Estamos muy agradecidos a Lonza Group Ltd. por patrocinar esta publicación cubriendo los gastos de publicación. Damos las gracias a la Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, y el Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur de apoyo financiero a SL.

1. prediferenciación de THP-1 macrófagos <ol><li> Cultivar las células THP-1 en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina / L-glutamina (PSG) en un CO 2 (5% ) incubadora a 37 ° C. </li><li> Antes de la transfección, las células dividir y transferirlos a un medio RPMI fresco como antes. Cultivar las células durante 24 horas. </li><li> Semilla de 1,0-1,5 x 10 7 células en un matraz de cultivo de tejido 75 cm ² o 2,5 x 10 7 células en un tejido de 150 cm ² cultivo en matraz en un medio RPMI-1640 y añadir 10% (v / v) de FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de piruvato de sodio, 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales, 10 ng / ml de PMA, y 50 mM β-mercaptoetanol durante 48 horas. </li></ol> 2 Preparación de Nucleofection <ol><li> Coloque Accutase yo y todos los medios de comunicación en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Aspirar el medio de cultivo del frasco y reemplazar con 6 ml (frasco de 75 cm ²) o 12 ml (frasco de 150 cm ²) deAccutase I y se incuba durante 30 min a 37 ° C para la completa separación de las células. Observe la morfología celular después del tratamiento Accutase I para asegurar que las células tienen una apariencia redonda. Si todavía aparecen algunas células que se adjunta, enjuague con cuidado el frasco con una micropipeta o golpear suavemente el cuerpo para completar el desapego. No utilice raspadores de células, ya que esto tendrá un efecto negativo sobre la vitalidad celular. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. </li><li> Durante el tratamiento Accutase I, preparar los siguientes medios: <ol><li> Preparar medio de transfección: suplemento de medio de cultivo celular con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de ácidos no esenciales aminoácidos, 1% (v / v), piruvato de sodio y 5% (v / v) de suero humana (por siRNA) o 20% (v / v) de suero humano (por ADN plásmido); preparar un volumen final de cualquiera de 3 ml / muestra para una placa de 6 pocillos o 4 ml / muestra por dos placas de 12 pocillos. </li><li> Preparar medio de cultivo: medio de cultivo suplemento con 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales, 1% (v / v) de piruvato de sodio, y 5% (v / v) husuero de hombre (por siRNA) o 20% (v / v) de suero humano (por plásmido), 2,5 ng / ml de PMA, y 50 mM β-mercaptoetanol; preparar un volumen final de cualquiera de 3 ml / muestra para una placa de 6 pocillos o 4 ml / muestra por dos placas de 12 pocillos. </li></ol></li><li> Suspensión de células se centrifuga durante 5 min a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Células Aspirar Accutase I y volver a suspender en 1 ml de medio RPMI precalentado a 37 ° C; contar las células para determinar el número de células. NOTA: Cuando se utilizan procedimientos de recuento de células automáticas rápidas, pasos 2.4 y 2.5 pueden ser omitidos y las células se pueden contar inmediatamente después de la separación, siempre que se evite la exposición prolongada a Accutase yo. </li><li> Para cada muestra de transfección preparar alícuotas en tubos de centrífuga que contienen 2,0 a 2,5 x 10 6 células. </li></ol> 3. Nucleofection de THP-1 macrófagos <ol><li> Centrifugar todos los alícuotas durante 10 min a 250 xg a temperatura ambiente. </li><li> Diluir el ADN plásmido o siRNA en libre de nucleasaagua o un tampón apropiado. Mantenga el volumen requerido de ADN de plásmido o siRNA tan pequeño como sea posible. </li><li> Preparar una cubeta Nucleofector ya sea con 1 g de siRNA o 0,5 g de ADN plasmídico para cada transfección. </li><li> Realice una transfección a la vez. Aspirar el sobrenadante de la alícuota de células. </li><li> Resuspender las células sedimentadas en solución de Nucleofector para producir un volumen total de 100 l de ADN / siRNA y solución de Nucleofector. Mantener el tiempo de exposición a la solución de Nucleofector pura a un mínimo y asegurar que el tiempo de exposición no exceda 15 min. </li><li> Mezclar células resuspendidas y ADN / siRNA en Nucleofector cubeta con unos golpecitos suaves. </li><li> Transfectar células mediante la realización de programa Y-001 en el dispositivo de Nucleofector 2b. </li><li> Transferir las células transfectadas en un vial de reacción utilizando pipetas Pasteur de plástico desechable. </li><li> Inmediatamente después, añadir 500 l de medio de transfección preparado. </li><li> Repita los pasos 3.4 a 3.9 para cada muestra de transfección. </li></ol><ol><li> Prepara ya sea de 6 pocillos o de 12 pocillos de células transfectadas. Pipetear 2,5 ml de medio de transfección en cada pocillo de una placa de 6 pocillos (1 así / transfección) o 1,75 ml de medio de transfección en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (2 pozos / transfección). </li><li> Mezclar las suspensiones de células a fondo con una micropipeta. </li><li> Transferencia de las células transfectadas en los pocillos preparados (ya sea un pocillo de una placa de 6 pocillos o dos en una placa de 12 pocillos). </li><li> Incubar las placas durante 4 horas en un incubador humidificado (5% de CO2, 37 ° C). </li><li> Compruebe la reinserción de las células al microscopio. NOTA: La mayoría de las células debe ser adherente de nuevo. Ocasionalmente, se extiende el período de incubación por 1 hr aumenta el número de células adherentes en caso de reinserción insuficiente. </li><li> Aspirar cuidadosamente medio de transfección con una micropipeta y reemplazar con la misma cantidad de medio de cultivo. Aspirar sólo un pozo a la vez. </li> &lt;li&gt; Se incuban las células para el período de tiempo requerido para un efecto máximo de plásmido o siRNA (24-72 h). Si los períodos de incubación superior a 48 horas, sustituya medio después de 48 hr. </li><li> Para el tratamiento adicional con efectores (por ejemplo., Citoquinas, agonistas, antagonistas e inhibidores) utilizan medio libre de suero sin PMA y β-mercaptoetanol. Tiempo final del período de incubación del efector con el tiempo de efecto máximo del plásmido o siRNA y planificar el cambio de medio y la adición del efector en consecuencia. No mantener las células en condiciones libres de suero durante más de 24 horas. </li></ol>

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Costos de publicación de este video-artículo son patrocinados por Lonza Group Ltd.

El protocolo descrito aquí presenta una forma fiable y eficiente para transfectar células THP-1 macrófagos que son generalmente bastante difícil para transfectar. La transfección se puede lograr con eficacias de transfección de por encima de 90% para siRNA sin una reducción significativa de la vitalidad celular. Eficiencias de plásmidos pueden ser menos debido a su tamaño, pero de transfección eficiencias de alrededor del 70% se puede lograr generalmente. La eficiencia de la caída siRNA mediada puede alcanzar de 80 a 90% dependiendo de la siRNA aplicada. Una gran ventaja de este protocolo es que no interfiere con la diferenciación celular. Después de la transfección, las células todavía responden normalmente al agente de diferenciación PMA (Figura 1A a 1B y la Figura 4) 12. Además polarización celular por estímulos tales como citoquinas IL10 o LPS / IFN no se ve afectada 12, aunque esto también depende fuertemente del medio seleccionado para el cultivo después de la transfección de uns se muestra en la Figura 4. Hay varias opciones dentro del procedimiento que puede ser modificado con el fin de adaptar el protocolo para los requisitos específicos. Como se muestra en la Figura 4 que las células reaccionan de manera diferente al mismo estímulo IL10 dependiendo del medio de cultivo seleccionado después de la transfección. Esto indica que la composición del medio tiene una fuerte influencia en el comportamiento celular. Como el efecto impuesto por el medio podría diferir para diversos estímulos experimentales, es posible que el medio óptimo podría cambiar y, por tanto, hay una necesidad de verificar la idoneidad del medio para diferentes experimentos de forma independiente. Sin embargo, el medio RPMI-1640, que es el medio predeterminado que se utiliza para el cultivo de las células THP-1, ha demostrado ser poco adecuados para el cultivo después de la transfección como se observó una pérdida significativa en la vitalidad celular. Además, el protocolo también se puede aplicar a monocitos THP-1 sin la diferenciación inducida por PMA antes de esto,obviamente, elimina la necesidad de que el desprendimiento de células durante el procedimiento, pero todos los pasos restantes no tienen que ser ajustado. Los monocitos THP-1 se pueden diferenciar después si es necesario. Los elementos más importantes del mismo son en primer lugar el desprendimiento y en segundo lugar el tiempo necesario para la transfección. La separación debe realizarse lo más suavemente posible, con el fin de mantener la viabilidad celular alta. Por lo tanto recomendamos el destacamento enzimática comparativamente leve por Accutase I sobre métodos muy agresivos como tripsinización. Se han encontrado, además, métodos de desprendimiento, tales como el tratamiento con lidocaína o raspar a ser bastante perjudicial y no deben utilizarse. En el caso de que 30 minutos de tratamiento Accutase no debería ser suficiente para separar todas las células adecuadamente esta suele ser una indicación de solución incorrectamente almacenados o expirado Accutase I o de demasiados ciclos de congelación-descongelación. Hemos obtenido buenos resultados mediante el almacenamiento de pequeñas alícuotas de Accutase I a -20 °C para reducir el número de ciclos de congelación-descongelación. Sin embargo cuando hay desprendimiento insuficiente reemplazar Accutase I con Accutase fresco o aumentar el tiempo de incubación de hasta 1 hr. Además golpecitos suaves o enjuague del matraz o placa puede ayudar a la separación. En cuanto el tiempo requerido para la transfección el tiempo de exposición de las células a la solución de Nucleofector pura tiene alto impacto en la supervivencia celular y por lo tanto debe ser tan corto como sea posible. La mejor manera de lograrlo es realizar cada transfección a la vez (pasos 2.10-2.15) y no varios transfecciones en paralelo. Si la eficiencia desmontables es baja, esto normalmente no es causada por la baja eficiencia de transfección, pero esto puede ser verificado fácilmente usando citometría de flujo o microscopía de fluorescencia y la etiqueta fluorescente siRNA o un plásmido que codifica GFP. Sobre todo la causa es un ADN plásmido siRNA o ineficiente. Bajo estas circunstancias se debe considerar para aumentar la cantidad de siRNA (hasta 2-3 mg) oplásmido de ADN (de hasta 1-2 mg) o utilizar un vector de expresión de siRNA o diferente si está disponible. Alternativamente, los resultados satisfactorios también podrían lograrse mediante el uso de un grupo de varias diferentes siRNAs dirigidos contra el mismo objetivo. Además, experimentos de tiempo podrían ser necesarias para determinar con precisión el período de efecto máximo, que normalmente se alcanza después de 24 a 72 h después de la transfección. Aparte de la transfección por electroporación hay más técnicas bien establecidas para la transfección de células de mamífero. Frecuentemente los sistemas aplicados son agentes de transfección químicos que pueden formar complejos con el ácido nucleico de carga y luego facilitar el transporte en las células. Los reactivos más comúnmente usados ​​están basados ​​en diferentes especies de lípidos o se pueden elegir entre una serie de polímeros catiónicos 3. Para ambos enfoques una selección diversa está disponible comercialmente. Estos reactivos de transfección ofrecen la ventaja de que son generalmentefácil de usar, no requieren mucho tiempo, y trabajar con células adherentes, así, eliminando así la necesidad de desapego. Desafortunadamente, los macrófagos son más bien difíciles de transfectar mediante estos métodos, ya que no proliferan significativamente in vitro y poseen mecanismos de defensa dirigidos contra el ADN citosólica extranjera 13-15. Por lo tanto, los enfoques de transfección química con frecuencia dan como resultado una grave reducción de la viabilidad celular. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2 hay agentes químicos de transfección que puede transferir con éxito siRNA en macrófagos, pero como citometría de flujo (Figura 2A) y microscópica fluorescente (Figura 2B) análisis indican que no logran alcanzar la misma distribución homogénea de siRNA dentro de las células como obtenido por Nucleofection. De hecho, los datos de citometría de flujo indican que se producen dos poblaciones diferentes de células transfectadas, en primer lugar con una población de fluorescencia similar al de las células después de Nucleofectien que se detecte y en segundo lugar hay una población con mayor intensidad de fluorescencia. Confirmación definitiva todavía es necesaria, pero se supone que la primera población se encuentra en la microscopía de fluorescencia idéntica a aquellas células que muestran una distribución homogénea de siRNA fluorescente en el citosol, mientras que la segunda población que corresponde a las células con aglomerados muy brillantes. Los datos de citometría de flujo que se muestra en la Figura 2A sugieren que los resultados nucleofection en menos siRNA por célula que el enfoque lipofección alternativa. Sin embargo, los datos de la Figura 3 muestra que incluso la comparativamente pequeña cantidad de siRNA incorporado por Nucleofection ya es suficiente para 80 a 90% caída del gen diana. Por lo tanto, la cantidad adicional de siRNA incorporado por la segunda población después de la transfección química es muy probable superávit y es por lo tanto más probabilidades de causar efectos secundarios no deseados que a mayor aumento de eficiencia desmontables. Aparte de esoformación de aglomerados intracelulares ya no es deseable en sí mismo ya que esas moléculas de siRNA no es probable funcional o al menos, menos eficientes que las moléculas de siRNA libres y pueden causar efectos puntuales de destino. Por otra parte la verdadera naturaleza de estos aglomerados no es todavía clara. Es posible que estos puntos brillantes representan los endosomas que indican que el ARNsi fue internalizada por las células, pero posteriormente libera de los endosomas fallado y el siRNA permanece atrapado y por lo tanto ineficaz. Alternativamente, los puntos pueden ser aglomerados que se forman intracelularmente. Evaluaciones funcionales de la transfección química están pendientes, por lo tanto, no hay conclusiones definitivas sobre la eficiencia desmontables se pueden hacer, sin embargo, sigue siendo la existencia de dos poblaciones distintas ya no es favorable, ya que esto significa que todos los resultados describen la media de ambas poblaciones, esto, por tanto, no corresponde a cualquiera de las poblaciones. Por esa razón Nucleofection es el enfoque superior. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; Sin embargo también existen limitaciones para el procedimiento de transfección descrito aquí. Dado que las células tienen que estar en suspensión para células adherentes nucleofection necesitan ser individual, que presenta un factor de tensión adicional a las células. Además todo el protocolo se consume bastante tiempo. Dado que las transfecciones no se puede realizar simultáneamente, pero tiene que realizarse rápidamente a fin de evitar el daño celular, el número de muestras está limitado a cerca de 8 - 10 por experimento. Por lo tanto, este protocolo no es adecuado para los proyectos de exploración de alto rendimiento. Para aplicaciones de alto rendimiento diferentes sistemas nucleofector están disponibles. En primer lugar, es el sistema 4D-Nucleofector que ofrece un formato de tira 16 también. Para aún mayor rendimiento, hay el sistema de traslado de 96 pocillos y 384 pocillos el sistema HT Nucleofector. Sin embargo, como estos nuevos sistemas trabajan con electrodos conductivos polímeros en lugar de aluminio y por lo tanto las condiciones eléctricas, es decir, programas y composition de la solución de Nucleofector, han cambiado en consecuencia, necesita ser determinado si nuestro protocolo se puede transferir a esos sistemas. Sin embargo, a pesar de estas limitaciones, el protocolo que aquí se presenta no producir una transfección fiable y eficaz de células THP-1, que es superior a todos los otros métodos no virales. Este protocolo permite la investigación de los efectos de la alteración de la expresión génica en células THP-1 que en todos los demás aspectos se diferencian y polarizar normalmente y por lo tanto muestran como pequeños efectos secundarios de transfección posible.

Entre los componentes celulares del sistema inmune humano, los macrófagos son de gran importancia para la respuesta inmune innata. Sus tareas son diversas; que están involucrados en la fagocitosis de patógenos y material necrótico, juegan un papel importante en la homeostasis del tejido y producen y secretan un gran número de citoquinas para regular y orquestar la respuesta inmune 1. Por lo tanto los macrófagos están implicados integralmente en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos condiciones. Debido a la diversidad de sus tareas, los macrófagos son un tipo de célula muy heterogéneo y multifacético. Esto se logra por diferentes polarizaciones; en función de los macrófagos estímulos externos puede desarrollar en diferentes fenotipos 2. Variabilidad e impacto macrófagos &#39;en la respuesta inmune hacen una investigación muy interesante tema. Con el fin de dilucidar su complejo de las funciones metabólicas y reguladoras, macrófagos apropiado en modelos in vitro son reqpedirá otra que refleja correctamente la heterogeneidad de los macrófagos y la variabilidad. La transfección de células con vectores de ADN plásmido o pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) con el fin de alterar la expresión génica celular se ha convertido en una herramienta ampliamente utilizada y de gran alcance en biología celular para investigar tanto la regulación génica y la función génica. Actualmente hay una gran selección de diferentes herramientas disponibles para la transfección de células eucariotas. Estas herramientas incluyen la aplicación de vectores virales, métodos mecánicos (tales como pistolas de genes), enfoques químicos (que se basan en polímeros o lípidos que pueden formar complejos con ácidos nucleicos), y la electroporación de las células 3. Todos estos enfoques tienen sus ventajas y desventajas y la elección de la más adecuada de esta amplia gama para un tipo específico de célula y la aplicación puede ser un proceso que consume tiempo y difícil. Los macrófagos son notoriamente difíciles de transfectar transfe como todos bien establecida casienfoques ction reducen drásticamente la viabilidad macrófagos &#39;o interfieren con su comportamiento, es decir, la diferenciación y en particular la polarización. Por lo tanto, se presenta aquí un protocolo eficiente, no viral para transfectar humanos THP-1 macrófagos utilizando la tecnología Nucleofector basado en electroporación, lo que representa un enfoque optimizado electroporación requieren cantidades reducidas de ADN. Nucleofection está bien adaptado para las células sensibles, como los monocitos y macrófagos. Este protocolo es una adaptación de las versiones publicadas previamente 4,5. En resumen, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) se utiliza para diferenciar humanos THP-1 monocitos durante 48 horas en macrófagos prematuros antes de la transfección con siRNA o ADN plásmido. Para la transfección de los macrófagos predifferentiated se separan enzimáticamente mediante el tratamiento Accutase I. La transfección se realiza utilizando un dispositivo 2b Nucleofector para la electroporación de las células. Después de la transfección, difierenciación se continúa durante otro 24 a 48 horas según sea necesario. Finalmente, los macrófagos maduros transfectadas se incuban con diferentes tipos de compuestos para los estudios funcionales. Este enfoque permite la transfección de líneas celulares tales como humanos THP-1 monocitos y macrófagos y se ha aplicado con éxito en el pasado 6-10. En contraste con la mayoría de los enfoques de transfección química, nuestro procedimiento Nucleofection modificado usando macrófagos prematuros produce altas eficiencias de transfección en combinación con la viabilidad celular intacta, sin la necesidad de utilizar vectores virales o añadir compuestos portadores adicionales con efectos secundarios desconocidos. Además, los macrófagos conservan su potencial de diferenciación, así como la polarización permitiendo así que las investigaciones funcionales sin obstáculos después de la transfección 11. Además, el medio de cultivo celular después de aplicado Nucleofection influye fuertemente en estudios funcionales siguiente transfection; En particular, la capacidad de los macrófagos &#39;para polarización puede verse afectada en función de medio de cultivo aplicado. Aquí cuatro diferentes tipos de medios de cultivo celular (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 y ratón T Cell medio Nucleofector) se pusieron a prueba en condiciones de desactivación mediante la interleucina (IL) 10 Uso de THP-1 macrófagos, se observó que la capacidad de respuesta celular a IL10 es más fuerte cuando se utiliza el medio de la célula T Nucleofector de ratón en comparación con el otro medio de cultivo mencionado anteriormente. Estos resultados demuestran que la optimización adecuada de todas las condiciones de cultivo celular es esencial para la transfección con éxito los estudios funcionales posteriores und ya que éstos pueden mejorar significativamente los resultados experimentales. Como los macrófagos están implicados en varias enfermedades humanas, mucha investigación se centra en la aclaración de comportamiento de los macrófagos, así como mecanismos reguladores que influyen en los macrófagos o a su vez controlados por los macrófagos. Por lo tanto, este protocolo es de relevancia enmuchas diferentes áreas de investigación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

Los macrófagos, como actores clave de la respuesta inmune innata, están en el foco de la investigación frente a la homeostasis del tejido o diversas patologías. La transfección con siRNA y el plásmido de ADN es una herramienta eficaz para el estudio de su función, pero la transfección de los macrófagos no es un asunto trivial. Aunque muchos enfoques diferentes para la transfección de células eucariotas están disponibles, sólo pocos permiten la transfección fiable y eficiente de los macrófagos, pero redujo la vitalidad celular y comportamiento de las células gravemente alterada como la capacidad disminuida para la diferenciación o la polarización se observan con frecuencia. Por lo tanto se requiere un protocolo de transfección que es capaz de transferir siRNA y ADN plásmido en macrófagos sin causar efectos secundarios graves, permitiendo así la investigación del efecto de la siRNA o plásmido en el contexto del comportamiento celular normal. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente para la transfección de humanos THP-1 macrófagos y Monocytes con alta vitalidad celular, alta eficiencia de transfección, y mínimos efectos sobre el comportamiento celular. Este enfoque se basa en Nucleofection y el protocolo se ha optimizado para mantener la capacidad máxima para la activación de células después de la transfección. El protocolo es adecuada para células adherentes después de la separación, así como células en suspensión, y se puede utilizar para pequeñas y medianas números de muestra. Por lo tanto, el método presentado es útil para la investigación de genes efectos reguladores durante la diferenciación de macrófagos y la polarización. Además de presentar los resultados que caracterizan macrófagos transfectados según este protocolo, en comparación con un método químico alternativo, también se discute el impacto del cultivo de células de selección medio después de la transfección en el comportamiento celular. Los datos presentados indican la importancia de la validación de la selección para los diferentes parámetros experimentales.

Usando este protocolo para la transfección de THP-1 macrófagos con siRNA por lo general alcanzar tasas de transfección de por encima de 90% sin una reducción significativa de la vitalidad celular. Figura 1 muestra los datos representativos que caracterizan el estado de las células 24 horas después de la transfección con ARNip marcado con fluorescencia frente a una no transfectadas de control, que no fueron tratados con reactivos nucleofection y el pulso o siRNA pero recibió todos los cambios de los medios de cultivo como muestras transfectadas. En la Figura 1A, la morfología celular se muestra de acuerdo con la medición de citometría de flujo. Las imágenes microscópicas se muestran en la Figura 1B Figuras 1C y 1D representan las tasas bajas para la apoptosis (control: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). Y necrosis (control: 2,0%; Nucleofection: 3,2%) que indican la vitalidad celular afectado. La necrosis y la apoptosis son ligeramente más altos para la muestra transfectadas como transfectadas THP-1 macrófagos son másdifíciles de separar que las células no transfectadas, por lo tanto la probabilidad de daño celular durante los aumentos de desprendimiento. Finalmente la eficiencia de transfección se presenta en la Figura 1E. Como toda la población transfectada se desplaza contra el control, esto indica que todas las células son transfectadas que se confirma por las imágenes microscópicas de fluorescencia (Figura 2B). Tanto el flujo de datos de citometría así como imágenes microscópicas de fluorescencia indican que todas las células son transfectadas de manera compatible con la distribución homogénea de siRNA entre las células, así como dentro de las células. Esto está en contraste con muchos reactivos de transfección químicos, para la comparación las Figuras 2A y 2B muestran los datos de citometría de flujo de fluorescencia respectivas y las imágenes microscópicas para un agente de transfección química usando un enfoque basado en lípidos. Estas cifras muestran que dos poblaciones distintas de células transfectadas pueden ser detectados. La primera población es similar a las células transfectadas Folloala Nucleofection. Se caracterizan por baja fluorescencia global y la distribución homogénea de ARNsi en las células. La segunda población está marcada por una fluorescencia más intensa que se origina a partir de aglomerados intracelulares muy brillantes de siRNA. La morfología celular se ve afectada por ambos enfoques de transfección como se muestra por contraste de interferencia diferencial en la Figura 2C. Las transfecciones utilizando rendimiento de ADN plásmido efectivamente resultados similares, por favor ejemplos se refieren a Robenek et al. (2009) 9 o Xie et al. (2006) 7. La elección del medio de cultivo celular después de la transfección es de gran relevancia; por lo tanto, diferentes medios de cultivo celular se ensayaron en comparación. Los medios de comunicación seleccionados son adecuados para el cultivo de las células THP-1 y fueron elegidos de acuerdo a las recomendaciones de Lonza como medios aplicables para post-Nucleofection cultivo. Figura 3 representa el MEDIAT siRNAed eficiencia desmontables mediante un siRNA dirigido contra IL10RB (interleuquina 10 receptor de la cadena β) mRNA. Para todos los medios ensayados la expresión de IL10RB se redujo significativamente hasta aproximadamente 10 a 20% del nivel de control (Figura 3). Sin embargo, las células transfectadas difieren dependiendo del medio de cultivo en su potencial de polarización. THP-1 macrófagos transfectadas ya sea con el control de siRNA inespecífico o IL10RB-siRNA fueron cultivadas en diferentes medios de comunicación después de la transfección y se tratan con IL10. Posteriormente, los niveles de expresión del gen SOCS3 inducida por IL10-(supresor de la señalización de citoquinas 3) en el nivel de mRNA se midieron por RT-qPCR. Las diferencias entre los medios de cultivo se producen en lo que respecta a la medida de la inducción de la expresión del ARNm de SOCS3 (Figura 4), ​​las inducciones para cada uno de los medios de comunicación a prueba de ratón de células T Nucleofector mediana, LGM3, X-VIVO 20 y IMDM eran 19,5 [17,7-21,5 ], 11,5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] y 7.2 [5.6 a 9.5] veces, respectivamente. Elaplicación refore del medio Nucleofector ratón de células T es vital. Además, las diferencias en el efecto de la caída de IL10RB sobre la expresión de SOCS3 después del tratamiento IL10 eran observables, los niveles de expresión de ARNm SOCS3 se redujeron a 9.5 [8.8 a 10.3] veces en medio de la célula T de ratón Nucleofector, 2.1 [1.1 a 4.1] pliegan en LGM3, 4.8 [3.2 a 7.2] veces en X-VIVO 20 y 3.3 [2.7 a 3.9] veces en IMDM. Estos valores corresponden a la reducción de la expresión SOCS3 en los diferentes medios de comunicación a 49%, 18%, 60% y 45%, respectivamente. Reducción de la expresión inducida por IL-SOCS3 10-después de la transfección de ARNsi IL10RB confirma la regulación a la baja con éxito de IL10RB por la transfección. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> Figura 1. Caracterización de transfectadas THP-1 macrófagos. El estado característico de las células no se ve afectada como se revela por microscopía óptica y análisis de citometría de flujo de co no transfectadascélulas de contro l frente a macrófagos THP-1 transfectadas según el protocolo presentado. THP-1 macrófagos se diferenciaron con 10 ng / ml de PMA durante 48 horas y se transfectaron con la etiqueta fluorescente (Alexa 488) de control no específica siRNA. 24 h después de la transfección ya sea imágenes de células vivas se tomaron (B), o las células fueron separadas por Accutase tratamiento I y se analizaron por citometría de flujo (A). La apoptosis y la necrosis tinción se realizó usando Anexina V-ficoeritrina (PE) (C) y 7-aminoactinomicina (7-AAD) (D). La eficiencia de transfección (E) se determinó por citometría de flujo utilizando la etiqueta de fluorescencia unida a la siRNA. La señal de fluorescencia de las células transfectadas (negro) se muestra en contra de la señal de control (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width = src &quot;4 pulgadas&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Figura 2: Comparación de la distribución intracelular de siRNA después Nucleofection frente lipofección. THP-1 células se diferenciaron durante 48 horas de acuerdo con este protocolo y luego transfectadas ya sea por Nucleofection o mediante lipofección. Los resultados de lipofección presentados se obtuvieron usando el kit de Xtremegene siRNA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con una relación de carga de reactivo para ARNsi de 4: 1. 24 h después de la transfección las células fueron separadas ya sea con Accutase I para el análisis de citometría de flujo o evaluó microscópicamente con células vivas. (A) La eficacia de transfección y distribución de siRNA por celda dentro de la población fue determinada por citometría de flujo utilizando la etiqueta fluorescente unido al siRNA, controles transfectadas sin siRNA se muestran en gris, muestras transfectadas con siRNA se muestran en negro. (B) Microscopía de fluorescenciaimágenes que muestran la distribución intracelular de la etiqueta fluorescente siRNA (Alexa Fluor 488); la barra de escala representa 40 micras. Diferencial imagen de contraste de interferencia correspondiente a la imagen de fluorescencia (C); la barra de escala representa 40 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> Desmontables de IL10RB Figura 3. ARNsi mediada transfectadas en células THP-1 macrófagos. Macrófagos THP-1 se transfectaron de acuerdo con el protocolo descrito. Después de la transfección las células fueron cultivadas en cuatro medios de cultura diferente, a saber Ratón T Cell medio Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C), y X-VIVO 20 (D), suplementados como se describe en la sección Protocolo. Cells fueron transfectadas ya sea con el control de siRNA inespecífico (Ctrl) o IL10RB-siRNA (IL10RB). Como controles adicionales se incluyeron las siguientes muestras: Regulador de impulsos, es decir. células que se sometieron a transfección en ausencia de siRNA (pulso), y un medio de control, es decir. las células que recibieron sólo los cambios de medios de cultivo, pero se quedaron sin tratar de otra manera. 24 h después de la transfección, las células se incubaron en medio libre de suero con o sin 50 ng / ml para más IL10 24 hr. Expresión IL10RB se midió por RT-qPCR; diagramas muestran la media de tres experimentos independientes, las barras de error representan el error estándar de la media; * P &lt;0,05; ** P &lt;0,01; *** P &lt;0,001 frente Ctrl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; Figura 4.-IL10 dependiente de regulación de SOCS3 después desmontables de IL10RB transfectadas en células THP-1 macrófagos. Macrófagos THP-1 se transfectaron de acuerdo con el protocolo descrito. Después de la transfección las células fueron cultivadas en cuatro diferentes medios de cultivo de células T de ratón medio Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C) y X-VIVO 20 (D) suplementado como se describe en la sección de Protocolo. Las células fueron transfectadas ya sea con el control de siRNA inespecífico (Ctrl) o IL10RB-siRNA (IL10RB). Como controles adicionales se incluyeron las siguientes muestras: Regulador de impulsos, es decir, las células que se sometieron a transfección en ausencia de siNRA (Pulso), y un medio de control, es decir. las células que recibieron sólo los cambios de medios de cultivo, pero se quedaron sin tratar de otra manera. 24 h después de la transfección, las células se incubaron en medio libre de suero con o sin 50 ng / ml para más IL10 24 hr. SOCS3 expresión se midió por RT-qPCR; diagramas muestran la media de tres experimentos independientes, las barras de error representan el error estándar de la media; *, # P &lt;0,05; **, ## P &lt;0,01; ***, ### P &lt;0,001 frente Ctrl y vs. Ctrl + IL-10, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Este protocolo presenta un método eficiente y fiable para transfectar humanos THP-1 macrófagos con siRNA o ADN plásmido por electroporación con una alta eficiencia de transfección mientras se mantiene alta la vitalidad celular y la capacidad de los macrófagos completo para la diferenciación y polarización.

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.2K vistas.  Friedrich Schiller University Jena.  Este protocolo presenta un método eficiente y fiable para transfectar humanos THP-1 macrófagos con siRNA o ADN plásmido por electroporación con una alta eficiencia de transfección mientras se mantiene alta la vitalidad celular y la capacidad de los macrófagos completo para la diferenciación y polarización. 

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Investigación

Inmunología e Infección

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...