Este protocolo es aplicable al estudio de la esteatosis hepática, así como a las vías hepática, metabólica, sintética y de toxificación en el contexto de la esteatosis. Las principales ventajas de este método son su reproducibilidad y el poco tiempo necesario para obtener resultados. Agregue el hecho de que ofrece dos niveles de esteatosis, leve y grave.
La esteatosis inducida in vitro podría proporcionar evidencia para la identificación de marcadores potenciales para el diagnóstico de la enfermedad, así como objetivos terapéuticos. Este método está destinado a ser aplicado en el resultado de la esteatosis. Sin embargo, se puede ajustar a una amplia gama de células diferentes afectadas por la sobreexposición a los lípidos, como durante la obesidad y la lipidemia.
Prepare el RPMI 1640 estándar. Suplemento del medio de cultivo RPMI 1640 con un 10% de FBS activado por calor y un 1% de solución de estreptomicina de penicilina. Esterilícelo usando filtros de 0,22 micrómetros y almacene el suplemento a cuatro grados centígrados.
Para preparar una solución madre de palmitato, prepare una solución de palmitato de 50 milimolares en el RPMI 1640 estándar complementado con 1% de BSA libre de lípidos. Esterilice entre cinco y diez mililitros de la solución de material utilizando filtros de 0,22 micrómetros y guárdelos a cuatro grados centígrados protegido de la luz durante un mes. Para preparar la solución madre de oleato, prepare una solución de oleato de 50 milimolares en el RPMI 1640 suplementado.
Y esterilize la solución de stock utilizando filtros de 0,22 micrómetros. Guárdelo a menos 20 grados centígrados, protegido de la luz hasta por un mes. Para preparar el medio esteatogénico a partir de las existencias preparadas previamente, prepare 100 milímetros de una mezcla micromolar de 50 de una parte de palmitato y dos partes de oleato.
Para niveles suaves, vierta una mezcla micromolar de 500 de una parte de palmitato y dos partes de oleato para niveles severos en el estándar RPMI 1640. Y esterilizar con filtros de 0,22 micrómetros. Almacene a cuatro grados centígrados durante un hasta una semana.
Alternativamente, para preparar soluciones de stock con los ácidos grasos respectivos mediante el uso de albúmina lipídica libre, disuelva el palmitato o el oleato en dos mililitros de etanol absoluto y luego mezcle el volumen final del estándar RPMI 1640. Disolver el oleato directamente almacenándolo en el medio de cultivo estándar RPMI 1640. Permita la evaporación del etanol incubando en un baño de agua a 70 grados centígrados y mezcle bien.
Esterilice ambas soluciones de stock utilizando filtros de 0,22 micrómetros y almacene la solución de caldo de palmitato a cuatro grados centígrados. Y solución de caldo de oleato a menos 20 grados centígrados. Asiento 0.1 millones de células Hep G2 por pozo en una placa de 24 pozos.
Agregue un mililitro de RPMI 1640 estándar. Preincubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas, lo que permite la unión celular. Después del pre cultivo, deseche el medio ESTÁNDAR RPMI 1640.
Y añadir el medio esteatogénico. Deseche el sobrenadante y agregue un medio esteatogénico fresco cada 24 horas. Para realizar la evaluación de viabilidad y morfología, deseche el sobrenadante y separe las células del pozo agregando 500 microlitros de tripsina EDTA al 0,05%.
Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Recoger las células resuspendidas en un micro tubo. Y centrifugar a 300 veces G.Luego desechar el sobrenadante, agregar 200 microlitros de RPMI 1640 estándar y volver a suplir las células.
Agregue 15 microlitros de 0.4% de solución azul de tripano en un microtubo fresco. Añadir y mezclar 15 microlitros de la suspensión celular anterior. Cuente las células teñidas y no teñidas en un hemocitómetro y calcule las tasas de viabilidad y mortalidad.
Coloque un resbalón de cubierta de cultivo celular en cada pozo en una placa de 24 pozos y seed células Hep G2 como se describe en el manuscrito de texto. Después de la incubación adecuada, lave las células con un mililitro de PBS y deseche el sobrenadante. Mézclalos con un mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS e incuba durante una hora a temperatura ambiente.
Deseche el exceso de paraformaldehído y enjuague las células con un mililitro de agua destilada. Luego agregue un mililitro de isopropanol al 70% e incube durante cinco minutos. Deseche el exceso de isopropanol y agregue un mililitro de solución de Oil-Red O e incube durante 30 minutos.
Deseche el exceso de solución oil-red O y luego enjuague con un mililitro de agua destilada. Observe las células bajo el microscopio a un aumento de 400x. Seleccione y capture aleatoriamente fotografías de 10 campos ópticos del área completa del pozo.
Repita las imágenes para cada pozo. Para evaluar el porcentaje de área teñida de rojo, abra el software ImageJ e importe los archivos requeridos, luego haga clic en ajustar y, utilizando la herramienta "umbral de color", defina el parámetro de tono para la detección de color rojo. A continuación, ajuste la saturación y el brillo de la imagen.
Compare el área teñida con el área completa del campo óptico, utilizando la herramienta de análisis de partículas y calcule el porcentaje promedio de cada pozo. Sentar 0,1 millones de hepatocitos por pozo en placas de 24 pozos proporciona una confluencia óptima. La viabilidad disminuyó progresivamente a medida que aumentaba el tiempo de cultivo, alcanzando el nivel más bajo del 60% a los cuatro días en la esteatosis severa.
En consecuencia, la tasa de mortalidad fue mayor en los hepatocitos cultivados en las condiciones esteatogénicas. Y aumentó progresivamente con el tiempo de exposición a los lípidos. El número de células aumentó progresivamente como resultado de la proliferación.
Sin embargo, la tasa de proliferación fue menor en la esteatosis leve a los tres y cuatro días. En contraste, la esteatosis severa se asoció con una menor proliferación en 24 horas. La tinción de células con Oil-Red O demostró al menos un aumento del doble de las gotas de lípidos en las células cultivadas en condiciones esteatogénicas.
La grasa intracelular aumentó según el tiempo de exposición del cultivo en el medio esteatogénico. En la esteatosis leve, los contenidos de lípidos aumentaron a partir del segundo día, mientras que en la esteatosis grave fueron significativamente altos a partir de las 24 horas. El cultivo celular requiere experiencia previa.
El cultivo de células Hep G2 en una condición estándar antes de usar este protocolo podría ser útil. La preparación del caldo de ácidos grasos también es un punto crucial. El ácido palmítico es sólido a temperatura ambiente y debe calentarse antes de su manejo.
Este método debe permitir el análisis molecular de diferentes vías, incluyendo, pero no limitado a la proliferación, apoptosis, autofagia, estrés oxidativo y análisis farmacológico y toxicológico.
