Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi, Yenilikçi Çin Tıbbı ve Eczacılık Enstitüsü'nden Jiayi Sun ve Lu Yang'a, akış sitometrisi konusunda yardım için, Güneybatı Çin Tıbbı Kaynakları Devlet Anahtar Laboratuvarı'nda Cuiping Chen'e, taramalı elektron mikroskobu konusunda yardım için büyük takdirimizi sunuyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [82104491], Sichuan Doğa Bilimleri Vakfı [2023NSFSC0674] ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı [2021M693789] tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre hattı ve hücre kültürü
<ol><li>İnsan monositik hücre hattı THP-1'i% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 mM β-merkaptoetanol ile RPMI-1640 tam kültür ortamında büyütün. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş havada kültürleyin. Her 2-3 günde bir alt kültür hücreleri. NOT: THP-1 bir süspansiyon hücresidir, alt kültür için ortamın yarısını değiştirmeyi seçin. Işık mikroskobu altında birçok hücre parçasını gözlemlerken, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Önceden ısıtılmış taze tam hücre kültürü ortamında hücreleri yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Tüm deneyler için logaritmik büyüme aşamasında hücreleri (4-10. bölümlerde) kullanın. Hücreler iyi durumda ve logaritmik büyüme evresinde olduklarında, 100 x'te ışık mikroskobu altında yuvarlak, parlak, yoğun ve kümeler ve hücre parçaları içermezler.</li>
</ol>2. THP-1 hücrelerinin farklılaşması
<ol><li>1 mM konsantrasyonda bir PMA stok çözeltisi hazırlayın (1 mg PMA'yı 1.62 mL dimetil sülfoksit içinde çözün). PMA stok çözeltisini şununla seyreltin:tam hücre kültürü ortamı 100 nM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna kadar.</li>
	<li>Kültür kabındaki hücreleri 10 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, hücreleri PMA içeren 3 mL tam kültür ortamı ile yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre sayacını ve sayma yazılımını açın. Hücre sayaç kartına 20 μL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücre sayaç kartına yerleştirin. Önizleme B1'e tıklayın, enstrümanın sağ alt kısmındaki düğmeyi çevirin ve hücrelerin yazılımda net konturlara sahip parlak merkeze sahip olmasını sağlamak için odak mesafesini ayarlayın. Saymaya başlamak için Sayım'a tıklayın.</li>
	<li>Sayım sonuçlarına dayanarak, bir hücre yoğunluğunu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlamak için PMA içeren tam kültür ortamı kullanın. 6 oyuklu bir plakadaki tohum hücreleri, daha fazla tedaviye başlamadan önce plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2 'de 24 saat inkübe edin.</li>
</ol>3. THP-1 hücrelerinin tedavisi
<ol><li>1 mg / mL konsantrasyonda bir LPS stok çözeltisi hazırlayın (1 mg LPS'yi 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün). LPS stok çözeltisini serumsuz ortamla 1 μg/mL'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna seyreltin. 500 mM konsantrasyonda bir Na2ATP stok çözeltisi hazırlayın (0.3026 g ATP'yi 1 mL PBS içinde çözün).</li>
	<li>PMA içeren ortamı kuyulardan aspire edin ve PBS 1x ile yıkayın. Kontrol grubuna serumsuz besiyerini ve model grubuna LPS içeren serumsuz besiyerini ekleyin. Daha fazla işleme devam etmeden önce plakayı 37 ° C +% 5 CO2 'de 6 saat inkübe edin.</li>
	<li>6 saat sonra, ATP stok çözeltisini model grubuna 500 nM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonuna ekleyin. Devam etmeden önce plakayı 37 ° C +% 5 CO2'de 45 dakika inkübe edin.</li>
</ol>4. Akış sitometrisi analizi (Yöntem 1)
<ol><li>Deney örneklerinin hazırlanması<ol><li>Hücreleri adım 2'ye göre 6 oyuklu plakalarda tohumlayın ve inkübe edin. Tedavi edilmeyen dört kontrol grubu oluşturun: bir leke yok kontrolü, iki tek boyama kontrolü (her leke için bir tane) ve bir çift boyama kontrolü. Bir tedavi grubu oluşturun ve 3. adıma göre tedavi edin.</li>
		<li>Tedaviden sonra, tüm süpernatanı kuyulardan aspire edin ve PBS 2x ile yıkayın. Her oyuğa 500 μL% 0.05 Tripsin (EDTA olmayan) ekleyin ve inkübatörde 30 saniye inkübe edin.</li>
		<li>Hücre ayrılmasını durdurmak ve hücreleri 5 mL'lik tüpe toplamak için her oyuğa 1 mL RPMI-1640 tam kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL PBS ekleyin. Hücreli tüpleri 37 °C'de 3 dakika boyunca bir su banyosuna yerleştirin. Tüm numuneleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>200 μL 5x bağlama tamponunu 800 μL damıtılmış su ile 1x bağlama tamponuna seyreltin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için 100 μL 1x bağlayıcı tampon ekleyin ve hücreleri 5 mL'lik tüpe aktarın.</li>
		<li>10 dakika boyunca bir kontrol grubu hücresi tüpüne 5 μL Annexin V-PE çözeltisi ve 5 dakika boyunca başka bir kontrol grubu hücresi tüpüne 5 μL 7-AAD çözeltisi ekleyin (ayrı ayrı tek boyama kontrolleri olarak). Boyayı karıştırmak ve numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe etmek için her bir tüpü nazikçe girdaplayın. Her tüpe 400 μL PBS ekleyin ve inkübasyonu sonlandırmak için hafifçe girdaplayın.</li>
		<li>Kalan tüplere 5 μL Annexin V-PE çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Boyayı karıştırmak ve numuneleri ışıktan korunan oda sıcaklığında inkübe etmek için her bir tüpü nazikçe girdaplayın. 5 dakika sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5 μL 7-AAD çözeltisi ekleyin. Her tüpe 400 μL PBS ekleyin ve inkübasyonu sonlandırmak için hafifçe girdaplayın.</li>
		<li>5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerin bir parçası olan 35 μm'lik bir naylon ağ kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve test için bekleyin. Test etmeden önce yavaşça karıştırın ve ardından cihaza yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi<ol><li>Test için floresanla etkinleştirilen hücre sıralama akış sitometresi kullanın. Akış sitometresi veri analiz yazılımını açın ve dedektörün ve lazerin performansını onaylayın. Sitometreye tıklayın ve Fluidics başlatmayı seçin, sistemin hazır olmasını bekleyin. Sitometre > Temizleme Modları > Gaz Giderme Akış hücresine tıklayarak akış odası kabarcıklarını hariç tutun.</li>
		<li>Deney'e tıklayın, sırayla Yeni klasör, Deney, Numune, Tüp ve Adı Düzenle'yi seçin. Tüpün önündeki beşgen şekilli bir ok, yandığında yeşile döner.</li>
		<li>Sitometre FACSCelesta (bir kısayol tuşu simgesi) simgesine tıklayın, Parametre'yi seçin ve ardından FSC, SSC ve PE sinyalini seçin. PE histogramını oluşturmak için Global Çalışma Sayfası (bir kısayol tuşu simgesi) simgesine tıklayın. Bu çalışmada kullanılan akış sitometresi için, 586 nm'de Annexin V için PE kullanın ve X ekseni üzerinde çizin; 700 nm'de 7-AAD için PerCP-Cy5.5 ve Y ekseni üzerinde çizim.</li>
		<li>Lekesiz kontrol örneğini yerleştirin.ampönce cihaza yerleştirin. Edinme Panosu simgesine (bir kısayol tuşu simgesi) tıklayın, istenen popülasyondan en az 10.000 olay alın. FSC-A ve SSC-A nokta grafiğinde bir geçit (P1) kullanarak kalıntıları hariç tutun. Akış hızını Orta hıza ayarlayın ve Verileri Kaydedin. Hücre popülasyonunu FSC/SSC histogramının köşegenine yerleştirmek için voltajı ayarlayın ve Yeniden Başlat'a tıklayın. Akış hızını Orta hıza ayarlayın ve Verileri Kaydedin.</li>
		<li>Sonraki tüpe tıklayın, telafiyi ayarlamak için Annexin V ve 7-AAD'nin tek boyama kontrollerini çalıştırın. Kalan tüpleri çalıştırın ve veri toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. SEM görüntüleme (Yöntem 2)
<ol><li>Deney örneklerinin hazırlanması<ol><li>Hücreleri 6 oyuklu plakalarda 2. adıma göre tohumlayın ve inkübe edin ve 3. adıma göre muamele edin.</li>
		<li>Tedaviden sonra, tüm süpernatanı kuyulardan aspire edin ve 2x'i PBS ile yıkayın. Her oyuğa 500 μL% 0.05 Tripsin (EDTA olmayan) ekleyin ve inkübatörde 30 saniye inkübe edin.</li>
		<li>Hücre ayrılmasını durdurmak ve hücreleri 5 mL'lik tüpe toplamak için her oyuğa 1 mL RPMI-1640 tam kültür ortamı ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Hücreleri 500 μL elektron mikroskobu fiksatifi (%2,5 glutarik dialdehit, 100 mM fosfor tuzları) ile oda sıcaklığında 2 saat sabitleyin, ardından gece boyunca 4 °C'de bekletin.</li>
		<li>Krom şap çözeltisi hazırlayın: 100 mL ultra saf suya, 70 °C su banyosu ısıtmasına 1.0 g jelatin ekleyin ve eşit şekilde karıştırın. 0,05 g krom şap ekleyin, eşit şekilde karıştırın ve filtre kağıdı ile süzün. Temiz kapak camını 37 °C'de 2 saat krom şap çözeltisine batırın ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C fırında kurutun. NOT: Amaç, deney sırasında hücre ayrılmasını önlemektir.</li>
		<li>Hücreleri sabit çözeltiden toplayın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. 100 μL PBS ekleyin ve hücreleri nazikçe üfleyin. Hücre süspansiyonunu kapak camına bırakın, 5 dakika bekletin. Tüm süpernatanı aspire edin ve her seferinde 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın. NOT: Hücre ayrılmasını önlemek için işlem nazikçe yapılmalıdır. Kuvvetlice sallamayın, yavaş hareket etmeyin ve duvar boyunca yavaşça sıvı ekleyin.</li>
		<li>1 saat boyunca 500 μL% 1 osmik asit fiksasyonu ekleyin. Tüm süpernatanı aspire edin ve her seferinde 5 dakika boyunca 3x'i PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Numuneleri, EtOH çözeltisi başına 15 dakika boyunca bir dizi etanol (EtOH) konsantrasyonunda (%30, %50, %70, %80, %90, %95, %100, %100) art arda dehidre edin. NOT: Kapak camları 4 ° C'de birkaç gün boyunca% 100 EtOH içinde tutulabilir, ancak aşırı dehidrasyonu önlemek için mümkün olan en kısa sürede kurumalıdır.</li>
		<li>Kritik nokta kurutucuyu açın, CO2 tankını açın, hazneyi 10 °C'ye soğutun. Hazne basıncı 0 psi olduğunda numuneyi hızlı bir şekilde filtre kağıdı ile sarın ve hazneye koyun.</li>
		<li>Giriş vanasını açın, CO2 gözlem penceresinden gözlemleyin, iki kırmızı çizgi arasındaki sıvı CO2 seviyesini yükseltin (Üst limiti aşmayın), giriş vanasını kapatın. Numuneyi 10 dakika bekletin. CO2'yi 1 dakika eşitlemek için giriş ve egzoz valflerini aynı anda açın (sıvı CO2 , EtOH'nin yerini alır). Sıvı CO2 seviyesini belirtilen konuma yükseltmek için egzoz valfini kapatın, giriş valfini kapatın.</li>
		<li>Sıcaklığı 35 °C'ye ve basıncı 1250 psi'ye ayarlayın. Sıcaklık ve basınç dengelendiğinde, 100 psi/dk'da basıncı boşaltın. Hazne basıncı sıfır olduğunda numuneyi çıkarın ve cihazı kapatın.</li>
		<li>İletken bant kullanarak numuneleri SEM alüminyum numune tutuculara monte edin. Numuneleri bir altın tabakası (2-5 nm) ile kaplamak için bir püskürtme kaplayıcı kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme<ol><li>Görüntüleme için yüksek çözünürlüklü soğuk alan emisyon SEM kullanın. SEM'in hızlanma voltajını 3 kV'a ayarlayın. Çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın. Panoramayı gözlemlemek için büyütmeyi 1.000x'e ayarlayın. Plazma zarını bulmak ve numuneyi görüntülemek için büyütmeyi 5.000x ve 20.000x olarak ayarlayın. NOT: PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarını SEM yoluyla görselleştirme işlemi, diğer hücre ve doku türlerine benzer ve kullanılan aletlere bağlıdır. Referans14 , eşlik eden videolarla birlikte ayrıntılı bir SEM protokolü sağlar.</li>
	</ol></li>
</ol>

THP-1 Hücrelerinde LPS/ATP ile Tetiklenen Hücre Ölüm Mekanizmalarının Analizi

<ol>
	<li>Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis,+pyroptosis+and+apoptosis:+an+intricate+game+of+cell+death.">Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer.">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li><li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+and+the+cellular+consequences+of+gasdermin+pores.">Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores.</a> Semin Immunol. 69, 101803 (2023).</li><li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gasdermins:+Effectors+of+pyroptosis.">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINJ1+mediates+plasma+membrane+rupture+during+lytic+cell+death.">NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death.</a> Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).</li><li>Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+pyroptosis,+and+necroptosis-Oh+my!+The+many+ways+a+cell+can+die.">Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die.</a> J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).</li><li>Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell-derived+exosomes:+messages+from+dying+cells.">Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells.</a> Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).</li><li>Imre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+signalling+in+virus+infection.">Cell death signalling in virus infection.</a> Cell Signal. 76, 109772 (2020).</li><li>Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL:+Functions+beyond+serving+as+the+Executioner+of+Necroptosis.">MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis.</a> Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).</li><li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+macrophages+deal+with+death.">How macrophages deal with death.</a> Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endotoxin+activates+the+coagulation+cascade+through+gasdermin+D-dependent+phosphatidylserine+exposure.">Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).</li><li>Gong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT-III+acts+downstream+of+MLKL+to+regulate+necroptotic+cell+death+and+its+consequences.">ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences.</a> Cell. 169 (2), 286-300 (2017).</li><li>Dong, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cell+surface+expression+of+phosphatidylserine+in+ovarian+carcinoma+effusions+using+the+annexin-V/7-AAD+assay:+clinical+relevance+and+comparison+with+other+apoptosis+parameters.">Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters.</a> Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).</li><li>JoVE, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+(SEM),+JoVE+Science+Education+Database,+Analytical+Chemistry.">Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry.</a> JoVE. , (2024).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-D+pore+and+its+morphology+is+different+from+MLKL+channel-mediated+necroptosis.">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis.</a> Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li><li>Herr, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characteristics+of+DHA-induced+pyroptosis.">Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis.</a> Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide/adenosine+triphosphate+induces+IL-1&#946;+and+IL-18+secretion+through+the+NLRP3+inflammasome+in+RAW264.7+murine+macrophage+cells.">Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1&#946; and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells.</a> Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).</li><li>Gurung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FADD+and+caspase-8+mediate+priming+and+activation+of+the+canonical+and+noncanonical+Nlrp3+inflammasomes.">FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes.</a> J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+caspase-1+protects+against+TBI-induced+pyroptosis+in+vitro+and+in+vivo.">Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo.</a> J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3&#946;-mediated+activation+of+NLRP3+inflammasome+leads+to+pyroptosis+and+apoptosis+of+rat+cardiomyocytes+and+fibroblasts.">GSK-3&#946;-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts.</a> Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+dependent+NLRP3+inflammasome+activation+is+implicated+in+acute+lung+injury+in+mice.">RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice.</a> J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).</li><li>Rogers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gasdermin+pores+permeabilize+mitochondria+to+augment+caspase-3+activation+during+apoptosis+and+inflammasome+activation.">Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation.</a> Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+drugs+induce+pyroptosis+through+caspase-3+cleavage+of+a+gasdermin.">Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin.</a> Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+scaffolding+function+and+MLKL+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+TLR3.">Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3.</a> Nat Comm. 6, 7515 (2015).</li><li>Wang, Y., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pyroptosis,+apoptosis+and+necroptosis+to+PANoptosis:+A+mechanistic+compendium+of+programmed+cell+death+pathways.">From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways.</a> Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodiola+crenulata+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+by+maintaining+BBB+integrity+and+balancing+energy+metabolism+dysfunction.">Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction.</a> Phytomedicine. 128, 155529 (2024).</li><li>Shuwen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+induction+in+CD8++T+cell+exhaustion+in+colorectal+cancer+via+the+regulation+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites.">Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites.</a> Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+induced+intestinal+injury+is+alleviated+by+blocking+the+TLR9/caspase3/GSDME+mediated+intestinal+epithelium+pyroptosis.">Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis.</a> Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu yazıda, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümünü saptamak için iki yöntem kullanılmıştır. Annexin V/7-AAD çift boyama kullanıldı ve sonuçlar genel boyamadan akış sitometrisi ile analiz edildi. Diğer akış sitometrik analizlerinde olduğu gibi, yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçları dışlamak için bir grup boyanmamış hücre ve iki grup tek boyanmış hücre kuruldu. Sonuçlar, LPS / ATP stimülasyonundan sonra, birkaç hücrenin zar bütünlüğün?...

Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir fizyolojik süreçtir. Son yıllarda, önemli çalışmalar, hücre ölümünün organizma içindeki bağışıklık ve dengede rol oynadığını göstermiştir. Hücre ölümünü incelemek, hastalıkların başlangıcını ve gelişimini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Programlanmış hücre ölümünün çeşitli biçimleri tanımlanmış ve bu süreçlerdeki bazı kilit hedefler tanımlanmıştır. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotoz, iç denge ve hastalık1'de yer alan genetik olarak tanımlanmış üç programlanmış hücre ölümü yoludur.
Piraktoz, zar gözeneklerinin oluşumu ve hücre içeriğinin salınması ile karakterizedir. Aktive edilmiş kaspazlar veya granzimler, daha sonra oligomerleşen, zara bağlanan ve gözenekleri 2,3,4 oluşturan N-terminal alanlarını ayırmak için gasderminleri parçalar. Gasdermin gözeneği, hücresel zarlar boyunca atipik bir salgı kanalı sağlar, bu da içerik salınımı ve iyon akışı 2,3,4 dahil olmak üzere aşağı akış hücre tepkilerine neden olur. Sonuçta, hücreler sonunda ninjurin-15 tarafından kolaylaştırılan plazma zarı yırtılması ve piroptotik lizis yaşarlar. Apoptozda, aktive edilmiş Bax ve Bak, mitokondriyal dış zar üzerinde oligomerler oluşturur ve BCL-2 ailesinin proapoptotik ve antiapoptotik proteinleri, başlatıcı kaspazlar (kaspaz-8, -9 ve -10) ve efektör kaspazlar (kaspaz-3, -6 ve -7) arasındaki denge ile düzenlenen sitokrom C'yi serbest bırakır1,6,7. Apoptozun morfolojik değişiklikleri arasında membran kanaması, hücre büzülmesi, nükleer parçalanma, kromatin yoğunlaşması ve apoptotik cisim oluşumubulunur 6,8. Reseptör etkileşimli serin / treonin-protein kinaz 1 (RIPK3) ve karışık soy kinaz alanı benzeri (MLKL), nekrototik mekanizma1'in iki aşağı akış çekirdek bileşenidir. RIPK3 MLKL'yi işe alır ve fosforile eder, p-MLKL oligomerize eder, hücre zarı ile birleşir, zar deliklerini başlatır, iyon akışına neden olur, hücre içi ozmolariteyi arttırır ve sonunda hücre yırtılması 6,9. Gasdermins ve MLKL plazma zarına bağlanır ve sırasıyla piroptoz ve nekrotoza aracılık ederken, BAX/BAK mitokondri6'nın dış zarına bağlanarak apoptoza aracılık eder.
Her yolun kendine özgü mekanizmaları ve sonuçları olmasına rağmen, hücre zarında benzer değişikliklere yol açarlar. Normal şartlar altında, fosfatidilserin (PS) sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS plazma zarının dışında açığa çıkacaktır. Kaspaz-3 / kaspaz-7, asimetrik bir hücre zarına yol açan ve apoptoz10 sırasında PS'yi dışsallaştıran TMEM16 ve XKR ailelerini aktive eder. Gasdermin D aracılı ve MLKL aracılı Ca2 + akışı, hücre zarı üzerindeki fosfolipid çift tabakasının simetrisinin kaybına ve PS'nin maruz kalmasına yol açar. Maruziyet, hücre zarı bütünlüğünün kaybından önce gerçekleşir11,12. Bu üç tip programlanmış hücre ölümünün zarındaki benzer değişikliklere dayanarak, hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V / 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz. Kalsiyuma bağımlı bir fosfolipid bağlayıcı protein olan Annexin V, plazma zarının13 yüzeyinde açıkta kalan PS'yi tespit etmek için hassas bir prob görevi görebilen PS için yüksek bir afiniteye sahiptir. 7-AAD, tüm hücre zarından geçemeyen bir nükleik asit lekesidir. Yaygın olarak kullanılan bir nükleik asit boyası olan propidyum iyodür (PI) ile benzerdir. Benzer floresan özelliklerine sahiptirler, ancak 7-AAD daha dar bir emisyon spektrumuna ve diğer algılama kanallarıyla daha az parazite sahiptir. Bu benzerlikler nedeniyle piroptoz, apoptoz ve nekrotoz arasında ayrım yapmak yeterli değildir. Tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için akış sitometrisi kullandık. Tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak hücre zarını yakalamak için ikinci bir yöntem kullanılır.
Hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenozin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturduk. Bu protokol, mekanizmaları araştırmaktan ziyade hücre ölümünü gözlemlemeye odaklanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-50-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>220100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit</td>
			<td>Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd</td>
			<td>abs50007</td>
			<td>Annexin V-PE, 7-AAD, 5&#215;Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>celculture CO2 incubator</td>
			<td>Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish, 100 mm</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>230301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>Cellometer K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer SD100 Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge machine</td>
			<td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd</td>
			<td>L530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromium alum&#160;</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA04354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, 9 mm</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-09-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>critical point dryer</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electron microscope fixative</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G1102</td>
			<td>2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic balance</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>ATX124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol absolute</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021033102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometry analysis software</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>BD FACSDivaTM Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA00256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution cold field emission scanning electron microscope</td>
			<td>TITACHI</td>
			<td>Regulus 8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human monocytic cell line THP-1</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CL0233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Co., Ltd</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Vortex Mixer</td>
			<td>VELP Scientifica Srl</td>
			<td>ZX4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>L8880</td>
			<td>LPS is derived from Escherichia coli 055:B5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>A8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol-12-myristate-13-acetate&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>P6741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-10PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 1 mL&#160;</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-1250L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-200L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 complete culture media</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CM0233</td>
			<td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM &#946;-mercaptoethanol + 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture media&#160;</td>
			<td>Shanghai&#160;BasalMedia&#160;Technologies Co., LTD.</td>
			<td>K211104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sheath fluid</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>8546733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sputter coater</td>
			<td>Cressington Scientific Instruments Ltd</td>
			<td>108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermostatic water bath</td>
			<td>GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd&#160;</td>
			<td>HH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lps and atp-induced death of pma-differentiated thp-1 macrophages and its validation

Hücre ölümü, tüm canlı organizmalarda temel bir süreçtir. Protokol, hücre ölümünü gözlemlemek için insan monosit (THP-1) makrofaj modelinde lipopolisakkarit (LPS) ve adenosin trifosfat (ATP) ile indüklenen forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile farklılaşmış lipid birikimi oluşturur. ATP ile kombine LPS, genellikle piroptozu incelemek için kullanılan klasik bir inflamatuar indüksiyon yöntemidir, ancak apoptoz ve nekrotoz da LPS / ATP ile stimülasyona yanıt verir. Normal şartlar altında, fosfatidilserin sadece plazma zarının iç broşüründe lokalizedir. Bununla birlikte, piroptoz, apoptoz ve nekrotozun erken aşamalarında, hücre zarı bozulmadan kalır ve fosfatidilserine maruz kalır ve sonraki aşamalarda hücre zarı bütünlüğünü kaybeder. Burada, tüm hücrelerden hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-Aminoaktinomisin D (AAD) çift boyamasını analiz etmek için akış sitometrisi kullanıldı. Sonuçlar, LPS / ATP ile stimülasyondan sonra önemli hücrelerin öldüğünü göstermektedir. Taramalı elektron mikroskobu kullanarak, tek tek hücrelerde olası hücre ölümü biçimlerini gözlemliyoruz. Sonuçlar, hücrelerin LPS / ATP ile stimülasyondan sonra piroptoz, apoptoz veya nekrotoz geçirebileceğini göstermektedir. Bu protokol, LPS/ATP ile stimülasyondan sonra makrofajların ölümünü gözlemlemeye odaklanır. Sonuçlar, LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünün piroptoz ile sınırlı olmadığını ve apoptoz ve nekrotik apoptozun da meydana gelebileceğini gösterdi, bu da araştırmacıların LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünü daha iyi anlamalarına ve daha iyi bir deneysel yöntem seçmelerine yardımcı oldu.

Cell death is a fundamental physiological process in all living organisms. In recent years, substantial studies have shown that cell death is involved in the immunity and balance within the organism. Studying cell death helps us better understand the onset and development of diseases. Several forms of programmed cell death have been described, and some key targets in these processes have been identified. Pyroptosis, apoptosis, and necroptosis are the three genetically defined programmed cell death pathways involved in internal balance and disease1.
Pyroptosis is characterized by the formation of membrane pores and the release of cell contents. Activated caspases or granzymes cleave gasdermins to separate their N-terminal domains, which then oligomerize, bind to the membrane, and form pores2,3,4. The gasdermin pore provides an atypical secretion channel across cellular membranes, resulting in downstream cell responses, including content release and ion influx2,3,4. Ultimately, the cells eventually experience plasma membrane rupture and pyroptotic lysis facilitated by ninjurin-15. In apoptosis, activated Bax and Bak form oligomers on the mitochondrial outer membrane and release cytochrome C, which is regulated by a balance between proapoptotic and antiapoptotic proteins of the BCL-2 family, initiator caspases (caspase-8, -9 and -10) and effector caspases (caspase-3, -6 and -7)1,6,7. The morphological changes of apoptosis include membrane blebbing, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation, and apoptotic body formation6,8. The receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK3) and mixed-lineage kinase domain-like (MLKL) are two downstream core components of the necroptotic mechanism1. RIPK3 recruits and phosphorylates MLKL, p-MLKL oligomerizes, associates with the cell membrane, initiates membrane perforations, causes ion influx, increases intracellular osmolarity, and eventually cell rupture6,9. Gasdermins and MLKL bind to the plasma membrane and mediate pyroptosis and necroptosis, respectively, while BAX/BAK mediates apoptosis by binding to the outer membrane of mitochondria6.
Although each pathway has specific mechanisms and outcomes, they lead to similar changes on the cell membrane. Under normal circumstances, phosphatidylserine (PS) is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, PS will be exposed, outside of the plasma membrane. Caspase-3/caspase-7 activates TMEM16 and XKR families, which leads to an asymmetrical cell membrane and externalizes&#160;PS during apoptosis10. Gasdermin D-mediated and MLKL-mediated Ca2+ influx leads to loss of the symmetry of the phospholipid bilayer on the cell membrane and the exposure of PS. The exposure occurs before the loss of cell membrane integrity11,12. Based on the similar changes in the membrane of these three types of programmed cell death, we use flow cytometry to analyze Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) double staining to detect cell death. Annexin V, a calcium-dependent phospholipid-binding protein, has a high affinity for PS, which can serve as a sensitive probe to detect exposed PS on the surface of the plasma membrane13. 7-AAD is a nucleic acid stain that cannot pass through the entire cell membrane. It is similar to propidium iodide (PI), a commonly used nucleic acid dye. They have similar fluorescence characteristics, but 7-AAD has a narrower emission spectrum and less interference with other detection channels. Owing to these similarities, it is not sufficient to distinguish between pyroptosis, apoptosis, and necroptosis. We used flow cytometry to detect the cell death from whole cells. A second method is used to capture the cell membrane using scanning electron microscopy (SEM) to observe the possible forms of cell death in individual cells.
We established a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. This protocol focuses on observing cell death rather than investigating mechanisms.

Yazar Spotlight: LPS / ATP'ye THP-1 Makrofaj Yanıtı - Pipoptoz, Apoptoz ve Nekrotoz Spektrumunun Ortaya Çıkarılması

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

We are addressing LPS and ATP-introduced deaths of PMA-differentiated THP-1 macrophages. LPS and ATP-introduced deaths are not limited to pryoptosis but apoptosis and necroptosis can also occur. This will aid in a better understanding of cell death after LPS and ATP stimulation, and choosing more suitable experimental methods.Cryo-EM technology many studies the other structures in tissues, cells, and microorganisms. Cryo-EM provides neo native structure data for diverse molecular complexes. For example, using Cryo-Em techniques to perform 3D reconstruction can help us further understand the characteristic of apoptotic and necroptotic parts.Although pryoptosis is considered dominate in LPS and ATP-introduced cell death, one cannot determine the appropriation of these death forms or whether they all exist. Validating diverse cell death and measuring them will be our area of investigation in the future.

Hücre örnekleri protokolde tarif edildiği gibi tedavi edildi ve akım sitometrisi tespiti yapıldı. Normal hücreler Annexin V ve 7-AAD (Annexin V- / 7-AAD-) ile boyanamaz. Pipoptoz, apoptoz ve nekrotozun erken evrelerinde, PS maruz kaldı ve Annexin V'e bağlandı, ancak hücre zarı hala sağlamdı ve hücre dışı boşluktan 7-AAD hariç tutuldu (Annexin V + / 7-AAD-). Daha sonraki aşamalarda, hücre zarı bütünlüğünü kaybeder, hücreler aynı anda Annexin V ve 7-AAD ile boyanır ve çift pozitif sonuçlar...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: THP-1 Macrophage Response to LPS/ATP - Unveiling Pyroptosis, Apoptosis and Necroptosis Spectrum at JoVE.com

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP ile ilişkili ölümlerini ele alıyoruz. LPS ve ATP'ye bağlı ölümler sadece priyoptoz ile sınırlı değildir, aynı zamanda apoptoz ve nekrotoz da ortaya çıkabilir. Bu, LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünün daha iyi anlaşılmasına ve daha uygun deneysel yöntemlerin seçilmesine yardımcı olacaktır.Cryo-EM teknolojisi birçok doku, hücre ve mikroorganizmalardaki diğer yapıları inceler. Cryo-EM, çeşitli moleküler kompleksler için neo doğal yapı verileri sağlar. Örneğin, 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirmek için Cryo-Em tekniklerini kullanmak, apoptotik ve nekrototik parçaların özelliklerini daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir.Her ne kadar LPS ve ATP'ye bağlı hücre ölümünde priyoptozun baskın olduğu düşünülse de, bu ölüm formlarının sahiplenilmesi veya hepsinin var olup olmadığı belirlenemez. Çeşitli hücre ölümlerini doğrulamak ve bunları ölçmek, gelecekte araştırma alanımız olacaktır.

lps-atp-induced-death-pma-differentiated-thp-1-macrophages-its

Research

JoVE Journal

Biology

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

1.1K Görüntüleme.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP ile ilişkili ölümlerini ele alıyoruz. LPS ve ATP'ye bağlı ölümler sadece priyoptoz ile sınırlı değildir, aynı zamanda apoptoz ve nekrotoz da ortaya çıkabilir. Bu, LPS ve ATP stimülasyonundan sonra hücre ölümünün daha iyi anlaşılmasına ve daha uygun deneysel yöntemlerin seçilmesine yardımcı olacaktır.Cryo-EM teknolojisi birçok doku, hücre ve mikroorganizmalardaki diğer yapıları inceler. Cryo-EM...