 100 microliters of each Rhamnolipid sample to a glass tube and add 900 microliters of orcinol to the samples.After mixing the solutions together, incubate the sample in a water bath at 80 degrees Celsius for 30 minutes. When the tube cools to room temperature, transfer a sample to a quart cell and place it in the spectrophotometer to read the absorbance at 421 nanometers. The strain PA14 produces the highest amount of rhamnose equivalents while strain PA7 produces the lowest amount.