Expresamos nuestro gran agradecimiento a Jiayi Sun y Lu Yang del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, por la asistencia con la citometría de flujo, a Cuiping Chen del Laboratorio Estatal Clave de Recursos de Medicina del Suroeste de China, por la ayuda con la microscopía electrónica de barrido. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [82104491], la Fundación de Ciencias Naturales de Sichuan [2023NSFSC0674] y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China [2021M693789].

1. Línea celular y cultivo celular
<ol><li>Cultive la línea celular monocítica humana THP-1 en el medio de cultivo completo RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultivar las células a 37 °C en aire humidificado con 5% de CO2 . Subcultivo de células cada 2-3 días. NOTA: THP-1 es una célula de suspensión, seleccione para cambiar la mitad del medio para subcultivo. Cuando observe muchos fragmentos de células bajo el microscopio óptico, centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en el medio de cultivo celular completo fresco precalentado.</li>
	<li>Utilice células (en los pasajes 4-10) en la fase de crecimiento logarítmico para todos los experimentos. Cuando las células están en buen estado y fase de crecimiento logarítmico, son redondas, brillantes, densas y sin grumos ni fragmentos celulares bajo el microscopio óptico a 100 x.</li>
</ol>2. Diferenciación de las células THP-1
<ol><li>Prepare una solución madre de PMA con una concentración de 1 mM (disuelva 1 mg de PMA en 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir la solución madre de PMA con medio de cultivo celular completo hasta una concentración de trabajo final de 100 nM.</li>
	<li>Recoja las células de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga estéril de 10 ml. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente, resuspender las células con 3 mL de medio de cultivo completo que contenga PMA.</li>
	<li>Abra el contador de celdas y el software de conteo. Pipetear 20 μL de suspensión celular en la placa de contador de células e insertarla en la placa de contador de células. Haga clic en Vista previa B1, gire la perilla en la parte inferior derecha del instrumento y ajuste la distancia focal para que las celdas tengan un centro brillante con contornos claros en el software. Haga clic en Contar para comenzar a contar.</li>
	<li>En función de los resultados del recuento, utilice un medio de cultivo completo que contenga PMA para ajustar la densidad celular a 1 x 106 células/mL. Las células de siembra se colocan en una placa de 6 pocillos, se incuba la placa durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2 antes de comenzar el tratamiento posterior.</li>
</ol>3. Tratamiento de las células THP-1
<ol><li>Prepare una solución madre de LPS con una concentración de 1 mg/mL (disuelva 1 mg de LPS en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)). Diluir la solución madre de LPS con medio sin suero hasta una concentración de trabajo final de 1 μg/mL. Prepare una solución madre de Na2ATP con una concentración de 500 mM (disuelva 0,3026 g de ATP en 1 mL de PBS).</li>
	<li>Aspire el medio que contiene PMA de los pocillos y lávelo con PBS 1x. Añada un medio sin suero al grupo de control y un medio sin suero que contenga LPS al grupo modelo. Incubar la placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO2 antes de continuar con el tratamiento.</li>
	<li>Después de 6 h, agregue la solución madre de ATP al grupo modelo hasta una concentración de trabajo final de 500 nM. Incubar la placa durante 45 minutos a 37 °C + 5% de CO2 antes de continuar.</li>
</ol>4. Análisis de citometría de flujo (Método 1)
<ol><li>Preparación de muestras experimentales<ol><li>Siembre e incube las células en placas de 6 pocillos de acuerdo con el paso 2. Establezca cuatro grupos de control sin tratamiento: un control sin tinción, dos controles con tinción simple (uno para cada mancha) y un control con tinción doble. Establezca un grupo de tratamiento y trate de acuerdo con el paso 3.</li>
		<li>Después del tratamiento, aspire todo el sobrenadante de los pocillos y lave con PBS 2x. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (sin EDTA) a cada pocillo e incubar en la incubadora durante 30 s.</li>
		<li>Agregue 1 mL de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada pocillo para detener el desprendimiento de células y recoja las células en el tubo de 5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Agregue 1 mL de PBS para resuspender las células. Coloque los tubos con células en un baño de agua a 37 °C durante 3 min. Centrifugar todas las muestras a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Diluir 200 μL de tampón de unión 5x con 800 μL de agua destilada en 1x tampón de unión. Agregue 100 μL de tampón de unión 1x para resuspender las células y transferir las células al tubo de 5 mL.</li>
		<li>Añada 5 μL de solución de anexina V-PE a un tubo de células del grupo de control durante 10 min y 5 μL de solución de 7-AAD a otro tubo de células del grupo de control durante 5 min (como controles de tinción única por separado). Agite suavemente cada tubo para mezclar, colorear e incubar las muestras a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Agregue 400 μL de PBS a cada tubo y haga un vórtice suavemente para finalizar la incubación.</li>
		<li>Añadir 5 μL de solución de anexina V-PE a los tubos restantes e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para mezclar, colorear e incubar las muestras a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Después de 5 minutos, agregue 5 μL de solución de 7-AAD durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregue 400 μL de PBS a cada tubo y haga un vórtice suavemente para finalizar la incubación.</li>
		<li>Filtre la suspensión celular con una malla de nailon de 35 μm que forman parte de los tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL. Coloque el tubo sobre hielo y espere a que se haga la prueba. Mezcle suavemente antes de probar y luego insértelo en el instrumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometría de flujo<ol><li>Utilice un citómetro de flujo de clasificación celular activado por fluorescencia para las pruebas. Abra el software de análisis de datos del citómetro de flujo y confirme el rendimiento del detector y el láser. Haga clic en el citómetro y elija Inicio de fluidos, espere a que el sistema esté listo. Excluya las burbujas de la cámara de flujo haciendo clic en Citómetro > modos de limpieza > celda de flujo de desgasificación.</li>
		<li>Haga clic en Experimento, seleccione en secuencia Nueva carpeta, Experimento, Muestra, Tubo y Editar nombre. Una flecha de forma pentagonal frente del tubo, se vuelve verde cuando se ilumina.</li>
		<li>Haga clic en el icono del citómetro FACSCelesta (un icono de tecla de acceso directo), seleccione Parámetro y, a continuación, seleccione FSC, SSC y señal PE . Haga clic en el icono de Hoja de cálculo global (un icono de tecla de acceso directo) para establecer el histograma de PE. Para el citómetro de flujo utilizado en este estudio, utilice PE para la anexina V a 586 nm y trace en el eje X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm y trazado en el eje Y.</li>
		<li>Inserte primero la muestra de control sin teñir en el instrumento. Haga clic en el icono del Panel de control de adquisiciones (un icono de tecla de acceso directo), adquiera un mínimo de 10.000 eventos de la población deseada. Excluya los escombros mediante una puerta (P1) en un diagrama de puntos FSC-A y SSC-A. Ajuste el caudal a la velocidad media y registre los datos. Ajuste el voltaje para colocar la población de celdas en la diagonal del histograma FSC/SSC y haga clic en Reiniciar. Ajuste el caudal a la velocidad media y registre los datos.</li>
		<li>Haga clic en Siguiente tubo, ejecute controles de tinción individuales de anexina V y 7-AAD para ajustar la compensación. Ejecute los tubos restantes y recopile datos.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imágenes SEM (Método 2)
<ol><li>Preparación de muestras experimentales<ol><li>Siembre e incube las células en placas de 6 pocillos de acuerdo con el paso 2 y trátelas de acuerdo con el paso 3.</li>
		<li>Después del tratamiento, aspire todo el sobrenadante de los pocillos y lave 2 veces con PBS. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (sin EDTA) a cada pocillo e incubar en la incubadora durante 30 s.</li>
		<li>Agregue 1 mL de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada pocillo para detener el desprendimiento de células y recoja las células en el tubo de 5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fije las células con 500 μL de fijador de microscopio electrónico (dialdehído glutárico al 2,5%, 100 mM de sales de fósforo) durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de toda la noche a 4 °C.</li>
		<li>Prepare la solución de alumbre y cromo: Agregue 1,0 g de gelatina a 100 ml de agua ultrapura, calentamiento al baño de agua a 70 °C y revuelva uniformemente. Añadir 0,05 g de alumbre de cromo, remover uniformemente y filtrar con papel de filtro. Sumerja el cubreobjetos limpio en una solución de cromo y alumbre durante 2 h a 37 °C y séquelo en un horno a 37 °C para su uso posterior. NOTA: El propósito es evitar el desprendimiento de células durante el experimento.</li>
		<li>Recoja células de solución fija. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Agregue 100 μL de PBS y sople suavemente las células. Deje caer la suspensión de la celda sobre el cubreobjetos, déjela reposar durante 5 minutos. Aspire todo el sobrenadante y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez. NOTA: La operación debe realizarse con suavidad para evitar el desprendimiento de la célula. No agite vigorosamente, muévase lentamente y agregue líquido lentamente a lo largo de la pared.</li>
		<li>Añadir 500 μL de fijación de ácido ósmico al 1% durante 1 hora. Aspire todo el sobrenadante y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez.</li>
		<li>Deshidratar las muestras sucesivamente en una serie de concentraciones de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) durante 15 min por solución de EtOH. NOTA: Los cubreobjetos se pueden mantener en 100% EtOH durante varios días a 4 °C, pero deben secarse lo antes posible para evitar una deshidratación excesiva.</li>
		<li>Encienda el secador de puntos críticos, abra el tanque de CO2 , enfríe la cámara a 10 °C. Envuelva rápidamente la muestra con papel de filtro cuando la presión de la cámara sea de 0 psi y colóquela en la cámara.</li>
		<li>Abra la válvula de entrada, observe a través de la ventana de observación de CO2 , eleve el nivel de CO2 líquido entre las dos líneas rojas (no exceda el límite superior), cierre la válvula de entrada. Remoje la muestra durante 10 min. Abra las válvulas de entrada y escape simultáneamente para igualar el CO2 durante 1 minuto (el CO2 líquido desplaza al EtOH). Cierre la válvula de escape para elevar el nivel de CO2 líquido a la posición especificada, cierre la válvula de entrada.</li>
		<li>Ajuste la temperatura a 35 °C y la presión a 1250 psi. Una vez que la temperatura y la presión se estabilicen, despresurice a 100 psi/min. Extraiga la muestra cuando la presión de la cámara sea cero y apague el instrumento.</li>
		<li>Monte las muestras en soportes de muestras de aluminio SEM con cinta conductora. Emplee un recubridor de pulverización catódica para cubrir las muestras con una capa (2-5 nm) de oro.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagenológico<ol><li>Utilice SEM de emisión de campo frío de alta resolución para la obtención de imágenes. Ajuste el voltaje de aceleración de SEM a 3 kV. Ajuste la distancia de trabajo a 10 mm. Ajuste el aumento a 1.000x para observar el panorama. Ajuste el aumento a 5.000x y 20.000x para localizar la membrana plasmática y obtener una imagen de la muestra. NOTA: El proceso de visualización de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA a través de SEM es similar al de otros tipos de células y tejidos y depende de los instrumentos utilizados. La referencia14 proporciona un protocolo SEM detallado con videos adjuntos.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análisis de los mecanismos de muerte celular desencadenados por LPS/ATP en células THP-1

<ol>
	<li>Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis,+pyroptosis+and+apoptosis:+an+intricate+game+of+cell+death.">Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer.">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li><li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. 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Los autores no tienen nada que revelar.

En este manuscrito, se utilizaron dos métodos para detectar la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Se utilizó la tinción doble con anexina V/7-AAD y los resultados se analizaron mediante citometría de flujo a partir de la tinción general. Al igual que con otros análisis de citometría de flujo, se configuró un grupo de células sin tinción y dos grupos de células con una sola tinción para excluir los resultados falsos positivos y falsos negativos. Los resultados muestran qu...

La muerte celular es un proceso fisiológico fundamental en todos los organismos vivos. En los últimos años, estudios sustanciales han demostrado que la muerte celular está involucrada en la inmunidad y el equilibrio dentro del organismo. El estudio de la muerte celular nos ayuda a comprender mejor la aparición y el desarrollo de las enfermedades. Se han descrito varias formas de muerte celular programada y se han identificado algunos objetivos clave en estos procesos. La piroptosis, la apoptosis y la necroptosis son las tres vías de muerte celular programada genéticamente definidas que participan en el equilibrio interno yla enfermedad.
La piroptosis se caracteriza por la formación de poros en la membrana y la liberación de contenido celular. Las caspasas o granzimas activadas escinden las gasderminas para separar sus dominios N-terminales, que luego se oligomerizan, se unen a la membrana y forman poros 2,3,4. El poro de gasdermina proporciona un canal de secreción atípico a través de las membranas celulares, lo que da lugar a respuestas celulares posteriores, incluida la liberación de contenido y la afluencia de iones 2,3,4. En última instancia, las células finalmente experimentan la ruptura de la membrana plasmática y la lisis piroptótica facilitada por la ninjurina-15. En la apoptosis, Bax y Bak activados forman oligómeros en la membrana externa mitocondrial y liberan citocromo C, que está regulado por un equilibrio entre proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas de la familia BCL-2, caspasas iniciadoras (caspasas-8, -9 y -10) y caspasas efectoras (caspasas-3, -6 y -7)1,6,7. Los cambios morfológicos de la apoptosis incluyen la formación de ampollas en la membrana, la contracción celular, la fragmentación nuclear, la condensación de la cromatina y la formación de cuerpos apoptóticos 6,8. La serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK3) que interactúa con el receptor y el dominio similar a la quinasa de linaje mixto (MLKL) son dos componentes centrales del mecanismo necroptótico1. RIPK3 recluta y fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, se asocia con la membrana celular, inicia perforaciones de membrana, causa afluencia de iones, aumenta la osmolaridad intracelular y, finalmente, la ruptura celular 6,9. Las gasderminas y MLKL se unen a la membrana plasmática y median la piroptosis y la necroptosis, respectivamente, mientras que BAX/BAK media la apoptosis al unirse a la membrana externa de las mitocondrias6.
Aunque cada vía tiene mecanismos y resultados específicos, conducen a cambios similares en la membrana celular. En circunstancias normales, la fosfatidilserina (PS) solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estará expuesta, fuera de la membrana plasmática. La caspasa-3/caspasa-7 activa las familias TMEM16 y XKR, lo que conduce a una membrana celular asimétrica y externaliza la PS durante la apoptosis10. La afluencia de Ca2+ mediada por Gasdermin D y MLKL conduce a la pérdida de la simetría de la bicapa de fosfolípidos en la membrana celular y a la exposición de PS. La exposición ocurre antes de la pérdida de la integridad de la membrana celular11,12. Sobre la base de los cambios similares en la membrana de estos tres tipos de muerte celular programada, utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de la anexina V/7-aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar la muerte celular. La anexina V, una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio, tiene una alta afinidad por la PS, que puede servir como una sonda sensible para detectar la PS expuesta en la superficie de la membrana plasmática13. El 7-AAD es una tinción de ácido nucleico que no puede atravesar toda la membrana celular. Es similar al yoduro de propidio (PI), un colorante de ácido nucleico comúnmente utilizado. Tienen características de fluorescencia similares, pero el 7-AAD tiene un espectro de emisión más estrecho y menos interferencia con otros canales de detección. Debido a estas similitudes, no es suficiente distinguir entre piroptosis, apoptosis y necroptosis. Utilizamos la citometría de flujo para detectar la muerte celular de células enteras. Un segundo método se utiliza para capturar la membrana celular mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para observar las posibles formas de muerte celular en células individuales.
Establecimos un modelo de macrófagos diferenciados por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. Este protocolo se centra en la observación de la muerte celular más que en la investigación de los mecanismos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-50-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>220100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit</td>
			<td>Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd</td>
			<td>abs50007</td>
			<td>Annexin V-PE, 7-AAD, 5&#215;Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>celculture CO2 incubator</td>
			<td>Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish, 100 mm</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>230301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>Cellometer K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer SD100 Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge machine</td>
			<td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd</td>
			<td>L530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromium alum&#160;</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA04354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, 9 mm</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-09-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>critical point dryer</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electron microscope fixative</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G1102</td>
			<td>2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic balance</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>ATX124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol absolute</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021033102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometry analysis software</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>BD FACSDivaTM Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA00256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution cold field emission scanning electron microscope</td>
			<td>TITACHI</td>
			<td>Regulus 8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human monocytic cell line THP-1</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CL0233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Co., Ltd</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Vortex Mixer</td>
			<td>VELP Scientifica Srl</td>
			<td>ZX4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>L8880</td>
			<td>LPS is derived from Escherichia coli 055:B5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>A8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol-12-myristate-13-acetate&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>P6741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-10PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 1 mL&#160;</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-1250L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-200L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 complete culture media</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CM0233</td>
			<td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM &#946;-mercaptoethanol + 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture media&#160;</td>
			<td>Shanghai&#160;BasalMedia&#160;Technologies Co., LTD.</td>
			<td>K211104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sheath fluid</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>8546733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sputter coater</td>
			<td>Cressington Scientific Instruments Ltd</td>
			<td>108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermostatic water bath</td>
			<td>GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd&#160;</td>
			<td>HH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lps and atp-induced death of pma-differentiated thp-1 macrophages and its validation

La muerte celular es un proceso fundamental en todos los organismos vivos. El protocolo establece un modelo de lipídico diferenciado por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. El LPS combinado con ATP es un método clásico de inducción inflamatoria, a menudo utilizado para estudiar la piroptosis, pero la apoptosis y la necroptosis también responden a la estimulación por LPS/ATP. En circunstancias normales, la fosfatidilserina solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la membrana celular permanece intacta y expuesta a la fosfatidilserina, y en las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad. En este caso, se utilizó citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-aminoactinomicina D (AAD) para detectar la muerte celular de las células enteras. Los resultados muestran que células sustanciales murieron después de la estimulación con LPS/ATP. Utilizando microscopía electrónica de barrido, observamos las posibles formas de muerte celular en células individuales. Los resultados indican que las células pueden sufrir piroptosis, apoptosis o necroptosis después de la estimulación con LPS/ATP. Este protocolo se centra en observar la muerte de los macrófagos tras la estimulación con LPS/ATP. Los resultados mostraron que la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP no se limita a la piroptosis y que también pueden ocurrir apoptosis y apoptosis necróticas, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP y elegir un mejor método experimental.

Cell death is a fundamental physiological process in all living organisms. In recent years, substantial studies have shown that cell death is involved in the immunity and balance within the organism. Studying cell death helps us better understand the onset and development of diseases. Several forms of programmed cell death have been described, and some key targets in these processes have been identified. Pyroptosis, apoptosis, and necroptosis are the three genetically defined programmed cell death pathways involved in internal balance and disease1.
Pyroptosis is characterized by the formation of membrane pores and the release of cell contents. Activated caspases or granzymes cleave gasdermins to separate their N-terminal domains, which then oligomerize, bind to the membrane, and form pores2,3,4. The gasdermin pore provides an atypical secretion channel across cellular membranes, resulting in downstream cell responses, including content release and ion influx2,3,4. Ultimately, the cells eventually experience plasma membrane rupture and pyroptotic lysis facilitated by ninjurin-15. In apoptosis, activated Bax and Bak form oligomers on the mitochondrial outer membrane and release cytochrome C, which is regulated by a balance between proapoptotic and antiapoptotic proteins of the BCL-2 family, initiator caspases (caspase-8, -9 and -10) and effector caspases (caspase-3, -6 and -7)1,6,7. The morphological changes of apoptosis include membrane blebbing, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation, and apoptotic body formation6,8. The receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK3) and mixed-lineage kinase domain-like (MLKL) are two downstream core components of the necroptotic mechanism1. RIPK3 recruits and phosphorylates MLKL, p-MLKL oligomerizes, associates with the cell membrane, initiates membrane perforations, causes ion influx, increases intracellular osmolarity, and eventually cell rupture6,9. Gasdermins and MLKL bind to the plasma membrane and mediate pyroptosis and necroptosis, respectively, while BAX/BAK mediates apoptosis by binding to the outer membrane of mitochondria6.
Although each pathway has specific mechanisms and outcomes, they lead to similar changes on the cell membrane. Under normal circumstances, phosphatidylserine (PS) is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, PS will be exposed, outside of the plasma membrane. Caspase-3/caspase-7 activates TMEM16 and XKR families, which leads to an asymmetrical cell membrane and externalizes&#160;PS during apoptosis10. Gasdermin D-mediated and MLKL-mediated Ca2+ influx leads to loss of the symmetry of the phospholipid bilayer on the cell membrane and the exposure of PS. The exposure occurs before the loss of cell membrane integrity11,12. Based on the similar changes in the membrane of these three types of programmed cell death, we use flow cytometry to analyze Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) double staining to detect cell death. Annexin V, a calcium-dependent phospholipid-binding protein, has a high affinity for PS, which can serve as a sensitive probe to detect exposed PS on the surface of the plasma membrane13. 7-AAD is a nucleic acid stain that cannot pass through the entire cell membrane. It is similar to propidium iodide (PI), a commonly used nucleic acid dye. They have similar fluorescence characteristics, but 7-AAD has a narrower emission spectrum and less interference with other detection channels. Owing to these similarities, it is not sufficient to distinguish between pyroptosis, apoptosis, and necroptosis. We used flow cytometry to detect the cell death from whole cells. A second method is used to capture the cell membrane using scanning electron microscopy (SEM) to observe the possible forms of cell death in individual cells.
We established a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. This protocol focuses on observing cell death rather than investigating mechanisms.

Autor destacado: Respuesta de los macrófagos THP-1 al LPS/ATP: revelando el espectro de la piroptosis, la apoptosis y la necroptosis

Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

We are addressing LPS and ATP-introduced deaths of PMA-differentiated THP-1 macrophages. LPS and ATP-introduced deaths are not limited to pryoptosis but apoptosis and necroptosis can also occur. This will aid in a better understanding of cell death after LPS and ATP stimulation, and choosing more suitable experimental methods.Cryo-EM technology many studies the other structures in tissues, cells, and microorganisms. Cryo-EM provides neo native structure data for diverse molecular complexes. For example, using Cryo-Em techniques to perform 3D reconstruction can help us further understand the characteristic of apoptotic and necroptotic parts.Although pryoptosis is considered dominate in LPS and ATP-introduced cell death, one cannot determine the appropriation of these death forms or whether they all exist. Validating diverse cell death and measuring them will be our area of investigation in the future.

Las muestras celulares se trataron como se describe en el protocolo y se realizó la detección por citometría de flujo. Las células normales no se pueden teñir con anexina V y 7-AAD (anexina V-/7-AAD-). En las primeras etapas de la piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estaba expuesta y unida a la anexina V, pero la membrana celular aún estaba intacta y excluía la 7-AAD del espacio extracelular (anexina V+/7-AAD-). En las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad, las células se tiñen simu...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: THP-1 Macrophage Response to LPS/ATP - Unveiling Pyroptosis, Apoptosis and Necroptosis Spectrum at JoVE.com

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Estamos abordando las muertes introducidas por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados en PMA. Las muertes introducidas por LPS y ATP no se limitan a la pripoptosis, sino que también pueden ocurrir apoptosis y necroptosis. Esto ayudará a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP, y a elegir métodos experimentales más adecuados.La tecnología Cryo-EM estudia muchas de las otras estructuras de los tejidos, las células y los microorganismos. Cryo-EM proporciona datos de estructura neo nativa para diversos complejos moleculares. Por ejemplo, el uso de técnicas Cryo-Em para realizar reconstrucciones en 3D puede ayudarnos a comprender mejor las características de las piezas apoptóticas y necroptóticas.A pesar de que la prioptosis se considera dominante en la muerte celular introducida por LPS y ATP, no se puede determinar la apropiación de estas formas de muerte o si todas existen. Validar diversas muertes celulares y medirlas será nuestra área de investigación en el futuro.

lps-atp-induced-death-pma-differentiated-thp-1-macrophages-its

Research

JoVE Journal

Biology

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

1.0K vistas.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Estamos abordando las muertes introducidas por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados en PMA. Las muertes introducidas por LPS y ATP no se limitan a la pripoptosis, sino que también pueden ocurrir apoptosis y necroptosis. Esto ayudará a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP, y a elegir métodos experimentales más adecuados.La tecnología Cryo-EM estudia muchas de las otras estructuras de los tejidos, las células y los microorganismos. C...