Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun e Lu Yang do Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com citometria de fluxo, Cuiping Chen do Laboratório Estadual de Recursos de Medicina do Sudoeste Chinês, pela ajuda com microscopia eletrônica de varredura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [82104491], pela Fundação de Ciências Naturais de Sichuan [2023NSFSC0674] e pela Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China [2021M693789].

1. Linhagem celular e cultura celular
<ol><li>Cultive a linha celular monocítica humana THP-1 em meio de cultura completo RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultive as células a 37 ° C em ar umidificado com 5% de CO2 . Subcultura de células a cada 2-3 dias. NOTA: THP-1 é uma célula de suspensão, selecione para alterar metade do meio para subcultura. Ao observar muitos fragmentos de células ao microscópio óptico, centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Ressuspenda as células no meio de cultura celular completo fresco pré-aquecido.</li>
	<li>Use células (nas passagens 4-10) na fase de crescimento logarítmico para todos os experimentos. Quando as células estão em boas condições e fase de crescimento logarítmico, elas são redondas, brilhantes, densas e sem aglomerados e fragmentos de células ao microscópio óptico a 100 x.</li>
</ol>2. Diferenciação de células THP-1
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de PMA com uma concentração de 1 mM (dissolva 1 mg de PMA em 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir a solução-mãe de PMA com meio de cultura celular completo até obter uma concentração final de trabalho de 100 nM.</li>
	<li>Recolher as células da placa de cultura para um tubo de centrifugação estéril de 10 ml. Centrifugue a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente, ressuspenda as células com 3 mL de meio de cultura completo contendo PMA.</li>
	<li>Abra o contador de células e o software de contagem. Pipetar 20 μL de suspensão de células para a placa do contador de células e insira-o na placa do contador de células. Clique em Preview B1, gire o botão na parte inferior direita do instrumento e ajuste a distância focal para tornar as células com centro brilhante com contornos claros no software. Clique em Contar para iniciar a contagem.</li>
	<li>Com base nos resultados da contagem, use meio de cultura completo contendo PMA para ajustar a densidade celular para 1 x 106 células / mL. Células de sementes em uma placa de 6 poços, incubar a placa por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2 antes de iniciar o tratamento adicional.</li>
</ol>3. Tratamento de células THP-1
<ol><li>Prepare uma solução estoque de LPS com uma concentração de 1 mg / mL (dissolva 1 mg de LPS em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Diluir a solução-mãe de LPS com meio isento de soro até obter uma concentração final de trabalho de 1 μg/ml. Preparar uma solução-mãe de ATP de Na2com uma concentração de 500 mM (dissolver 0,3026 g de ATP em 1 ml de PBS).</li>
	<li>Aspire o meio contendo PMA dos poços e lave com PBS 1x. Adicione meio sem soro ao grupo de controle e meio sem soro contendo LPS ao grupo modelo. Incubar a placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO2 antes de prosseguir com o tratamento adicional.</li>
	<li>Após 6 h, adicionar a solução-mãe de ATP ao grupo de modelos até uma concentração final de trabalho de 500 nM. Incubar a placa durante 45 min a 37 °C + 5% CO2 antes de prosseguir.</li>
</ol>4. Análise por citometria de fluxo (método 1)
<ol><li>Preparação de amostras experimentais<ol><li>Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2. Estabeleça quatro grupos de controle sem tratamento: um controle sem coloração, dois controles de coloração simples (um para cada mancha) e um controle de coloração dupla. Estabeleça um grupo de tratamento e trate de acordo com a etapa 3.</li>
		<li>Após o tratamento, aspirar todo o sobrenadante dos poços e lavar com PBS 2x. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 1 mL de PBS para ressuspender as células. Coloque os tubos com células em banho-maria a 37 °C durante 3 min. Centrifugue todas as amostras a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Dilua 200 μL de tampão de ligação 5x com 800 μL de água destilada para tampão de ligação 1x. Adicione 100 μL de tampão de ligação 1x para ressuspender as células e transfira as células para o tubo de 5 mL.</li>
		<li>Adicione 5 μL de solução de anexina V-PE a um tubo de células do grupo controle por 10 min e 5 μL de solução de 7-AAD a outro tubo de células do grupo controle por 5 min (como controles de coloração simples separadamente). Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vore suavemente para encerrar a incubação.</li>
		<li>Adicione 5 μL de solução de Anexina V-PE aos tubos restantes e incube por 5 min em temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Após 5 min, adicione 5 μL de solução de 7-AAD por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vortex suavemente para encerrar a incubação.</li>
		<li>Filtrar a suspensão celular com uma malha de nylon de 35 μm que faz parte dos tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. Coloque o tubo no gelo e aguarde o teste. Misture suavemente antes de testar e insira-o no instrumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometria de fluxo<ol><li>Use citômetro de fluxo de classificação de células ativado por fluorescência para teste. Abra o software de análise de dados do citômetro de fluxo e confirme o desempenho do detector e do laser. Clique no citômetro e escolha Inicialização de fluidos, aguarde o sistema estar pronto. Exclua as bolhas da câmara de fluxo clicando em Citômetro > Modos de limpeza > Célula de fluxo de desgaseificação.</li>
		<li>Clique em Experimento, selecione em sequência Nova pasta, Experimento, Espécime, Tubo e Editar nome. Uma seta em forma pentagonal na frente do tubo, fica verde quando acende.</li>
		<li>Clique no ícone do Citômetro FACSCelesta (um ícone de tecla de atalho), selecione Parâmetro e, em seguida, selecione Sinal FSC, SSC e PE . Clique no ícone de Planilha Global (um ícone de tecla de atalho) para estabelecer o histograma PE. Para o citómetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar PE para a anexina V a 586 nm e traçar uma plotagem no eixo X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm e plotagem no eixo Y.</li>
		<li>Insira a amostra de controle não corada primeiro no instrumento. Clique no ícone de Painel de Aquisição (um ícone de tecla de atalho), adquira um mínimo de 10.000 eventos da população desejada. Exclua detritos usando uma porta (P1) em um gráfico de pontos FSC-A e SSC-A. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados. Ajuste a tensão para colocar a população de células na diagonal do histograma FSC/SSC e clique em Reiniciar. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados.</li>
		<li>Clique em Próximo tubo, execute os controles de coloração simples da Anexina V e 7-AAD para ajustar a compensação. Execute os tubos restantes e colete dados.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Imagem SEM (Método 2)
<ol><li>Preparação de amostras experimentais<ol><li>Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2 e trate de acordo com a etapa 3.</li>
		<li>Após o tratamento, aspire todo o sobrenadante dos poços e lave 2x com PBS. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Fixe as células com 500 μL de fixador de microscópio eletrônico (dialdeído glutárico a 2,5%, sais de fósforo 100 mM) por 2 h à temperatura ambiente, seguido de durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare a solução de alúmen de cromo: Adicione 1,0 g de gelatina a 100 mL de água ultrapura, aquecimento em banho-maria a 70 ° C e mexa uniformemente. Adicione 0,05 g de alúmen de cromo, mexa uniformemente e filtre com papel de filtro. Mergulhe a lamínula limpa em solução de alúmen de crómio durante 2 h a 37 °C e seque-a num forno a 37 °C para utilização posterior. NOTA: O objetivo é evitar o descolamento celular durante o experimento.</li>
		<li>Colete as células da solução fixa. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Adicione 100 μL de PBS e sopre suavemente as células. Deixe cair a suspensão da célula na lamínula e deixe repousar por 5 min. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez. NOTA: A operação deve ser realizada suavemente para evitar o descolamento da célula. Não agite vigorosamente, mova-se lentamente e adicione líquido lentamente ao longo da parede.</li>
		<li>Adicione 500 μL de fixação de ácido ósmico a 1% por 1 hora. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez.</li>
		<li>Desidratar as amostras sucessivamente em uma série de concentrações de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) por 15 min por solução de EtOH. NOTA: Os vidros de cobertura podem ser mantidos em 100% EtOH por vários dias a 4 °C, mas devem secar o mais rápido possível para evitar desidratação excessiva.</li>
		<li>Ligue o secador de ponto crítico, abra o tanque de CO2 , resfrie a câmara a 10 °C. Embrulhe rapidamente a amostra com papel de filtro quando a pressão da câmara for de 0 psi e coloque-a na câmara.</li>
		<li>Abra a válvula de entrada, observe através da janela de observação de CO2 , aumente o nível de CO2 do líquido entre as duas linhas vermelhas (não exceda o limite superior), feche a válvula de entrada. Mergulhe a amostra por 10 min. Abra as válvulas de admissão e escape simultaneamente para equalizar o CO2 por 1 min (o COlíquido 2 desloca o EtOH). Feche a válvula de escape para elevar o nível de CO2 do líquido para a posição especificada, feche a válvula de admissão.</li>
		<li>Defina a temperatura para 35 °C e a pressão a 1250 psi. Assim que a temperatura e a pressão se estabilizarem, despressurize a 100 psi/min. Retire a amostra quando a pressão da câmara for zero e desligue o instrumento.</li>
		<li>Monte as amostras em suportes de amostras de alumínio SEM usando fita condutora. Empregue um revestidor de pulverização catódica para cobrir as amostras com uma camada (2-5 nm) de ouro.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagiologia<ol><li>Use SEM de emissão de campo frio de alta resolução para geração de imagens. Defina a tensão de aceleração do SEM para 3 kV. Defina a distância de trabalho para 10 mm. Defina a ampliação para 1.000x para observar o panorama. Defina a ampliação para 5.000x e 20.000x para localizar a membrana plasmática e obter a imagem da amostra. NOTA: O processo de visualização de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA via MEV é semelhante a outros tipos de células e tecidos e depende dos instrumentos utilizados. A referência14 fornece um protocolo SEM detalhado com vídeos de acompanhamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análise de mecanismos de morte celular desencadeados por LPS/ATP em células THP-1

<ol>
	<li>Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis,+pyroptosis+and+apoptosis:+an+intricate+game+of+cell+death.">Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).</li><li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer.">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li><li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. 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Os autores não têm nada a divulgar.

Neste manuscrito, dois métodos foram usados para detectar a morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. A dupla coloração com anexina V/7-AAD foi usada, e os resultados foram analisados por citometria de fluxo da coloração global. Tal como acontece com outras análises de citometria de fluxo, um grupo de células não coradas e dois grupos de células coradas simples foram configurados para excluir resultados falsos positivos e falsos negativos. Os resultados mostram que após a estimula...

A morte celular é um processo fisiológico fundamental em todos os organismos vivos. Nos últimos anos, estudos substanciais mostraram que a morte celular está envolvida na imunidade e no equilíbrio dentro do organismo. Estudar a morte celular nos ajuda a entender melhor o início e o desenvolvimento de doenças. Várias formas de morte celular programada foram descritas, e alguns alvos-chave nesses processos foram identificados. Piroxase, apoptose e necroptose são as três vias de morte celular programada geneticamente definidas envolvidas no equilíbrio interno e na doença1.
A piroptose é caracterizada pela formação de poros de membrana e pela liberação de conteúdo celular. Caspases ou granzimas ativadas clivam gasderminas para separar seus domínios N-terminais, que então oligomerizam, ligam-se à membrana e formam poros 2,3,4. O poro da gasdermina fornece um canal de secreção atípico através das membranas celulares, resultando em respostas celulares a jusante, incluindo liberação de conteúdo e influxo de íons 2,3,4. Em última análise, as células eventualmente experimentam ruptura da membrana plasmática e lise piroptótica facilitada pela ninjurina-15. Na apoptose, Bax e Bak ativados formam oligômeros na membrana externa mitocondrial e liberam o citocromo C, que é regulado por um equilíbrio entre proteínas pró-apoptóticas e antiapoptóticas da família BCL-2, caspases iniciadoras (caspase-8, -9 e -10) e caspases efetoras (caspase-3, -6 e -7)1,6,7. As alterações morfológicas da apoptose incluem bolhas de membrana, encolhimento celular, fragmentação nuclear, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos 6,8. A serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK3) que interage com o receptor e a quinase de linhagem mista semelhante ao domínio (MLKL) são dois componentes centrais a jusante do mecanismo necroptótico1. RIPK3 recruta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, associa-se à membrana celular, inicia perfurações de membrana, causa influxo de íons, aumenta a osmolaridade intracelular e, eventualmente, a ruptura celular 6,9. Gasderminas e MLKL ligam-se à membrana plasmática e medeiam piroptose e necroptose, respectivamente, enquanto BAX/BAK medeia a apoptose ligando-se à membrana externa das mitocôndrias6.
Embora cada via tenha mecanismos e resultados específicos, eles levam a alterações semelhantes na membrana celular. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina (PS) está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS será exposto, fora da membrana plasmática. A caspase-3/caspase-7 ativa as famílias TMEM16 e XKR, o que leva a uma membrana celular assimétrica e externaliza o PS durante a apoptose10. O influxo de Ca2+ mediado por Gasdermin D e MLKL leva à perda da simetria da bicamada fosfolipídica na membrana celular e à exposição do PS. A exposição ocorre antes da perda da integridade da membrana celular 11,12. Com base nas alterações semelhantes na membrana desses três tipos de morte celular programada, usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V / 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar a morte celular. A anexina V, uma proteína de ligação a fosfolipídios dependente de cálcio, tem alta afinidade pelo PS, que pode servir como uma sonda sensível para detectar o PS exposto na superfície da membrana plasmática13. 7-AAD é uma mancha de ácido nucleico que não pode passar por toda a membrana celular. É semelhante ao iodeto de propídio (PI), um corante de ácido nucleico comumente usado. Eles têm características de fluorescência semelhantes, mas o 7-AAD tem um espectro de emissão mais estreito e menos interferência com outros canais de detecção. Devido a essas semelhanças, não é suficiente distinguir entre piroptose, apoptose e necroptose. Usamos citometria de fluxo para detectar a morte celular de células inteiras. Um segundo método é usado para capturar a membrana celular usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para observar as possíveis formas de morte celular em células individuais.
Estabelecemos um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófagos de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. Este protocolo se concentra em observar a morte celular em vez de investigar mecanismos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-50-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate&#160;</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>220100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit</td>
			<td>Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd</td>
			<td>abs50007</td>
			<td>Annexin V-PE, 7-AAD, 5&#215;Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>celculture CO2 incubator</td>
			<td>Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish, 100 mm</td>
			<td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td>
			<td>230301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>Cellometer K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer SD100 Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td>CHT4-SD100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge machine</td>
			<td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd</td>
			<td>L530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chromium alum&#160;</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA04354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glasses, 9 mm</td>
			<td>Labgic Technology Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>BS-09-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>critical point dryer</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BOSTER Biological Technology co.ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electron microscope fixative</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G1102</td>
			<td>2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electronic balance</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>ATX124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol absolute</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021033102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometry analysis software</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>BD FACSDivaTM Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin</td>
			<td>Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>PA00256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution cold field emission scanning electron microscope</td>
			<td>TITACHI</td>
			<td>Regulus 8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human monocytic cell line THP-1</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CL0233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Co., Ltd</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Vortex Mixer</td>
			<td>VELP Scientifica Srl</td>
			<td>ZX4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>L8880</td>
			<td>LPS is derived from Escherichia coli 055:B5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>A8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol-12-myristate-13-acetate&#160;</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co.,Ltd.&#160;</td>
			<td>P6741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 10 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-10PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 1 mL&#160;</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-1250L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips, 200 &#956;L</td>
			<td>Servicebio Technology co.ltd&#160;</td>
			<td>T-200L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 complete culture media</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>CM0233</td>
			<td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM &#946;-mercaptoethanol + 1% P/S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture media&#160;</td>
			<td>Shanghai&#160;BasalMedia&#160;Technologies Co., LTD.</td>
			<td>K211104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sheath fluid</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>8546733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sputter coater</td>
			<td>Cressington Scientific Instruments Ltd</td>
			<td>108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermostatic water bath</td>
			<td>GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd&#160;</td>
			<td>HH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lps and atp-induced death of pma-differentiated thp-1 macrophages and its validation

A morte celular é um processo fundamental em todos os organismos vivos. O protocolo estabelece um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófago de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. O LPS combinado com ATP é um método clássico de indução inflamatória, frequentemente usado para estudar a piroptose, mas a apoptose e a necroptose também respondem à estimulação por LPS/ATP. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, a membrana celular permanece intacta e exposta à fosfatidilserina e, nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (AAD) para detectar a morte celular de células inteiras. Os resultados mostram que células substanciais morreram após estimulação com LPS / ATP. Usando microscopia eletrônica de varredura, observamos as possíveis formas de morte celular em células individuais. Os resultados indicam que as células podem sofrer piroptose, apoptose ou necroptose após estimulação com LPS/ATP. Este protocolo tem como foco observar a morte de macrófagos após estimulação com LPS/ATP. Os resultados mostraram que a morte celular após a estimulação de LPS e ATP não se limita à piroptose e que a apoptose e a apoptose necrótica também podem ocorrer, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e escolher um método experimental melhor.

Cell death is a fundamental physiological process in all living organisms. In recent years, substantial studies have shown that cell death is involved in the immunity and balance within the organism. Studying cell death helps us better understand the onset and development of diseases. Several forms of programmed cell death have been described, and some key targets in these processes have been identified. Pyroptosis, apoptosis, and necroptosis are the three genetically defined programmed cell death pathways involved in internal balance and disease1.
Pyroptosis is characterized by the formation of membrane pores and the release of cell contents. Activated caspases or granzymes cleave gasdermins to separate their N-terminal domains, which then oligomerize, bind to the membrane, and form pores2,3,4. The gasdermin pore provides an atypical secretion channel across cellular membranes, resulting in downstream cell responses, including content release and ion influx2,3,4. Ultimately, the cells eventually experience plasma membrane rupture and pyroptotic lysis facilitated by ninjurin-15. In apoptosis, activated Bax and Bak form oligomers on the mitochondrial outer membrane and release cytochrome C, which is regulated by a balance between proapoptotic and antiapoptotic proteins of the BCL-2 family, initiator caspases (caspase-8, -9 and -10) and effector caspases (caspase-3, -6 and -7)1,6,7. The morphological changes of apoptosis include membrane blebbing, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation, and apoptotic body formation6,8. The receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK3) and mixed-lineage kinase domain-like (MLKL) are two downstream core components of the necroptotic mechanism1. RIPK3 recruits and phosphorylates MLKL, p-MLKL oligomerizes, associates with the cell membrane, initiates membrane perforations, causes ion influx, increases intracellular osmolarity, and eventually cell rupture6,9. Gasdermins and MLKL bind to the plasma membrane and mediate pyroptosis and necroptosis, respectively, while BAX/BAK mediates apoptosis by binding to the outer membrane of mitochondria6.
Although each pathway has specific mechanisms and outcomes, they lead to similar changes on the cell membrane. Under normal circumstances, phosphatidylserine (PS) is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, PS will be exposed, outside of the plasma membrane. Caspase-3/caspase-7 activates TMEM16 and XKR families, which leads to an asymmetrical cell membrane and externalizes&#160;PS during apoptosis10. Gasdermin D-mediated and MLKL-mediated Ca2+ influx leads to loss of the symmetry of the phospholipid bilayer on the cell membrane and the exposure of PS. The exposure occurs before the loss of cell membrane integrity11,12. Based on the similar changes in the membrane of these three types of programmed cell death, we use flow cytometry to analyze Annexin V/7-Aminoactinomycin D (7-AAD) double staining to detect cell death. Annexin V, a calcium-dependent phospholipid-binding protein, has a high affinity for PS, which can serve as a sensitive probe to detect exposed PS on the surface of the plasma membrane13. 7-AAD is a nucleic acid stain that cannot pass through the entire cell membrane. It is similar to propidium iodide (PI), a commonly used nucleic acid dye. They have similar fluorescence characteristics, but 7-AAD has a narrower emission spectrum and less interference with other detection channels. Owing to these similarities, it is not sufficient to distinguish between pyroptosis, apoptosis, and necroptosis. We used flow cytometry to detect the cell death from whole cells. A second method is used to capture the cell membrane using scanning electron microscopy (SEM) to observe the possible forms of cell death in individual cells.
We established a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. This protocol focuses on observing cell death rather than investigating mechanisms.

Autor em destaque: Resposta de macrófagos THP-1 a LPS / ATP - Revelando o espectro de piroptose, apoptose e necroptose

Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

We are addressing LPS and ATP-introduced deaths of PMA-differentiated THP-1 macrophages. LPS and ATP-introduced deaths are not limited to pryoptosis but apoptosis and necroptosis can also occur. This will aid in a better understanding of cell death after LPS and ATP stimulation, and choosing more suitable experimental methods.Cryo-EM technology many studies the other structures in tissues, cells, and microorganisms. Cryo-EM provides neo native structure data for diverse molecular complexes. For example, using Cryo-Em techniques to perform 3D reconstruction can help us further understand the characteristic of apoptotic and necroptotic parts.Although pryoptosis is considered dominate in LPS and ATP-introduced cell death, one cannot determine the appropriation of these death forms or whether they all exist. Validating diverse cell death and measuring them will be our area of investigation in the future.

As amostras de células foram tratadas conforme descrito no protocolo e a detecção por citometria de fluxo foi feita. As células normais não podem ser coradas com Anexina V e 7-AAD (Anexina V-/7-AAD-). Nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS foi exposto e ligado à anexina V, mas a membrana celular ainda estava intacta e excluiu o 7-AAD do espaço extracelular (anexina V + / 7-AAD-). Nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade, as células são coradas simultaneamente ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: THP-1 Macrophage Response to LPS/ATP - Unveiling Pyroptosis, Apoptosis and Necroptosis Spectrum at JoVE.com

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Estamos abordando mortes introduzidas por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. As mortes introduzidas por LPS e ATP não se limitam à prioptose, mas também podem ocorrer apoptose e necroptose. Isso ajudará a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e a escolher métodos experimentais mais adequados.A tecnologia Cryo-EM estuda muitas outras estruturas em tecidos, células e microorganismos. O Cryo-EM fornece dados de estrutura neonativa para diversos complexos moleculares. Por exemplo, o uso de técnicas Cryo-Em para realizar a reconstrução 3D pode nos ajudar a entender melhor as características das peças apoptóticas e necroptóticas.Embora a pryoptose seja considerada dominante na morte celular introduzida por LPS e ATP, não se pode determinar a apropriação dessas formas de morte ou se todas elas existem. Validar a morte celular diversa e medi-la será nossa área de investigação no futuro.

lps-atp-induced-death-pma-differentiated-thp-1-macrophages-its

Research

JoVE Journal

Biology

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

1.1K visualizações.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Estamos abordando mortes introduzidas por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. As mortes introduzidas por LPS e ATP não se limitam à prioptose, mas também podem ocorrer apoptose e necroptose. Isso ajudará a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e a escolher métodos experimentais mais adequados.A tecnologia Cryo-EM estuda muitas outras estruturas em tecidos, células e microorganismos. O Cryo-EM fornece dados de estrutura neonativa para...