El estudio actual fue financiado por "Estudio sobre los problemas clave del efecto curativo de Koumiss en las enfermedades regionales de la medicina mongola" en el proyecto apoyado en 2018 del programa de ciencia y tecnología del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Región Autónoma de Mongolia Interior.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Cultivo celular
<ol><li>Cultivo de células HepG2 en matraces de cultivo que contienen el medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS], 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). Mantener los matraces de cultivo a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 .</li>
</ol>2. Efecto del ácido oleico en la viabilidad celular medido por el kit de recuento celular-8
<ol><li>Disolver un volumen específico de OA en dimetilsulfóxido (DMSO) para lograr una concentración de 200 mM. Almacene la solución a -20 °C para su uso futuro.</li>
	<li>Siembre células HepG2 en una placa de 96 pocillos con una densidad celular de 6 × 103 celdas por pocillo. Agregue 100 μL de DMEM a cada pocillo. Incubar y cultivar las células a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2 durante 24 h. Divida las células HepG2 en dos grupos:<ol><li>Grupo de control: añadir medio de cultivo celular.</li>
		<li>Grupo OA: añadir OA al medio de cultivo celular para alcanzar concentraciones finales de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de 24 h de incubación inicial, desechar el sobrenadante de cada pocillo y agregar OA de acuerdo con el grupo especificado, agregando 100 μL por pocillo. Para el grupo de control, agregue 100 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo. Continúe incubando las células durante otras 24 h. NOTA: Asegúrese de que cada grupo tenga seis pozos replicados. Para evitar la evaporación, agregue 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al anillo exterior de los pocillos en la placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Después de 24 h de incubación, agregue 10 μL de kit de conteo de células-8 (CCK-8) a cada pocillo, mezcle suavemente e incube durante 2 h en la oscuridad. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora, colóquela en el lector de microplacas y mida el valor de absorbancia a 450 nm (A450). Los valores de IG50 se contabilizaron según el DO.</li>
</ol>3. Tinción de aceite rojo O para observar la formación de gotas de lípidos intracelulares
<ol><li>Siembre las células HepG2 en placas de cultivo celular de 6 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo y cultive las placas en una incubadora de temperatura constante durante 24 h. Consulte la Figura 1 para obtener una representación visual de los pasos descritos.</li>
	<li>Después de 24 h de cultivo celular, agregue 2 mL de medio de cultivo celular que contenga OA a cada pocillo, logrando concentraciones finales de 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM y 1 mM. Después de 24 h adicionales, retire el medio de cultivo celular de cada pocillo y lave dos veces con PBS. Agregue 1 mL de fijador ORO a cada pocillo e incube durante 30 min.</li>
	<li>Prepare la solución de tinción ORO mezclando la solución de tinción A con la solución de tinción B en una proporción de 3:2. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego filtre una vez a través de un filtro de 0,45 μm. Guarde la solución filtrada en un tubo de centrífuga protegido de la luz hasta su uso.</li>
	<li>Deseche el fijador y lávese dos veces con agua destilada. Añadir 1 mL de isopropanol al 60% a cada pocillo e incubar durante 30 s. Deseche el 60% de la solución de isopropanol y agregue 1 mL de solución de tinción ORO recién preparada a cada pocillo antes de incubar durante 20 minutos. Deseche la solución de tinción ORO, agregue 1 mL de isopropanol al 60% a cada pocillo e incube durante 30 s. Lava 5 veces con agua para eliminar el exceso de tinte.</li>
	<li>Cubra las células con agua destilada y observe bajo un microscopio. Una vez recogidas las imágenes, desecha el líquido de la placa y deja que se seque. A continuación, añada 2 mL de isopropanol a cada pocillo y agite el plato en un agitador orbital durante 10 min. Transfiera el líquido a una nueva placa de 96 pocillos, con 16 pocillos en cada grupo, agregando 100 μL por pocillo. Calcule el contenido de lípidos midiendo la densidad óptica (OD) de cada pocillo utilizando un lector de microplacas a 510 nm (A510).</li>
</ol>4. Efectos de diferentes concentraciones de ácido oleico sobre el triglicérido total en el sobrenadante celular HepG2
<ol><li>Equilibre el kit a temperatura ambiente durante 20 minutos y prepare las placas necesarias para el experimento.</li>
	<li>Recoja el sobrenadante celular y centrifugue a 1.570 × g durante 10 min. Establecer pozos estándar y probar pozos de muestra. Agregue 50 μL de concentración estándar ([S0 → S5] seguida de: 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) a los pocillos estándar. Además de los pocillos en blanco y estándar, agregue 10 μL de muestras diferentes a los pocillos de muestra, seguido de agregar 40 μL de diluyente de muestra a cada pocillo. Añadir 100 μL de anticuerpo de detección-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo, sellar con una membrana de placa e incubar a 37 °C durante 1 h en un horno de temperatura constante.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, séquelo en papel sin polvo y lave cada pozo con 1 solución de lavado. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min. Repita el proceso de lavado 5 veces.</li>
	<li>Agregue 50 μL de sustrato A y 50 μL de sustrato B a cada pocillo. Mezclar suavemente e incubar durante 15 min a 37 °C. Agregue 50 μL de solución de terminación a cada pocillo y mida el valor OD de cada pocillo a 450 nm (A450) dentro de los 15 min.</li>
	<li>Represente la concentración del patrón a lo largo del eje x y el valor de absorbancia (OD) correspondiente a lo largo del eje y para realizar una regresión lineal y derivar la ecuación de la curva para calcular el valor de concentración de cada muestra.</li>
</ol>5. Análisis estadístico
<ol><li>Determinar diferencias significativas en los datos cuantitativos.</li>
	<li>Calcule la media ± la desviación estándar (DE) y represente gráficamente los datos. Considere que P < 0,05 son estadísticamente significativos.</li>
</ol>

Células HepG2 inducidas por ácido oleico para el análisis de enfermedades metabólicas 

<ol>
	<li>Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+a+multidisciplinary+approach.">Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).</li><li>Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediterranean+diet+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).</li><li>Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+development+and+progression.">Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).</li><li>Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+dyslipidemia:+An+update.">Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update.</a> Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).</li><li>European Association for the Study of the Liver (EASL). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EASL-EASD-EASO+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Management+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease.">EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease.</a> Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>D&#237;az, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intersection+between+alcohol-related+liver+disease+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).</li><li>Cotter, T. G., Rinella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease+2020:+The+state+of+the+disease.">Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).</li><li>Lonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+mechanisms+for+and+treatment+of+NAFLD+or+NASH+occurring+after+liver+transplantation.">Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation.</a> Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).</li><li>Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+(NAFLD):+Current+concepts.">Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts.</a> Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).</li><li>Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease-a+starter's+guide.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide.</a> Nutrients. 9 (10), 1072 (2017).</li><li>Wieckowska, A., Feldstein, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+invasive+versus+noninvasive.">Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive.</a> Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).</li><li>Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+sensitizers+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+steatohepatitis:+Current+status.">Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status.</a> Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).</li><li>Mili&#263;, S., Luli&#263;, D., &#352;timac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity:+biochemical,+metabolic+and+clinical+presentations.">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li><li>Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+steatohepatitis:+summary+of+an+AASLD+Single+Topic+Conference.">Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference.</a> Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).</li><li>Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+Oil+Red+O+staining+with+the+salicylic+acid+ethanol+solution.">An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution.</a> Adipocyte. 12 (1), 2179334 (2023).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+Oil+Red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li><li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease.">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li><li>Watkins, P. A., Ellis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+acyl-CoA+synthetases.">Peroxisomal acyl-CoA synthetases.</a> Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).</li><li>Heeren, J., Scheja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-associated+fatty+liver+disease+and+lipoprotein+metabolism.">Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism.</a> Mol Metab. 50, 101238 (2021).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+isoquercitrin+on+free+fatty+acid-induced+lipid+accumulation+in+HepG2+cells.">Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells.</a> Molecules. 28 (3), 1476 (2023).</li><li>Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopus+lucidus+Turcz.+ex+Benth.+attenuates+free+fatty+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+high-fat+diet-induced+obese+mice.">Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice.</a> Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hesperetin+ameliorates+hepatic+oxidative+stress+and+inflammation+via+the+PI3K/AKT-Nrf2-ARE+pathway+in+oleic+acid-induced+HepG2+cells+and+a+rat+model+of+high-fat+diet-induced+NAFLD.">Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD.</a> Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protopanaxadiol+ameliorates+NAFLD+by+regulating+hepatocyte+lipid+metabolism+through+AMPK/SIRT1+signaling+pathway.">Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway.</a> Biomed Pharmacother. 160, 114319 (2023).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeaxanthin+prevents+ferroptosis+by+promoting+mitochondrial+function+and+inhibiting+the+p53+pathway+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+cells.">Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287 (2023).</li><li>Mun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+extract+of+Curcuma+longa+L.+ameliorates+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease.</a> Nutrients. 11 (10), 2536 (2019).</li><li>Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lonicera+caerulea+extract+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice.">Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Nutrients. 11 (3), 494 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-naphthoflavone+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+oleic+acid-treated+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice.">Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Biomed Pharmacother. 118, 109287 (2019).</li><li>Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+simvastatin+concentrations+reduce+oleic+acid-induced+steatosis+in+HepG(2)+cells:+An+in+vitro+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Exp Ther Med. 11 (4), 1487-1492 (2016).</li><li>Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+mechanisms+of+oleic+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells.">Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).</li><li>Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+(NAFLD)+pathogenesis+and+natural+products+for+prevention+and+treatment.">Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 15489 (2022).</li><li>Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polyphenols+protect+against+oleic+acid-induced+steatosis+in+an+in+vitro+model+of+NAFLD+by+modulating+lipid+metabolism+and+improving+mitochondrial+function.">Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function.</a> Nutrients. 11 (3), 541 (2019).</li><li>Tie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaempferol+and+kaempferide+attenuate+oleic+acid-Induced+lipid+accumulation+and+oxidative+stress+in+HepG2+cells.">Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8847 (2021).</li><li>Fang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diosgenin+ameliorates+palmitic+acid-induced+lipid+accumulation+via+AMPK/ACC/CPT-1A+and+SREBP-1c/FAS+signaling+pathways+in+LO2+cells.">Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells.</a> BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL-dependent+signaling+regulates+autophagic+flux+in+a+murine+model+of+non-alcohol-associated+fatty+liver+and+steatohepatitis.">MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis.</a> J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).</li><li>Scavo, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oleic/palmitic+acid+imbalance+in+exosomes+isolated+from+NAFLD+patients+induces+necroptosis+of+liver+cells+via+the+elongase-6/RIP-1+pathway.">The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway.</a> Cell Death Dis. 14 (9), 635 (2023).</li><li>Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+intracellular+lipid+accumulation+in+a+new+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> BMC Gastroenterol. 12, 20 (2012).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).</li></ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El MASLD es un síndrome clinicopatológico caracterizado por un depósito excesivo de grasa intracelular en los hepatocitos debido a factores más allá del alcohol y otros agentes hepáticos establecidos18. La MASLD está estrechamente relacionada con la lesión hepática por estrés metabólico adquirido, especialmente asociada con la resistencia a la insulina y la susceptibilidad genética. Para estudiar y cribar eficazmente los fármacos para detectar la MASLD, es crucial seleccionar un model...

La enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés) abarca una variedad de afecciones, que incluyen esteatosis simple, esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis y carcinoma hepatocelular 1,2,3,4,5,6, todas atribuidas a factores distintos al consumo de alcohol7. La MASLD es la enfermedad hepática más prevalente causada por lesión metabólica hepática, afectando a casi una cuarta parte de la población mundial 8,9,10,11,12. Si bien aún no se ha dilucidado la patogenia precisa de MASLD, varias teorías intentan explicar su desarrollo. Una noción predominante sugiere un alejamiento de la teoría clásica de "dos golpes" hacia un modelo de "múltiples golpes"1. Un elemento central de estas hipótesis es el papel de la resistencia a la insulina, que se cree que es fundamental en la patogénesis de MASLD13. Las investigaciones indican que la resistencia a la insulina en los hepatocitos conduce a un aumento de los niveles de ácidos grasos libres, formando posteriormente triglicéridos almacenados en el hígado14,15.
Los investigadores han utilizado modelos in vivo e in vitro para simular la deposición de grasa en MASLD; Sin embargo, replicar completamente su mecanismo patológico sigue siendo un desafío. A pesar de esta limitación, estos modelos han sido fundamentales en el estudio de posibles dianas terapéuticas para MASLD. Sin embargo, el desarrollo de un modelo estable de MASLD es crucial. Si bien los modelos animales son efectivos, requieren mucho tiempo y son costosos, lo que pone de manifiesto el creciente interés en los modelos celulares in vitro . Estos modelos suelen utilizar uno o varios ácidos grasos libres, como el ácido oleico (OA) y el ácido palmítico, para recrear el MASLD inducido por la dieta. Entre ellas, la línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo para establecer modelos celulares in vitro de MASLD.
La inducción de OA estimula las células HepG2 para replicar la deposición de grasa similar a MASLD, un método con una historia bien establecida. El objetivo de este estudio fue demostrar la viabilidad, la tinción de Oil Red O (ORO), el contenido de lípidos y el nivel de triglicéridos (TG) de las células HepG2 tratadas con 0,25 mM de OA. El objetivo de este experimento fue proporcionar más evidencia para el desarrollo de estudios de modelado MAFLD.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crygenic Vials</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Count Plate</td>
			<td>Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent &#38; Instrument Co.</td>
			<td>02270113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8 assays</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>CA1210-1000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-5710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMSO Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Labeling Equipment</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells line</td>
			<td>Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)</td>
			<td>221031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Triglyceride (TG) ELISA instruction</td>
			<td>Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute</td>
			<td>20170301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope for Cell Culture</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.</td>
			<td>2021030141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>G1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A502071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 24.0</td>
			<td></td>
			<td>Statistics software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro modeling of fat deposition in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

La prevalencia de la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés) ha aumentado debido a los cambios en los patrones económicos y de estilo de vida, lo que ha provocado importantes problemas de salud. En informes anteriores se ha estudiado el establecimiento de modelos animales y celulares para MASLD, destacando las diferencias entre ellos. En este estudio, se creó un modelo celular mediante la inducción de la acumulación de grasa en MASLD. Las células HepG2 se estimularon con el ácido graso insaturado ácido oleico a varias concentraciones (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) para emular MASLD. La eficacia del modelo se evaluó mediante ensayos del kit de recuento de células-8, tinción con Oil Red O y análisis del contenido de lípidos. Este estudio tuvo como objetivo crear un modelo celular fácil de operar para las células MASLD. Los resultados de los ensayos del kit de recuento de células 8 mostraron que la supervivencia de las células HepG2 dependía de la concentración de ácido oleico, con un IG50 de 1,875 mM. La viabilidad celular en los grupos de 0,5 mM y 1 mM fue significativamente menor que en el grupo control (P < 0,05). Además, la tinción de Oil Red O y el análisis del contenido de lípidos examinaron la deposición de grasa a diferentes concentraciones de ácido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) en células HepG2. El contenido de lípidos de los grupos de 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM fue significativamente mayor que el del grupo control (P < 0,05). Además, los niveles de triglicéridos en los grupos de OA fueron significativamente más altos que en el grupo control (P < 0,05).

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) encompasses a range of conditions, including simple steatosis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis, and hepatocellular carcinoma1,2,3,4,5,6, all attributed to factors other than alcohol consuption7. MASLD is the most prevalent liver disease caused by metabolic liver injury, affecting nearly one-quarter of the global population8,9,10,11,12. While the precise pathogenesis of MASLD has not yet been elucidated, various theories attempt to explain its development. One prevailing notion suggests a departure from the classic &#34;two-hit&#34; theory towards a &#34;multiple-hit&#34; model1. Central to these hypotheses is the role of insulin resistance, which is believed to be pivotal in MASLD pathogenesis13. Research indicates that insulin resistance in hepatocytes leads to increased levels of free fatty acids, subsequently forming triglycerides stored within the liver14,15.
Researchers have used both in vivo and in vitro models to simulate fat deposition in MASLD; yet fully replicating its pathomechanism remains challenging. Despite this limitation, these models have been instrumental in studying potential therapeutic targets for MASLD. However, the development of a stable model of MASLD is crucial. While animal models are effective, they are time-consuming and expensive, thus highlighting the growing interest in in vitro cellular models. These models often use single or multiple free fatty acids such as oleic acid (OA) and palmitic acid to recreate diet-induced MASLD. Among these, the human hepatoblastoma cell line HepG2 is often used to establish in vitro cellular models of MASLD.
OA induction stimulates HepG2 cells to replicate fatty deposition akin to MASLD, a method with a well-established history. The aim of this study was to demonstrate the viability, Oil Red O (ORO) staining, lipid content, and triglyceride (TG) level of HepG2 cells treated with 0.25 mM OA. The objective of this experiment was to provide further evidence for the development of MAFLD modeling studies.

Autor destacado: Establecimiento de modelos celulares MASLD para investigar los mecanismos de la enfermedad y los efectos hipolipemiantes del koumiss

Modelado in vitro de la deposición de grasa en la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica

Our research direction is the study of traditional Mongolian medicine by establishing a metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease cell model. The role and the mechanism of koumiss therapy are studied. The findings of the presence study will prove advantageous in the future, enabling the establishment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease cell models and the investigation of the disease underlying mechanisms.A future study will be conducted based on the metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease cell model to investigate the mechanism of action of the lipid-lowering effect of koumiss.

Efecto del ácido oleico sobre la viabilidad celular Las células HepG2 se expusieron a concentraciones variables de OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), lo que resultó en una disminución en las tasas de supervivencia celular a 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM en comparación con 0 mM. Se observó significación estadística a 0,5 mM (P < 0,05) y 1 mM (P < 0,05) en comparación con 0 mM. Los resultados del impacto de la OA en la viabilidad celular, evaluados por el kit CCK-8...

Este artículo describe el uso de células HepG2 inducidas por ácido oleico como modelo para la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica.

The prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) has surged due to changes in economic and lifestyle patterns, leading ...

in-vitro-modeling-fat-deposition-metabolic-dysfunction-associated

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Modeling of Fat Deposition in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease

229 vistas.  Inner Mongolia Medical University. Nuestra dirección de investigación es el estudio de la medicina tradicional mongola mediante el establecimiento de un modelo celular de enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica. Se estudia el papel y el mecanismo de la terapia con koumiss. Los hallazgos del estudio de presencia resultarán ventajosos en el futuro, permitiendo el establecimiento de modelos celulares de enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción...

Video: Autor destacado: Establecimiento de modelos celulares MASLD para investigar los mecanismos de la enfermedad y los efectos hipolipemiantes del koumiss