Este procedimiento abordó la necesidad de una recolección de vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales simple y confiable, y de su aplicación en la traducción de la investigación. La recolección de vesículas extracelulares por centrifugación diferencial es simple, fácilmente escalable y reproducible, lo que será útil para el campo. Las vesículas extracelulares indistintas}de indistintas}células madre mesenquimales son una aplicación indistinta en los tratamientos modernos de enfermedades.
No tendré miedo a los errores. Esta operación es simple y fácil de aprender. Hay muchos detalles en este sencillo programa que se pueden presentar mejor a través del video.
Para empezar, cultive las células madre mesenquimales a más del 90% de confluencia. Reemplace el medio de cultivo en cada plato con 8 ml de alfa-MEM suplementado. Después de 48 horas de cultivo, las células deben cultivarse uniformemente para recolectar completamente el medio de cultivo en tubos de centrífuga de 50 ml.
Luego, centrifugar el medio de cultivo a 800 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a tubos cónicos de 1,5 ml para eliminar los fragmentos celulares y los desechos celulares. Centrifugar el sobrenadante a 16, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Utilice una pipeta para transferir la suspensión a tubos de ultracentrífuga. Luego, centrifugar a 150, 000 x g durante dos horas a cuatro grados centígrados. Resuspender el pellet de microvesícula en 50 uL de PBS por placa.
Deseche el sobrenadante y recoja el residuo, que son los exosomas. Resuspender los exosomas de siete placas de células en 50 uL de PBS. En un tubo de 15 mL, diluir 1 uL de vesículas extracelulares en 1, 499 uL de PBS y mezclar.
A continuación, inicie el software compatible para el analizador de seguimiento. Llene la celda de muestra con agua destilada y luego permita que el instrumento inicie la verificación de la celda. Calibre el instrumento con una solución estándar preparada.
Asegúrese de que el número de partículas que se muestra en la interfaz de detección de software esté entre 50 y 400, preferiblemente alrededor de 200, y haga clic en Aceptar. A continuación, enjuague la celda de muestra con 5 ml de agua destilada. Antes del análisis de la muestra, enjuague el canal con 1 ml de agua destilada.
Asegúrese de que el número de partícula que se muestra en la interfaz de detección de software sea inferior a 10. En un tubo cónico de 1,5 ml, resuspender las vesículas extracelulares con 250 uL de PBS. En otro tubo cónico de 1,5 ml, prepare la solución de trabajo del colorante PKH26.
Mezclar las vesículas extracelulares resuspendidas con la solución de trabajo. Deje reposar a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego agregue 500 uL de FBS agotado por EV para detener la reacción. Para microvesículas, centrifugar a 16, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Agregue 1 ml de PBS para enjuagar el residuo. Centrifugar de nuevo y desechar el sobrenadante para eliminar el tinte no unido.
Para microvesículas, centrifugar a 16, 000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Resuspender el residuo con 200 uL de PBS. Deje caer 20 uL de suspensión en el portaobjetos y obsérvelo bajo un microscopio de fluorescencia.
Resuspender vesículas extracelulares en 200 uL de PBS, y luego mezclar con solución de heparina en una proporción de volumen de 10:1. Coloque el ratón en el sistema de imágenes de la vena caudal. Presione el interruptor para levantar la palanca.
Con la ayuda de un ilustrador de venas de cola, realice una inyección sistemática de la suspensión de vesículas extracelulares a través de la vena de la cola. El análisis de la distribución del tamaño de partícula utilizando NTA demostró que el tamaño de los exosomas de las células madre mesenquimales humanas varió de 40 a 335 nm, con un tamaño máximo de aproximadamente 100 nm. Además, el tamaño de las microvesículas varió de 50 a 445 nm, con un tamaño máximo de 150 nm.
La caracterización morfológica de los exosomas mostró que exhibían una forma típica de copa. Las vesículas extracelulares fueron marcadas eficientemente por PKH26, que fue observado por la vista bruta como pellets marcados, así como por microscopía fluorescente. El operador debe prestar atención durante la recolección de sobrenadante, porque las células deben soplarse uniformemente para recolectar completamente los EV liberados retenidos en el indistinto de las células madre mesenquimales.
Para verificar el éxito de la inyección, se pueden realizar imágenes in vivo de la biodistribución de EV marcadas con fluorescencia o secciones congeladas de sitios específicos de tejido de injerto.
