GSCh 실험실은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM의 보조금 IN201222으로 부분적으로 지원됩니다.

이 절차는 보충 그림 1에 도식화되어 있습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. TLC를 사용한 녹농균(P. aeruginosa)의 배양 상층액에서 mRL 및 dRL 검출
<ol><li>관심 있는 P. aeruginosa 균주의 원심 분리된 육수로 시작하여 액체 배지에서 24시간 동안 배양합니다(RL이 생성되는 고정 성장 단계에 도달하기 위해). 일반적으로 이러한 배양물에는 mL당 1 x 109 개의 박테리아가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>농축된 HCl을 사용하여 배양액의 pH를 2로 조정합니다.</li>
	<li>50mL 폴리프로필렌 튜브에 산성화된 배양 상층액 5mL를 넣고 5mL의 2:1 클로로포름: 메탄올 혼합물을 추가합니다.</li>
	<li>매번 10초 동안 뒤집어서 튜브를 세 번 교반하고 각 교반 사이에 2분 동안 튜브를 반전 없이 그대로 둡니다.</li>
	<li>두 상이 분리될 때까지 약 3시간 동안 튜브를 교반하지 않고 그대로 두거나 4°C에서 3,000 x g 에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.</li>
	<li>유기상(바닥층)을 깨끗한 튜브로 옮기고 건조가 발생할 때까지 튜브를 추출 후드에 그대로 둡니다.</li>
	<li>1.3 단계부터 시작하여 두 번째 클로로포름 : 메탄올 추출의 유기 상을 첫 번째 추출에 사용 된 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>1mL 또는 1.5mL가 남을 때까지 유기상을 증발시킵니다. 이 부피를 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 용매를 밤새 건조시킵니다.</li>
	<li>건조된 튜브에 50μL의 메탄올을 첨가하여 RL을 재현탁시킵니다.</li>
	<li>실리카겔 플레이트에서 박층 크로마토그래피를 수행합니다. 알림: TLC 플레이트의 크기는 분석할 샘플의 수에 따라 절단해야 합니다. 각 샘플은 1.5cm에 적용해야 하며 적용 지점은 플레이트 가장자리에서 1cm 떨어져 있어야 합니다(연필로 수평선 그리기).</li>
	<li>10 μL 마이크로피펫을 사용하여 각 샘플에 5 μL를 적용합니다.</li>
	<li>TLC 액상은 클로로포름: 메탄올: 아세트산의 65:15:2 혼합물로 구성됩니다. 이 혼합물 35mL를 제조하려면 클로로포름 26mL, 메탄올 6mL, 아세트산 20% 원액 0.8mL를 혼합합니다. 이러한 용매를 혼합하고 크로마토그래피를 시작하기 전에 최소 10분 동안 밀폐된 TLC 챔버에 넣어 대기가 휘발성 용매로 포화되도록 합니다.</li>
	<li>샘플이 적용된 지점과의 접촉을 피하고 TLC 플레이트를 챔버에 놓습니다.</li>
	<li>챔버를 닫고 용매가 플레이트 가장자리 1cm 전에 도달할 때까지 TLC를 그대로 둡니다. 이 시점에서 플레이트를 제거하고 건조시키십시오 (공기 흐름을 적용하여 프로세스를 가속화 할 수 있음).</li>
	<li>이 화합물 5g을 에탄올 33mL에 녹여 α-나프톨 용액을 준비합니다. 용해되면 에탄올 127.5mL, 물 12.6mL, 차가운 H2SO4 20.5mL를 첨가합니다.</li>
	<li>mRL 및 dRL의 존재를 감지하려면 추출 후드의 플레이트에 α-나프톨 용액을 분무하고 RL의 분홍빛이 도는 표시가 분명해질 때까지 분무된 플레이트를 85°C의 오븐에 몇 분 동안 넣습니다.</li>
	<li>TLC의 그림을 사용하여 각 스폿의 밀도를 감지하는 소프트웨어를 사용하여 각 샘플에 존재하는 mono- 및 di-RL의 비율을 계산합니다.</li>
</ol>2. 생물 계면활성제에 존재하는 람노스 등가물을 측정하는 RL의 총량 정량화
<ol><li>1.2mL의 고정상 배양액(24시간 동안 성장)을 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 4°C에서 3,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 깨끗한 튜브에 상층액을 수집합니다.</li>
	<li>333μL를 깨끗한 튜브에 옮기고(이 단계를 3번 수행) 1mL의 에테르를 추가합니다.</li>
	<li>30초 동안 소용돌이에서 격렬하게 섞습니다. 한 번에 하나의 튜브로 이 절차를 반복합니다.</li>
	<li>4 °C에서 3,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 유기상(상부)을 채취하여 깨끗한 튜브에 옮기고 건조가 발생할 때까지 추출 후드에 열어 둡니다.</li>
	<li>2.2단계에서 설명한 대로 에테르로 추출을 반복합니다. 2.3단계와 2.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>완전히 건조되면 각 튜브에 1mL의 물을 추가합니다. RL이 수화될 수 있도록 튜브를 12시간 동안 그대로 둔 다음 소용돌이에서 격렬하게 교반합니다.</li>
	<li>깨끗한 플라스크를 얼음에 5분 동안 넣습니다(발열 반응이므로). 60 % H2SO4 (플라스크를 빛으로부터 보호)의 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>깨끗한 튜브에 증류수에 1.6% 오르시놀 용액을 준비합니다. 오르시놀 시약을 준비하려면 4.4 % H2SO4 용액 40 mL와 1.6 % 오르시놀 용액 0.6 mL를 섞는다.</li>
	<li>필요한 오르시놀 시약의 최종 부피를 계산합니다. 이 시약 900 μL를 각 샘플과 보정 곡선의 각 농도에 첨가하고, 서로 다른 람노스 농도(일반적으로 9 농도의 람노스는 1 μg/mL에서 9 μg/mL 범위에서 사용됨)를 사용하고, 1 농도는 100 μL의 물과 함께 추가하여 모든 것이 삼중으로 수행되도록 합니다.</li>
	<li>유리관에 있는 오르시놀 시약 900μL에 각 RL 샘플 100μL를 추가하고 두 용액을 혼합합니다.</li>
	<li>80 °C로 예열된 수조에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브를 실온으로 식히십시오.</li>
	<li>quartz cell을 사용하여 421nm에서 샘플의 흡광도와 보정 곡선을 판독합니다.</li>
	<li>보정 곡선에서 흡광도를 보간하고 측정에 사용된 부피를 고려하여 각 샘플의 람노스 농도를 계산합니다.</li>
	<li>μM 농도를 계산하려면 μg/mL 단위로 얻은 농도를 182.2(람노스의 분자량)로 나누고 1000을 곱합니다.</li>
</ol>

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주에서 람놀리피드 생산 비교 분석

<ol>
	<li>Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+lifestyle:+A+paradigm+for+adaptation,+survival,+and+persistence.">Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence.</a> Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).</li><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. 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P., Cocotl-Ya&#241;ez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+produced+by+Pseudomonas:+From+molecular+genetics+to+the+market.">Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market.</a> Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).</li><li>Freschi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+pan-genome+provides+new+insights+on+its+population+structure,+horizontal+gene+transfer,+and+pathogenicity.">The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).</li><li>Quiroz-Morales, S. E., Garc&#237;a-Reyes, S., Ponce-Soto, G. 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M., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids:+Diversity+of+structures,+microbial+origins,+and+roles.">Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).</li><li>Toribio, J., Escalante, A. 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Foundations and Frontiers in Enzymology. , 157-181 (2023).</li><li>Noll, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+for+sustainable+biosurfactant+production:+Techno-economic+and+environmental+assessment+of+a+rhamnolipid+production+process.">Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process.</a> Bioresource Technology. 25, 101767 (2024).</li><li>Garc&#237;a-Reyes, S., Cocotl-Ya&#241;ez, M., Gonz&#225;lez-Valdez, A., Serv&#237;n-Gonz&#225;lez, L., Sober&#243;n Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PqsR-independent+quorum-sensing+response+of+Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+outlier-strain+reveals+new+insights+on+the+PqsE+effect+on+RhlR+activity.">The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity.</a> Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).</li><li>Grosso-Becerra, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+ATCC+9027+is+a+non-virulent+strain+suitable+for+mono-rhamnolipids+production.">Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).</li><li>Guti&#233;rrez-G&#243;mez, U., Soto-Aceves, M. P., Serv&#237;n-Gonz&#225;lez, L., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+of+rhamnolipids+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+by+redirection+of+the+carbon+flux+from+polyhydroxyalcanoate+synthesis+and+overexpression+of+the+rhlAB-R+operon.">Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon.</a> Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).</li><li>Zibek, S., Sober&#243;n-Ch&#225;vez, G., Hausmann, R., Henkel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+on+glycosylated+lipids+produced+by+bacteria+and+fungi:+Rhamno-,+Sophoro-,+Mannosylerythritol+and+Cellobiose+Lipids.">Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids.</a> Biosurfactants for a Biobased. 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M., Hayen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rhamnolipids+by+liquid+chromatography/mass+spectrometry+after+solid-phase+extraction.">Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction.</a> Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).</li><li>Rahim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+rhlC+gene+that+encodes+rhamnosyltransferase+2,+an+enzyme+responsible+for+di-rhamnolipid+biosynthesis.">Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis.</a> Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).</li><li>Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+rhamnolipid+production:+A+critical+re-evaluation+of+published+data+and+suggested+future+publication+criteria.">Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).</li><li>Holloway, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Recombination+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).</li><li>Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+investigaction+into+the+origin+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA14-old+but+not+lost.">Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost.</a> Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).</li><li>Roy, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+multiresistant+taxonomic+outlier+Pseudomonas+aeruginosa+PA7.">Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7.</a> PLoS ONE. 5, e8842 (2010).</li><li>Zhang, Y., Miller, R. 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M., L&#233;pine, F., D&#233;ziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/mass+spectrometry+for+the+identification+and+quantification+of+rhamnolipids.">Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids.</a> Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).</li><li>Lee, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+reveals+that+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+is+combinatorial.">Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial.</a> Genome Biology. 7 (10), 90 (2006).</li><li>Kubicki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+assay+for+screening+and+quantification+of+biosurfactants+in+microbial+culture+supernatants.">A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958 (2020).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

RL을 검출하고 정량화하는 가장 정확한 방법은 질량 분석법(MS)7,8,27과 결합된 HPLC입니다. 그러나 많은 연구자가 접근하기 어려울 수 있는 전문적이고 값비싼 장비가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 RL 농도를 검출하고 추정하기 위해 기본 실험실 재료 및 장비를 사용하여 일상적으로 수행할 수 있지만, 몇 가지 제한 사항, 특?...

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 환경 박테리아이며 독성 관련 형질의 생성과 높은 항생제 내성으로 인해 큰 우려가 있는 기회 감염 병원체입니다 1,2. 이 박테리아에 의해 생성되는 특징적인 2차 대사 산물은 생물 계면활성제 RL이며, 이는 산화 환원 활성을 가진 항생제인 페나진 피오시아닌(phenazine pyocyanin) 및 프로테아제 엘라스타제3와 같은 여러 독성 관련 특성과 조화롭게 생산됩니다. RL의 텐시오 활성 및 유화 특성은 다양한 산업 응용 분야에서 활용되었으며 현재 상용화되어 있습니다4.
계통군 1 및 2에 속하는 대부분의 녹농균 균주는 두 가지 유형의 RL을 생성한다: 주로 10개의 탄소로 구성된 지방산 이량체에 연결된 하나의 람노스 부분으로 구성된 mRL과 첫 번째 람노스4에 연결된 추가적인 람노스 부분을 포함하는 dRL. 그러나 두 개의 작은 녹농균 계통군(그룹 3 및 5)은 mRL 5,6만 생성하는 것으로 보고되었습니다. RL의 두 가지 유형은 언급한 바와 같이 주로 C10-C10인 지방산 이량체의 혼합물을 포함하지만 C12-C10, C12-C12 및 C10-C12:1 이량체를 포함하는 분자의 더 작은 비율도 생성됩니다. HPLC MS/MS를 사용하여 다양한 균주에 의해 생성된 RL 동족체의 특성화가 보고되었습니다 7,8. 이 연구에서 기술된 방법은 mRL과 dRL만 구별할 수 있을 뿐 RL 동족체의 특성 분석에는 사용할 수 없습니다.
녹농균(P. aeruginosa)과 일부 버크홀데리아(Burkholderia) 종은 RL9의 자연 생산자이지만, 이전의 박테리아가 가장 효율적인 생산자입니다. 그러나, 상업적으로 사용되는 RL은 현재 이러한 기회주의적 병원체의 사용을 피하기 위해 녹농균 유전자를 발현하는 슈도모나스 푸티다 KT2440 유도체에서 생산되고 있다(10,11). 녹농균(P. aeruginosa)에 의해 생성된 RL의 검출 및 정량화는 독성 관련 형질(12)의 발현에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하고, 군(clade) 3 또는 5에 속하는 균주의 특성 분석(13)하며, 독성을 감소시키면서 이러한 생물계면활성제를 과도하게 생산하는 녹농균 유도체(P. aeruginosa derivatives)를 구성하는 데 매우 중요하다14. 다양한 미생물에 의한 생물 계면 활성제의 생산은 붕괴 방울 방법 또는 유화 지수15와 같은 이러한 화합물의 일부 일반적인 특성에 기초하여 검출되었지만, 이러한 방법은 정확하지도 않고 특이적이지도 않다16.
여기에서는 다양한 녹농균 유형 균주의 배양 상층액에서 총 RL을 액체 추출하고 TLC를 사용하여 두 유형의 RL을 분리하여 mRL 및 dRL을 검출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서는 배양 상층액에서 추출한 RL을 TLC에 사용되는 용매의 용해도에 따른 차등 용해도에 의해 분리하여 실리카겔 플레이트에서 차등 이동을 일으킵니다. 따라서 mRL은 dRL보다 더 빠른 이동을 가지며 플레이트를 건조하고 α-나프톨로 염색할 때 별도의 반점으로 검출될 수 있습니다.
TLC에 의한 mRL 및 dRL을 검출하기 위해 여기에 설명된 방법은 이전에 발표된 논문17을 기반으로 하며, 이는 수행하기 쉽고 고가의 장비를 필요로 하지 않는다. 이 방법은 RL을 생산할 수 없는 P. aeruginosa-유래 돌연변이와 같은 적절한 대조군을 사용하여 다양한 P. aeruginosa 분리체(13)에서 RL을 검출하는 데 유용하다. 그러나, 이는 특이성이 부족하기 때문에 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 이외의 박테리아에 의해 생성되는 새로운 생물 계면활성제를 특성화하는 데 선호되는 방법은 아닙니다.
또한, 녹농균 배양 상층액에서 추출한 총 RL의 람노스 등가물을 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 오르시놀과 환원당의 반응에 기초하여 이러한 생물계면활성제를 정량화하며, 그 결과 앞서 설명한 바와 같이 421nm에서 분광광도계로 측정할 수 있는 생성물이 생성된다18. 오르시놀과의 반응은 람노스에 특이적이지 않기 때문에, 리포다당류(LPS)와 같은 다른 당 함유 분자를 상당량 함유하지 않는 배양 상청액에서 추출한 RL로 이 방법을 수행하는 것이 중요합니다. 산성화된 클로로포름/메탄올 혼합물은 RL18의 액체 추출을 위해 여기에 사용되지만, 에틸 아세테이트도 사용할 수 있으며, 고체상 추출(SPE)은 매우 우수한 결과를 산출한다19. 여기에 설명된 오르시놀 방법은 정교한 장비를 필요로 하지 않으며, 논의된 바와 같이 분석된 샘플을 준비할 때 특별한 주의를 기울여 수행할 경우 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있습니다. 적절한 시료 전처리를 위해서는 RL20을 생성할 수 없는 녹농균 rhlA 돌연변이를 포함하고 각 측정에 대해 3번의 생물학적 복제와 3번의 기술적 복제를 수행하는 것이 중요합니다.
문헌16,21에서 오르시놀 방법에 의한 RL 측정과 관련하여 상당한 논란이 있었으며, 일부 연구에서는 RL 생산이 과대평가되고 분석법이 람노스에 대한 특이성이 부족하여 잠재적으로 다른 당을 검출할 수 있다고 제안했습니다. 그러나 여기에서 설명된 방법이 적절한 조건에서 정확하고 구체적일 수 있음을 보여줍니다. 또한 이 기사에 설명된 절차와 비교하기 위해 dRL 표준물질의 UPLC-MS/MS 검출을 활용하고 orcinol 분석법으로도 유사한 결과를 얻을 수 있음을 입증합니다. 이 방법을 사용하여 RL을 정량화하기 위한 자세한 프로토콜은 보충 파일 1에 포함되어 있습니다.
이들 프로토콜은 유형 균주 PAO1(계통군 1), PA14(계통군 2) 및 PA7(계통군 3)을 사용하여 예시된다. 이러한 균주는 특성이 잘 규명되고 다양한 RL 프로필을 생성하기 때문에 선택되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-NAPHTHOL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>70442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACETIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENTRIFUGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging tubes 1.5 mL and&#160; 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9180-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRYING OVEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHER</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9244-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLASS PIPETTE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>CLS706510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYDROCHLORIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>5622-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-RHAMNOSE MONOHYDRATE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R-3875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METHANOL</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9049-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCINOL MONOHYDRATE</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>O1875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPGAS Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),&#160; Peptone (1%), pH 7.4&#160;&#160; Autoclaved. Add&#160; Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUARTZ CELL (CUVETTE)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z276669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>K4161801020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RHAMNOLIPIDS&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROPHOTOMETER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>VIS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRAYER</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z529710-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFURIC ACID</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9681-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES TUBES 5mL</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC SILICA GEL 60 F254</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WATER BATH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#62; 80 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and quantification of mono-rhamnolipids and di-rhamnolipids produced by pseudomonas aeruginosa

환경 박테리아 녹농균(Pseudomonas aeruginosa )은 항생제 내성이 높아 건강에 위험을 초래하는 기회 감염 병원체입니다. 이 박테리아는 람놀라이피드(RL)로 알려진 생물 계면활성제를 고농도로 생성하는데, 이 계면활성제는 생명공학적 가치가 있는 분자이지만 독성 특성과도 관련이 있습니다. 이러한 점에서, RL의 검출 및 정량화는 생명공학 응용 분야와 생물 의학 연구 프로젝트 모두에 유용할 수 있습니다. 이 기사에서는 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 녹농균에 의해 생성되는 두 가지 형태의 RL의 생성을 검출하는 기술을 단계별로 보여줍니다: 단일 람인지질(mRL), 하나의 람노스 부분에 연결된 지방산 이량체(주로 C10-C10)로 구성된 분자 및 두 개의 람노스 부분에 연결된 유사한 지방산 이량체로 구성된 분자인 디-람놀리피드(dRL). 또한, 녹농 균 배양 상층액에서 추출한 이러한 생물계면활성제의 산 가수분해와 오르시놀과 반응하는 람노스 농도의 후속 검출을 기반으로 RL의 총량을 측정하는 방법을 제시합니다. 두 기법의 조합은 유형 균주 PAO1(계통군 1), PA14(계통군 2) 및 PA7(계통군 3)과 함께 여기에 예시된 바와 같이 특정 균주에 의해 생성된 mRL 및 dRL의 대략적인 농도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.

Pseudomonas aeruginosa is an environmental bacterium and an opportunistic pathogen of great concern due to its production of virulence-associated traits and its high antibiotic resistance1,2. A characteristic secondary metabolite produced by this bacterium is the biosurfactant RL, which is produced in a coordinated manner with several virulence-associated traits such as the phenazine pyocyanin, an antibiotic with redox activity, and the protease elastase3. The tensio-active and emulsification properties of RL have been exploited in different industrial applications and are currently commercialized4.
Most P. aeruginosa strains, belonging to phylogroups 1 and 2, produce two types of RL: mRL, which consists of one rhamnose moiety linked to a fatty acid dimer mainly of 10 carbons, and dRL, which contains an additional rhamnose moiety linked to the first rhamnose4 (see Figure 1). However, it has been reported that two minor P. aeruginosa phylogroups (groups 3 and 5) only produce mRL5,6. The two types of RL contain a mixture of fatty acid dimers, which, as mentioned, are mainly C10-C10, but smaller proportions of molecules containing C12-C10, C12-C12, and C10-C12:1 dimers are also produced. The characterization of the RL congeners produced by different strains using HPLC MS/MS has been reported7,8. The methods described in this work can only differentiate between mRL and dRL but cannot be used for the characterization of the RL congeners.
P. aeruginosa and some Burkholderia species are natural producers of RL9, but the former bacterium is the most efficient producer. However, commercially used RL is currently produced in Pseudomonas putida KT2440 derivatives expressing P. aeruginosa genes to avoid the use of this opportunistic pathogen10,11. The detection and quantification of RL produced by P. aeruginosa are of great importance for studying the molecular mechanisms involved in the expression of virulence-related traits12, in the characterization of strains belonging to clades 3 or 513, and for constructing P. aeruginosa derivatives that overproduce these biosurfactants while having reduced virulence14. The production of biosurfactants by different microorganisms has been detected based on some general characteristics of these compounds, such as the collapse drop method or emulsification index15, but these methods are neither accurate nor specific16.
Here, we describe the protocol to detect mRL and dRL using the liquid extraction of total RL from the culture supernatants of different P. aeruginosa-type strains and the separation of both types of RL using TLC. In this method, the RL extracted from the culture supernatant is separated by their differential solubility in the solvents used for TLC, causing differential migration on the silica gel plate. Thus, mRL have a more rapid migration than dRL, and they can be detected as separate spots when the plates are dried and stained with &#945;-naphthol.
The method described here for detecting mRL and dRL by TLC is based on a previously published article17, which is easy to perform and does not require expensive equipment. This method has been useful for detecting RL in various P. aeruginosa isolates13 using appropriate controls, such as a P. aeruginosa-derived mutant unable to produce RL. However, it is not the preferred method for characterizing novel biosurfactants produced by bacteria other than Pseudomonas aeruginosa due to its lack of specificity.
Additionally, a method for quantifying the rhamnose equivalents of total RL extracted from a P. aeruginosa culture supernatant is presented. This method quantifies these biosurfactants based on the reaction of orcinol with reductive sugars, resulting in a product that can be measured spectrophotometrically at 421 nm, as previously described18. Since the reaction with orcinol is not specific to rhamnose, it is important to perform this method with RL extracted from the culture supernatant that does not contain significant amounts of other sugar-containing molecules, such as lipopolysaccharides (LPS). An acidified chloroform/methanol mixture is used here for liquid extraction of RL18, but ethyl acetate can also be used, and solid-phase extraction (SPE) yields very good results19. The orcinol method described here does not require sophisticated equipment and can provide reliable results if performed with special care in preparing the analyzed samples, as discussed. To ensure proper sample preparation, it is important to include a Pseudomonas aeruginosa rhlA mutant unable to produce RL20 and to perform three biological and three technical replicates for each determination.
There has been significant controversy in the literature16,21regarding RL determination by the orcinol method, with some studies suggesting that RL production is overestimated and that the assay lacks specificity for rhamnose, potentially detecting other sugars. However, we demonstrate here that the methods described can be accurate and specific under the appropriate conditions. Furthermore, for comparison with the procedures outlined in this article, we utilize UPLC-MS/MS detection of a dRL standard and demonstrate that similar results are obtained with the orcinol method. The detailed protocol for quantifying RL using this method is included in Supplementary File 1.
These protocols are exemplified using the type strains PAO1 (phylogroup 1), PA14 (phylogroup 2), and PA7 (phylogroup 3). These strains were chosen because they are well-characterized and produce different RL profiles.

저자 스포트라이트: 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 람인지질 조절 이해

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 생산된 Mono-Rhamnolipids 및 Di-Rhamnolipids의 검출 및 정량화

The aim of our research is to understand the regulatory mechanisms involved the expression of the different virulence factors produced by the opportunistic pathogen, Pseudomonas aeruginosa, that include the biosurfactants rhamnolipids. Rhamnolipids are non-toxic and environmental-friendly, and have several biotechnological applications, so they are now in the market. We have reported the rhamnolipids biosynthetic root and the regulation of their expression in different isolates that are atypical, and refractory to alternative therapeutic approaches based on antivirulence strategies.In addition, we have reported the construction of strains that produce high levels of rhamnolipids and are non-virulent. The technique describe, enable the detection and quantification of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa. This protocol is accurate and reproducible and do not need expensive equipment.

이 논문에서는 3개의 서로 다른 P. aeruginosa 유형 균주를 사용하여 각각 다양한 RL 생산 수준과 mRL 및 dRL의 비율을 가진 3개의 계통군을 표현했습니다. 이러한 균주에는 PAO1(호주에서 분리한 상처, 195522), PA14(미국에서 분리한 식물, 197723) 및 PA7(아르헨티나에서 임상적으로 분리한 것, 201024)이 포함된다. 음성 대조군으로는 RL 생산이 불가능한 PAO1 <em...

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녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 람놀리피드 생물 계면활성제를 생산합니다. 박층 크로마토그래피는 각 균주에 의해 생성된 mono- rhamnolipid와 di-rhamnolipid의 비율을 검출하고 측정합니다. 총 람놀리피드의 정량화에는 오르시놀 방법을 사용하여 배양 상층액에서 추출한 이러한 생물계면활성제에 존재하는 람노스 등가물을 평가하는 것이 포함됩니다.

The environmental bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with high antibiotic resistance that represents a health hazard. This ...

우리 연구의 목적은 생물 계면 활성제 람놀리피드를 포함하는 기회 병원체인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 생성되는 다양한 독성 인자의 발현과 관련된 조절 메커니즘을 이해하는 것입니다. Rhamnolipids는 무독성이며 환경 친화적이며 여러 생명 공학 응용 분야가 있으므로 현재 시장에 나와 있습니다. 우리는 람놀리피드 생합성 뿌리와 항바이러스성 전략에 기반한 대체 치료 접근법에 불응하는 비정형적이고 다양한 분리물에서의 발현 조절을 보고했습니다.또한, 우리는 높은 수준의 람놀리피드를 생산하고 독성이 없는 균주의 구성을 보고했습니다. 이 기술은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 람놀리피드(rhamnolipids)의 검출 및 정량화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 정확하고 재현 가능하며 값비싼 장비가 필요하지 않습니다.

detection-quantification-mono-rhamnolipids-di-rhamnolipids-produced

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection and Quantification of Mono-Rhamnolipids and Di-Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa

722 조회수.  Universidad Nacional Autónoma de México. 우리 연구의 목적은 생물 계면 활성제 람놀리피드를 포함하는 기회 병원체인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 생성되는 다양한 독성 인자의 발현과 관련된 조절 메커니즘을 이해하는 것입니다. Rhamnolipids는 무독성이며 환경 친화적이며 여러 생명 공학 응용 분야가 있으므로 현재 시장에 나와 있습니다. 우리는 람놀리피드 생합성 뿌리와 항바이러스성 전략에 기반한 대체 치?...

비디오: 저자 스포트라이트: 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 람인지질 조절 이해

The environmental bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen with high antibiotic resistance that represents a health hazard. This bacterium produces high levels of biosurfactants known as rhamnolipids (RL), which are molecules with significant biotechnological value but are also associated with virulence traits. In this respect, the detection and quantification of RL may be useful for both biotechnology applications and biomedical research projects. In this article, we demonstrate step-by-step the technique to detect the production of the two forms of RL produced by P. aeruginosa using thin-layer chromatography (TLC): mono-rhamnolipids (mRL), molecules constituted by a dimer of fatty acids (mainly C10-C10) linked to one rhamnose moiety, and di-rhamnolipids (dRL), molecules constituted by a similar fatty acid dimer linked to two rhamnose moieties. Additionally, we present a method to measure the total amount of RL based on the acid hydrolysis of these biosurfactants extracted from a P. aeruginosa culture supernatant and the subsequent detection of the concentration of rhamnose that reacts with orcinol. The combination of both techniques can be used to estimate the approximate concentration of mRL and dRL produced by a specific strain, as exemplified here with the type strains PAO1 (phylogroup 1), PA14 (phylogroup 2), and PA7 (phylogroup 3).

Pseudomonas aeruginosa&#160;produces the rhamnolipid biosurfactants. Thin-layer chromatography detects and determines the proportion of mono- and di-rhamnolipids produced by each strain. Quantification of total rhamnolipids involves assessing rhamnose equivalents present in these biosurfactants extracted from the culture supernatants using the orcinol method.

연구

생화학

Rhamnolipid Detection in Pseudomonas aeruginosa Supernatants Using TLC

To begin, transfer five milliliters of an acidified culture supernatant of pseudomonas aeruginosa into a 50-milliliter polypropylene tube. Add five milliliters of chloroform methanol mixture into this tube. Invert the tube three times for 30 seconds to agitate and mix the solution.Leave the tube without inversion for two minutes between each agitation. Centrifuge the tube for 10 minutes at 3000 G at four degrees Celsius, then transfer the organic phase into a clean tube. Leave the tube in an extraction hood until it is dried.Next, use a 10-microliter pipette to apply five microliters of the samples onto a TLC plate. To prepare the liquid phase, mix 26 milliliters of chloroform, six milliliters of methanol, and 0.8 milliliters of 20%acetic acid. Place the solvent mix in a closed TLC chamber for at least 10 minutes to saturate it.Transfer the TLC plate into the chamber, avoiding contact with the sample application points. Leave the TLC plate in the closed chamber until the solvent reaches one centimeter before the edge of the plate. At this point, remove the plate and let it dry.To detect the presence of rhamnolipids, spray alpha naphthol solution onto the plate in the extraction hood, then place a sprayed plate in an oven at 85-degrees Celsius for several minutes until the pinkish mark of the rhamnolipid lipid is visible. All three pseudomonas aeruginosa strains produce different amounts of mono and di-rhamnolipids.

TLC를 사용한 녹농균 상층액의 Rhamnolipid 검출

Quantification of Rhamnolipids Present in the Biosurfactant of Pseudomonas aeruginosa

To begin pipette 1.2 milliliters of a 24-hour culture of Pseudomonas aeruginosa into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 3000 G for four degrees Celsius for three minutes. Collect the supernatant in a clean tube.Pipette 333 microliters of the supernatant into a clean tube. Then add one milliliter of ether into the tube. Mix the solution in a vortex for 30 seconds.After all the tubes have been vortexed, centrifuge them at 3000 G at four degrees Celsius for two minutes. Then collect the organic phase and transfer it into a clean tube tube. Place the solution in an extraction hood until it is dried.Next place a clean flask covered with foil paper in ice for five minutes to prepare a 60%sulfuric acid solution. Use this sulfuric acid solution to prepare the orcinol reagent. Add 100 microliters of each Rhamnolipid sample to a glass tube and add 900 microliters of orcinol to the samples.After mixing the solutions together, incubate the sample in a water bath at 80 degrees Celsius for 30 minutes. When the tube cools to room temperature, transfer a sample to a quart cell and place it in the spectrophotometer to read the absorbance at 421 nanometers. The strain PA14 produces the highest amount of rhamnose equivalents while strain PA7 produces the lowest amount.