Die aktuelle Studie wurde im Rahmen der "Studie über die Schlüsselfragen der heilenden Wirkung von Koumiss auf regionale Krankheiten der mongolischen Medizin" im Jahr 2018 des Wissenschafts- und Technologieprogramms des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie des Autonomen Gebiets Innere Mongolei gefördert.

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Zellkultur
<ol><li>Kultur-HepG2-Zellen in Kulturflaschen, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthalten (enthält 10 % fötales Rinderserum [FBS], 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Die Kulturkolben werden in einem 5 %CO 2 - Inkubator bei 37 °C gehalten.</li>
</ol>2. Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen, gemessen mit dem Zellzählkit-8
<ol><li>Ein bestimmtes Volumen OA wird in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine Konzentration von 200 mM zu erreichen. Lagern Sie die Lösung für die zukünftige Verwendung bei -20 °C.</li>
	<li>HepG2-Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Zelldichte von 6 × 103 Zellen pro Well säen. Geben Sie 100 μl DMEM in jede Vertiefung. Inkubieren und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator für 24 h. Teilen Sie die HepG2-Zellen in zwei Gruppen auf:<ol><li>Kontrollgruppe: Zellkulturmedium hinzufügen.</li>
		<li>OA-Gruppe: Fügen Sie dem Zellkulturmedium OA hinzu, um Endkonzentrationen von 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM zu erreichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach 24 Stunden anfänglicher Inkubation wird der Überstand aus jeder Vertiefung verworfen und OA entsprechend der angegebenen Gruppierung hinzugefügt, wobei 100 μl pro Vertiefung hinzugefügt werden. Für die Kontrollgruppe geben Sie 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Gruppe über sechs Replikationsvertiefungen verfügt. Um eine Verdunstung zu verhindern, geben Sie 100 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den äußeren Ring der Vertiefungen in der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Nach 24 Stunden Inkubation 10 μl Zellzählkit-8 (CCK-8) in jede Vertiefung geben, vorsichtig mischen und 2 Stunden im Dunkeln inkubieren. Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator, legen Sie sie in den Mikroplatten-Reader und messen Sie den Absorptionswert bei 450 nm (A450). Die GI50-Werte wurden entsprechend der OD gezählt.</li>
</ol>3. Öl-Rot-O-Färbung zur Beobachtung der intrazellulären Lipidtröpfchenbildung
<ol><li>HepG2-Zellen in 6-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Well säen und die Platten in einem Inkubator mit konstanter Temperatur für 24 Stunden kultivieren. In Abbildung 1 finden Sie eine visuelle Darstellung der beschriebenen Schritte.</li>
	<li>Geben Sie nach 24 Stunden Zellkultur 2 ml OA-haltiges Zellkulturmedium in jede Vertiefung und erreichen Sie Endkonzentrationen von 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM. Nach weiteren 24 Stunden nehmen Sie das Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es zweimal mit PBS. Geben Sie 1 ml ORO-Fixiermittel in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.</li>
	<li>Bereiten Sie die ORO-Färbelösung vor, indem Sie Färbelösung A mit Färbelösung B im Verhältnis 3:2 mischen. Lassen Sie die Mischung 10 min bei Raumtemperatur stehen, dann filtrieren Sie sie einmal durch einen 0,45 μm Filter. Bewahren Sie die gefilterte Lösung bis zur Verwendung in einem lichtgeschützten Zentrifugenröhrchen auf.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie es zweimal mit destilliertem Wasser. Geben Sie 1 ml 60% Isopropanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 s lang. Verwerfen Sie 60 % der Isopropanollösung und geben Sie 1 ml frisch zubereitete ORO-Färbelösung in jede Vertiefung, bevor Sie sie 20 Minuten lang inkubieren. Entsorgen Sie die ORO-Färbelösung, geben Sie 1 ml 60%iges Isopropanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 s lang. 5x mit Wasser waschen, um überschüssige Farbe zu entfernen.</li>
	<li>Bedecken Sie die Zellen mit destilliertem Wasser und beobachten Sie sie unter einem Mikroskop. Sobald die Bilder aufgenommen sind, entsorgen Sie die Flüssigkeit in der Platte und lassen Sie sie trocknen. Geben Sie dann 2 ml Isopropanol in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler 10 Minuten lang. Übertragen Sie die Flüssigkeit auf eine neue 96-Well-Platte mit 16 Wells in jeder Gruppe und fügen Sie 100 μl pro Well hinzu. Berechnen Sie den Lipidgehalt, indem Sie die optische Dichte (OD) jeder Vertiefung mit einem Mikroplatten-Reader bei 510 nm (A510) messen.</li>
</ol>4. Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von Ölsäure auf das Gesamttriglycerid im HepG2-Zellüberstand
<ol><li>Äquilibrieren Sie das Kit 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und bereiten Sie die erforderlichen Platten für das Experiment vor.</li>
	<li>Den Zellüberstand auffangen und bei 1.570 × g 10 min zentrifugieren. Legen Sie Standard-Wells fest und testen Sie Proben-Wells. 50 μl Standardkonzentration ([S0 → S5], gefolgt von: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/l) in die Standardvertiefungen geben. Zusätzlich zu den Blind- und Standard-Wells geben Sie 10 μl verschiedener Proben in die Probenvertiefungen und fügen Sie anschließend 40 μl Probenverdünnungsmittel in jede Vertiefung hinzu. Geben Sie 100 μl Nachweis-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase in jede Vertiefung, verschließen Sie sie mit einer Plattenmembran und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einem Ofen mit konstanter Temperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, tupfen Sie ihn auf staubfreiem Papier trocken und waschen Sie jede Mulde mit 1x Waschlösung. 1 Min. bei Raumtemperatur ziehen lassen. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl Substrat A und 50 μl Substrat B in jede Vertiefung. Vorsichtig mischen und 15 min bei 37 °C inkubieren. Geben Sie 50 μl Terminationslösung in jede Vertiefung und messen Sie den OD-Wert jeder Vertiefung bei 450 nm (A450) innerhalb von 15 Minuten.</li>
	<li>Plotten Sie die Konzentration des Standards entlang der x-Achse und den entsprechenden Absorptionswert (OD) entlang der y-Achse, um eine lineare Regression durchzuführen, und leiten Sie die Kurvengleichung ab, um den Konzentrationswert jeder Probe zu berechnen.</li>
</ol>5. Statistische Analyse
<ol><li>Ermitteln Sie signifikante Unterschiede in quantitativen Daten.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und stellen Sie die Daten grafisch dar. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.</li>
</ol>

Ölsäure-induzierte HepG2-Zellen für die Analyse metabolischer Erkrankungen 

<ol>
	<li>Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+a+multidisciplinary+approach.">Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).</li><li>Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediterranean+diet+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).</li><li>Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+development+and+progression.">Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).</li><li>Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+dyslipidemia:+An+update.">Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update.</a> Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).</li><li>European Association for the Study of the Liver (EASL). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EASL-EASD-EASO+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Management+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease.">EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease.</a> Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>D&#237;az, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intersection+between+alcohol-related+liver+disease+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).</li><li>Cotter, T. G., Rinella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease+2020:+The+state+of+the+disease.">Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).</li><li>Lonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+mechanisms+for+and+treatment+of+NAFLD+or+NASH+occurring+after+liver+transplantation.">Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation.</a> Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).</li><li>Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+(NAFLD):+Current+concepts.">Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts.</a> Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).</li><li>Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease-a+starter's+guide.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide.</a> Nutrients. 9 (10), 1072 (2017).</li><li>Wieckowska, A., Feldstein, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+invasive+versus+noninvasive.">Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive.</a> Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).</li><li>Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+sensitizers+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+steatohepatitis:+Current+status.">Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status.</a> Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).</li><li>Mili&#263;, S., Luli&#263;, D., &#352;timac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity:+biochemical,+metabolic+and+clinical+presentations.">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li><li>Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+steatohepatitis:+summary+of+an+AASLD+Single+Topic+Conference.">Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference.</a> Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).</li><li>Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+Oil+Red+O+staining+with+the+salicylic+acid+ethanol+solution.">An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution.</a> Adipocyte. 12 (1), 2179334 (2023).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+Oil+Red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li><li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease.">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li><li>Watkins, P. A., Ellis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+acyl-CoA+synthetases.">Peroxisomal acyl-CoA synthetases.</a> Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).</li><li>Heeren, J., Scheja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-associated+fatty+liver+disease+and+lipoprotein+metabolism.">Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism.</a> Mol Metab. 50, 101238 (2021).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+isoquercitrin+on+free+fatty+acid-induced+lipid+accumulation+in+HepG2+cells.">Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells.</a> Molecules. 28 (3), 1476 (2023).</li><li>Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopus+lucidus+Turcz.+ex+Benth.+attenuates+free+fatty+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+high-fat+diet-induced+obese+mice.">Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice.</a> Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hesperetin+ameliorates+hepatic+oxidative+stress+and+inflammation+via+the+PI3K/AKT-Nrf2-ARE+pathway+in+oleic+acid-induced+HepG2+cells+and+a+rat+model+of+high-fat+diet-induced+NAFLD.">Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD.</a> Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protopanaxadiol+ameliorates+NAFLD+by+regulating+hepatocyte+lipid+metabolism+through+AMPK/SIRT1+signaling+pathway.">Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway.</a> Biomed Pharmacother. 160, 114319 (2023).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeaxanthin+prevents+ferroptosis+by+promoting+mitochondrial+function+and+inhibiting+the+p53+pathway+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+cells.">Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287 (2023).</li><li>Mun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+extract+of+Curcuma+longa+L.+ameliorates+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease.</a> Nutrients. 11 (10), 2536 (2019).</li><li>Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lonicera+caerulea+extract+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice.">Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Nutrients. 11 (3), 494 (2019).</li><li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-naphthoflavone+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+oleic+acid-treated+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice.">Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Biomed Pharmacother. 118, 109287 (2019).</li><li>Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+simvastatin+concentrations+reduce+oleic+acid-induced+steatosis+in+HepG(2)+cells:+An+in+vitro+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Exp Ther Med. 11 (4), 1487-1492 (2016).</li><li>Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+mechanisms+of+oleic+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells.">Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).</li><li>Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+(NAFLD)+pathogenesis+and+natural+products+for+prevention+and+treatment.">Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 15489 (2022).</li><li>Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polyphenols+protect+against+oleic+acid-induced+steatosis+in+an+in+vitro+model+of+NAFLD+by+modulating+lipid+metabolism+and+improving+mitochondrial+function.">Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function.</a> Nutrients. 11 (3), 541 (2019).</li><li>Tie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaempferol+and+kaempferide+attenuate+oleic+acid-Induced+lipid+accumulation+and+oxidative+stress+in+HepG2+cells.">Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8847 (2021).</li><li>Fang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diosgenin+ameliorates+palmitic+acid-induced+lipid+accumulation+via+AMPK/ACC/CPT-1A+and+SREBP-1c/FAS+signaling+pathways+in+LO2+cells.">Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells.</a> BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255 (2019).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL-dependent+signaling+regulates+autophagic+flux+in+a+murine+model+of+non-alcohol-associated+fatty+liver+and+steatohepatitis.">MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis.</a> J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).</li><li>Scavo, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oleic/palmitic+acid+imbalance+in+exosomes+isolated+from+NAFLD+patients+induces+necroptosis+of+liver+cells+via+the+elongase-6/RIP-1+pathway.">The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway.</a> Cell Death Dis. 14 (9), 635 (2023).</li><li>Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+intracellular+lipid+accumulation+in+a+new+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> BMC Gastroenterol. 12, 20 (2012).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

MASLD ist ein klinisch-pathologisches Syndrom, das durch eine übermäßige intrazelluläre Fettablagerung in Hepatozyten gekennzeichnet ist, die auf Faktoren zurückzuführen ist, die über Alkohol und andere etablierte leberschädigende Wirkstoffe hinausgehen18. MASLD ist eng mit erworbenem metabolischem Stress und Leberschäden verbunden, insbesondere in Verbindung mit Insulinresistenz und genetischer Anfälligkeit. Um Medikamente effektiv auf MASLD zu untersuchen und zu screenen, ist es entsch...

Die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) umfasst eine Reihe von Erkrankungen, darunter einfache Steatose, nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom 1,2,3,4,5,6, die alle auf andere Faktoren als den Alkoholkonsum zurückzuführen sind7. MASLD ist die häufigste Lebererkrankung, die durch metabolische Leberschädigung verursacht wird und fast ein Viertel der Weltbevölkerung betrifft 8,9,10,11,12. Während die genaue Pathogenese von MASLD noch nicht geklärt ist, versuchen verschiedene Theorien, ihre Entstehung zu erklären. Eine vorherrschende Auffassung deutet auf eine Abkehr von der klassischen "Two-Hit"-Theorie hin zu einem "Multiple-Hit"-Modellhin 1 hin. Im Mittelpunkt dieser Hypothesen steht die Rolle der Insulinresistenz, von der angenommen wird, dass sie für die Pathogenese von MASLD von zentraler Bedeutung ist13. Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Insulinresistenz in den Hepatozyten zu einem erhöhten Spiegel an freien Fettsäuren führt, wodurch Triglyceride gebildet werden, die in der Leber gespeichert werden14,15.
Forscher haben sowohl In-vivo - als auch In-vitro-Modelle verwendet, um die Fettablagerung bei MASLD zu simulieren. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, seinen Pathomechanismus vollständig zu replizieren. Trotz dieser Einschränkung waren diese Modelle maßgeblich an der Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele für MASLD beteiligt. Die Entwicklung eines stabilen MASLD-Modells ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Tiermodelle sind zwar effektiv, aber zeitaufwändig und teuer, was das wachsende Interesse an in vitro Zellmodellen unterstreicht. Diese Modelle verwenden oft einzelne oder mehrere freie Fettsäuren wie Ölsäure (OA) und Palmitinsäure, um diätinduzierte MASLD nachzubilden. Unter diesen wird die humane Hepatoblastom-Zelllinie HepG2 häufig verwendet, um in vitro zelluläre Modelle von MASLD zu etablieren.
Die OA-Induktion regt HepG2-Zellen an, die Fettablagerung ähnlich wie MASLD zu replizieren, eine Methode mit einer gut etablierten Geschichte. Das Ziel dieser Studie war es, die Lebensfähigkeit, die Färbung von Oil Red O (ORO), den Lipidgehalt und den Triglyceridspiegel (TG) von HepG2-Zellen zu demonstrieren, die mit 0,25 mM OA behandelt wurden. Ziel dieses Experiments war es, weitere Beweise für die Entwicklung von MAFLD-Modellierungsstudien zu liefern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Millex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Crygenic Vials</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Cell Culture Flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Count Plate</td>
			<td>Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent &#38; Instrument Co.</td>
			<td>02270113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8 assays</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>CA1210-1000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-5710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;DMSO Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme Labeling Equipment</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Spark</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells line</td>
			<td>Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)</td>
			<td>221031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Triglyceride (TG) ELISA instruction</td>
			<td>Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute</td>
			<td>20170301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope for Cell Culture</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.</td>
			<td>2021030141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>G1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A502071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS 24.0</td>
			<td></td>
			<td>Statistics software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro modeling of fat deposition in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

Die Prävalenz der mit metabolischer Dysfunktion assoziierten steatotischen Lebererkrankung (MASLD) ist aufgrund von Veränderungen in den Wirtschafts- und Lebensstilmustern sprunghaft angestiegen, was zu erheblichen gesundheitlichen Herausforderungen führt. In früheren Berichten wurde die Etablierung von tierischen und zellulären Modellen für MASLD untersucht und die Unterschiede zwischen ihnen hervorgehoben. In dieser Studie wurde ein zelluläres Modell erstellt, indem die Fettakkumulation in MASLD induziert wurde. HepG2-Zellen wurden mit der ungesättigten Fettsäure Ölsäure in verschiedenen Konzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) stimuliert, um MASLD zu emulieren. Die Wirksamkeit des Modells wurde mit Hilfe von Zellzählkit-8-Assays, Ölrot-O-Färbung und Lipidgehaltsanalyse bewertet. Ziel dieser Studie war es, ein einfach zu bedienendes zelluläres Modell für MASLD-Zellen zu schaffen. Die Ergebnisse der Zellzählkit-8-Assays zeigten, dass das Überleben von HepG2-Zellen von der Konzentration der Ölsäure mit einem GI50 von 1,875 mM abhing. Die Zellviabilität in den 0,5 mM- und 1 mM-Gruppen war signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus untersuchten die Ölrot-O-Färbung und die Lipidgehaltsanalyse die Fettablagerung bei unterschiedlichen Ölsäurekonzentrationen (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) auf HepG2-Zellen. Der Lipidgehalt der 0,25 mM-, 0,5 mM- und 1 mM-Gruppe war signifikant höher als der der Kontrollgruppe (P < 0,05). Darüber hinaus waren die Triglyceridspiegel in den OA-Gruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe (P < 0,05).

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) encompasses a range of conditions, including simple steatosis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis, and hepatocellular carcinoma1,2,3,4,5,6, all attributed to factors other than alcohol consuption7. MASLD is the most prevalent liver disease caused by metabolic liver injury, affecting nearly one-quarter of the global population8,9,10,11,12. While the precise pathogenesis of MASLD has not yet been elucidated, various theories attempt to explain its development. One prevailing notion suggests a departure from the classic &#34;two-hit&#34; theory towards a &#34;multiple-hit&#34; model1. Central to these hypotheses is the role of insulin resistance, which is believed to be pivotal in MASLD pathogenesis13. Research indicates that insulin resistance in hepatocytes leads to increased levels of free fatty acids, subsequently forming triglycerides stored within the liver14,15.
Researchers have used both in vivo and in vitro models to simulate fat deposition in MASLD; yet fully replicating its pathomechanism remains challenging. Despite this limitation, these models have been instrumental in studying potential therapeutic targets for MASLD. However, the development of a stable model of MASLD is crucial. While animal models are effective, they are time-consuming and expensive, thus highlighting the growing interest in in vitro cellular models. These models often use single or multiple free fatty acids such as oleic acid (OA) and palmitic acid to recreate diet-induced MASLD. Among these, the human hepatoblastoma cell line HepG2 is often used to establish in vitro cellular models of MASLD.
OA induction stimulates HepG2 cells to replicate fatty deposition akin to MASLD, a method with a well-established history. The aim of this study was to demonstrate the viability, Oil Red O (ORO) staining, lipid content, and triglyceride (TG) level of HepG2 cells treated with 0.25 mM OA. The objective of this experiment was to provide further evidence for the development of MAFLD modeling studies.

Autor im Rampenlicht: Etablierung von MASLD-Zellmodellen zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und der lipidsenkenden Wirkung von Koumiss

In vitro Modellierung der Fettablagerung bei metabolischer Dysfunktion-assoziierter steatotischer Lebererkrankung

Wirkung von Ölsäure auf die Lebensfähigkeit der Zellen HepG2-Zellen wurden unterschiedlichen Konzentrationen von OA ausgesetzt (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), was zu einer Abnahme der Zellüberlebensraten bei 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM und 1 mM im Vergleich zu 0 mM führte. Eine statistische Signifikanz wurde bei 0,5 mM (P < 0,05) und 1 mM (P < 0,05) im Vergleich zu 0 mM beobachtet. Die Ergebnisse des Einflusses von OA auf die Zellviabilität, wie sie mit dem CCK-8-Kit bew...

In diesem Artikel wird die Verwendung von Ölsäure-induzierten HepG2-Zellen als Modell für eine mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung beschrieben.

The prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) has surged due to changes in economic and lifestyle patterns, leading ...

in-vitro-modeling-fat-deposition-metabolic-dysfunction-associated

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Modeling of Fat Deposition in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease

399 Aufrufe.  Inner Mongolia Medical University. Unsere Forschungsrichtung ist die Erforschung der traditionellen mongolischen Medizin durch die Etablierung eines Zellmodells für steatotische Lebererkrankungen, das mit metabolischen Dysfunktionen assoziiert ist. Die Rolle und der Mechanismus der Koumiss-Therapie werden untersucht. Die Ergebnisse der Präsenzstudie werden sich in Zukunft als vorteilhaft erweisen und ermöglichen die Etablierung von Zellmodellen für metabolische Dysfunktionen, die mit Steat...

Serie: Autor im Rampenlicht: Etablierung von MASLD-Zellmodellen zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und der lipidsenkenden Wirkung von Koumiss

The prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) has surged due to changes in economic and lifestyle patterns, leading to significant health challenges. Previous reports have studied the establishment of animal and cellular models for MASLD, highlighting differences between them. In this study, a cellular model was created by inducing fat accumulation in MASLD. HepG2 cells were stimulated with the unsaturated fatty acid oleic acid at various concentrations (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) to emulate MASLD. The model&#39;s efficacy was assessed using cell counting kit-8 assays, Oil Red O staining, and lipid content analysis. This study aimed to create a simple-to-operate cellular model for MASLD cells. Results from the cell counting kit-8 assays showed that the survival of HepG2 cells was dependent on the concentration of oleic acid, with a GI50 of 1.875 mM. Cell viability in the 0.5 mM and 1 mM groups were significantly lower than those in the control group (P &#60; 0.05). Furthermore, Oil Red O staining and lipid content analysis examined fat deposition at varying oleic acid concentrations (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) on HepG2 cells. The lipid content of the 0.25 mM, 0.5 mM, and 1 mM groups was significantly higher than that of the control group (P &#60; 0.05). Additionally, triglyceride levels in the OA groups were significantly higher than those in the control group (P &#60; 0.05).

This article describes the use of oleic acid-induced HepG2 cells as a model for metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease.