Nuestra investigación se centra en el desarrollo de una terapia celular CAR lista para usar para infecciones fúngicas invasivas. Nuestro objetivo es identificar los mejores objetivos, diseños de CAR y combinación de células inmunitarias para lograr resultados terapéuticos óptimos. Los desarrollos recientes, incluido nuestro propio trabajo, se han centrado en el desarrollo de terapias de células T con CAR dirigidas a Aspergillus fumigatus.
Estas células modificadas han mostrado resultados prometedores en modelos preclínicos al reducir significativamente la carga fúngica, controlar la inmunidad antifúngica y mejorar la supervivencia general. Actualmente, la mayoría de las investigaciones en este campo se concentran en la producción de células T con CAR específicas para un conjunto muy limitado de objetivos, utilizando vectores virales o un sistema de transposones de la bella durmiente. Los principales desafíos consisten en identificar objetivos fúngicos óptimos y producir un producto celular listo para usar que sea eficaz y escalable para aplicaciones clínicas.
Con este protocolo, estamos abordando la necesidad de métodos rentables y escalables para generar células CAR-NK no virales. Proporciona un enfoque accesible para el cribado de nuevas dianas antifúngicas, lo que supone un paso fundamental hacia la terapia celular CAR-NK lista para usar en el tratamiento de las infecciones fúngicas. Para comenzar, revise las células NK-92 bajo el microscopio para ver si hay grupos en un fondo claro, agregue 2 mililitros de medio de cultivo celular por pocillo para cada condición en una placa de seis pocillos y coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Transfiera 8 veces 10 a la potencia de 6 celdas NK-92 a un tubo de fondo cónico de 15 mililitros y centrifugue el tubo a 200 G durante cinco minutos con una aceleración y desaceleración de 3. Después de desechar el sobrenadante, llene el tubo que contiene el pellet de celda con hasta 15 mililitros de PBS precalentado y vuelva a centrifugar. Durante la centrifugación, pipetee 8 microgramos de ADN plasmídico Af-CAR y 4 microgramos de minicírculo SB100X en un tubo de reacción y mantenga libre el ADN del segundo tubo para que sirva como control simulado.
Para el sistema de transfección, agregue 3 mililitros de tampón electrolítico en el primer tubo y colóquelo en la estación de pipetas. Después de la centrifugación, deseche suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón de resuspensión. A continuación, añada 100 microlitros de la suspensión celular en cada uno de los dos tubos de reacción y mezcle suavemente.
Pipetear la mezcla de células de ADN del primer tubo de reacción utilizando la pipeta del sistema de transfección, insertar la pipeta de transfección verticalmente en el tubo de la estación de pipetas. Ajuste el primer pulso a 1.650 voltios y el tiempo de pulso a 20 milisegundos antes de pulsar el botón de inicio para iniciar el pulso. Después del primer pulso, configure el segundo pulso a 500 voltios y el tiempo de pulso a 100 milisegundos e inicie el segundo pulso.
Una vez completado el segundo pulso, retire lentamente la pipeta de la estación de pipetas. Transfiera inmediatamente las células a un pocillo de la placa de cultivo preparada que contenga 2 mililitros de medio de cultivo celular precalentado y mueva suavemente la placa con un movimiento circular para distribuir uniformemente las células. Incubar la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.
Después de 30 minutos de incubación, agregue interleucina-2 a los pocillos a una concentración final de 150 unidades internacionales por mililitro. Para comenzar, transfecte las células NK-92 con el plásmido deseado. Transfiera las células a un tubo inferior cónico de 15 mililitros.
A continuación, centrifugar las células y diluirlas hasta una concentración de 1 a 2 veces 10 a la potencia de 6 células por cada 100 microlitros utilizando el tampón. Agregue un microlitro de biotina anti EGFR-T por 1 veces 10 a la potencia de 6 células y mezcle suavemente para asegurarse de que la solución se distribuya uniformemente. Incubar el tubo durante 25 minutos a 4 grados centígrados.
Después de la incubación, llene el tubo con hasta 10 mililitros de tampón. A continuación, centrifugar el tubo a 200 G durante cinco minutos con una aceleración y desaceleración de 3, y desechar el sobrenadante después de la centrifugación. Luego agregue 8 microlitros de tampón frío seguidos de dos microlitros de perlas magnéticas anti-biotina por 1 veces 10 a la potencia de 6 celdas.
Incubar el tubo durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Para lavar las células, llene el tubo con hasta 10 mililitros de tampón y centrífuga. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón.
Coloque una columna LS en el imán máximo y lávela con 3 mililitros de tampón. Agregue la suspensión de celda una vez que el búfer haya migrado completamente a través de la columna. Después de lavar la columna, retírela del imán y colóquela en un tubo inferior cónico limpio de 15 mililitros.
Añada 5 mililitros de tampón a la columna y utilice el émbolo para eliminar las células positivas de EGF-R lo más rápido posible. La eficiencia de la transfección después de la recuperación alcanzó del 10 al 20% y el enriquecimiento máximo aumentó la pureza de las células Af-CAR-NK-92 a más del 95%Para comenzar, obtenga células NK-92 enriquecidas que expresan transgenes utilizando la técnica de clasificación de células activadas magnéticamente. Luego prepare una suspensión de conidios de Aspergillus fumigatus a una concentración de 2,5 veces 10 a la potencia de 5 conidios por mililitro en el medio.
Dispense 100 microlitros de la suspensión de conidios en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos e incube la placa a 25 grados centígrados durante 16 horas. En el segundo día, lavar las células NK-92 simuladas y transfectadas con plásmidos dos veces con el medio y añadir 5 veces 10 a la potencia de 4 células NK-92 en 100 microlitros de medio por pocillo de la placa que contiene el hongo para el cocultivo. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono humidificada durante al menos 6 horas.
Después de centrifugar la placa a 300 G durante cinco minutos, coseche 100 microlitros de sobrenadante de cada pocillo sin tocar el fondo. Finalmente, transfiera los sobrenadantes a los tubos de reacción para realizar ELISA. Las células Af-CAR-NK-92 mostraron una secreción de interferón gamma significativamente mayor en comparación con las células NK-92 simuladas durante el cocultivo con tubos germinativos de aspergillus fumigatus.
