La variante de colonia pequeña o técnica SCV permite la selección y el crecimiento de pequeñas variantes de colonias de Pseudomonas aeruginosa. El método es muy definitivo y permite una selección más fácil que los métodos normales. Este protocolo también detalla un método ELISA más seguro y sensible para la cuantificación de alginatos en comparación con el método estándar de carbazole de ácido urónico, lo que permite la cuantificación directa del alginato en muestras sin cautela ni manipulación de muestras.
Demostrando el procedimiento estarán Brandon Kirby, un técnico de laboratorio, y Roy Al Ahmar, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para detectar la variante de colonia pequeña o SCV, primero raya la cepa P.aeruginosa PAO1 delta PYRD en placas PIA precalejadas. Crecer las cepas a 37 grados Celsius durante 48 horas.
En la placa de crecimiento, identifique un aislado de una sola colonia que tenga el fenotipo SCV caracterizado por un tamaño de colonia de uno a tres milímetros en comparación con el tamaño normal de colonia de tres a cinco milímetros. Vuelva a rayar las colonias seleccionadas para obtener un aislado puro del SCV. Para realizar la activación fisiológica de la vía de salvamento, utilice un bucle de inoculación estéril para recoger la colonia SCV de la placa PIA.
Rayar la colonia seleccionada en una placa PIA precalentada complementada con 0,1 uracilo mililolar. Haga crecer la placa a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Para comenzar el ensayo de carbazole de ácido urónico, identifique una sola colonia de un cultivo puro de la cepa deseada para ser probada y elija la colonia usando un palillo de dientes estéril.
Coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga cinco mililitros de PIB. Crecer en una incubadora de coctelera a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, agregue una alícuota del caldo PIB cultivado en una placa de PIA precalemada.
Usando un esparcidor celular estéril, esparza el caldo sobre el plato y crece a 37 grados Celsius durante 24 horas. Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 mililitros, agregue 0.85%cloruro de sodio al césped adulto y recoja la muestra raspando la placa usando un esparcidor celular. Aspirar la muestra con una pipeta fresca de 50 mililitros y transferir en un tubo de recogida de 50 mililitros.
Vórtice la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo. Para medir el OD600 de las muestras, primero en blanco el espectrofotómetro utilizando un mililitro de cloruro de sodio al 0,85%. A continuación, agregue un mililitro de la muestra a una nueva cubeta desechable y lea la OD. Repita este paso dos veces para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.
Ahora agregue tres mililitros de la solución de borato de ácido sulfúrico en tubos de cultivo y deje reposar sobre hielo. Añadir 350 microlitros de la muestra recogida lentamente a la mezcla de ácido en los tubos de ensayo. Después de vórtices brevemente en bajo, añadir 100 microlitros de 0.1%carbazole y solución de etanol a la mezcla de muestra ácida.
Tapa el tubo y el vórtice en el ajuste medio durante cinco segundos. A continuación, colocar en un baño seco a 55 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, vórtice los tubos brevemente en alto y dejar enfriar durante cinco minutos.
Utilice el tubo con cloruro de sodio al 0,85% en blanco para el espectrofotómetro. A continuación, añada un mililitro de la mezcla a una cubeta limpia y lea la OD de las muestras a 530 nanómetros en un espectrofotómetro. Preparar una curva estándar midiendo el OD530 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido d-mannurónico.
Repita dos veces y extraiga una ecuación lineal de estas lecturas. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600. Con una micropipeta, agregue 50 microlitros de la muestra recogida a una placa de 96 pozos sin tratar.
A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de recubrimiento ELISA a los pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos horas. Con una botella de chorro, lave los pozos de la placa dos veces con PBS-T llenando los pozos y luego drenando el plato volteando la placa.
Añadir 200 microlitros de tampón de bloqueo a los pozos con una micropipeta e incubar a cuatro grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave el plato dos veces con PBS-T como antes. A continuación, agregue 100 microlitros de anticuerpo primario diluido a los pozos e incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas.
Después de la incubación, lave los pozos de la placa tres veces con PBS-T como antes. A continuación, añadir 100 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos a los pozos e incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Después de lavar la placa de nuevo tres veces, utilice una micropipeta para añadir 100 microlitros de solución TMB ELISA.
Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad colocando la placa en un cajón o envolviendo en papel de aluminio. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de parada. Utilice un lector de placas para medir el diámetro de propiedad a 450 nanómetros.
Produzca una curva estándar midiendo el OD450 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido d-mannurónico. Repita las mediciones dos veces y extraiga una ecuación lineal. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.
Aquí se muestran muestras de PAO581 y PAO581 con mutaciones en genes que regulan la pirimidina de novo biosíntesis cultivada en PIA y PIA complementadas con 0,1 milimolar de uracilo. Los datos muestran que la presencia de uracilo en los medios de comunicación da lugar a la conversión de la cepa mutante de nuevo a mucoidy como se ve en la producción de alginato restaurado. Aquí, se muestran los resultados de la ELISA basada en anticuerpos monoclonales antialginato.
Las colonias se cultivan en placas PIA con arabinosa para la inducción del promotor PBAD y el plásmido pHERD-20T. Se muestran PAO1, PAO1 que llevan la expresión plásmido pHERD-20T con el principal factor sigma específico de alginato algU, y PAO1 con una eliminación en el marco del gen algD en la codificación de la enzima biosintética de alginato clave GDP-mannosa deshidrogenasa. Estos datos comparan los niveles no mucoide de alginato medidos para PAO1 y PAO1 delta algD con los niveles mucoide de alginato medidos para PAO1 con pHERD-20T algU.
ElISA antialginato también se probó en muestras de esputo del paciente sin crecimiento previo en placas. Tres muestras de esputo de CF que tuvieron crecimiento de mucoide P.aeruginosa mostraron alginato detectable en comparación con dos muestras de esputo paciente que contenían un crecimiento no mucoide P.aeruginosa o ningún crecimiento de P.aeruginosa. La preparación de las curvas estándar para la cuantificación del alginato es muy crucial, ya que esto permitirá una medición precisa y precisa del alginato dentro de la muestra.
La solución ácida utilizada en el método de carbazole es muy peligrosa, por lo que se deben utilizar equipos de protección personal adecuados y precauciones para garantizar la seguridad. Después de aislar los SGV, se pueden hacer más perfiles genéticos para comprender mejor las mutaciones que ocurren y la patogenicidad asociada con tales mutaciones. El método ELISA se puede adaptar para controlar la infección pulmonar crónica en pacientes con fibrosis quística.
Además, nuestro método de crecimiento podría ayudar a diagnosticar infecciones causadas por SCVs específicos.
