El alcance de nuestra investigación se centra principalmente en el desarrollo de células iPSC CAR NK humanas con una actividad antitumoral mejorada y persistencia in vivo para tratar mejor a diversas malignas. Con este novedoso protocolo de generación de CAR iPSC NK, nuestro objetivo es responder cómo estas células pueden superar la resistencia microambiental tumoral y mejorar la eficacia y garantizar una producción segura y escalable. Los principales desafíos experimentales en el desarrollo de células CAR NK derivadas de iPSC incluyen lograr una diferenciación consistente y eficiente de iPSC en funcionales en casos que garanticen una expresión estable de CAR sin efectos adversos y mejoren la persistencia in vivo.
Además, los investigadores se enfrentan a desafíos en cuanto a escalabilidad, rechazos inmunitarios y soportes regulatorios para aplicaciones clínicas. Hemos avanzado significativamente en la investigación de células CAR NK derivadas de iPSC mediante el establecimiento de una integración eficiente del gen CAR no viral mediante el uso de modificaciones génicas basadas en transposones. Además, hemos optimizado CRISPR-Cas9 a nivel de iPSC para eliminar los puntos de control inmunitario, los factores de TMA para mejorar la eficacia de las células y los casos y la persistencia in vivo en modelos de tumores sólidos.
Con nuestro protocolo que utiliza la expresión génica CAR mediada por vectores no virales, nuestro objetivo es abordar la brecha para el desarrollo de una modificación génica segura, eficiente y escalable para las células CAR NK iPSC, este método reduce el riesgo de mutagénesis insercional mejora la reproducibilidad y la rentabilidad de la generación de células CAR NK para la inmunoterapia contra el cáncer. En el futuro, nuestro laboratorio se centrará en el desarrollo de nuevas células NK derivadas de iPSC dirigidas a puntos de control inmunitario. También investigaremos el tratamiento de diversos factores microambientales tumorales mediante el uso de anticuerpos biespecíficos o triespecíficos para mejorar la especificidad in vivo, la persistencia y la actividad antitumoral.
Para comenzar el paso del cuerpo del embrión de espín o la formación de EB, aproximadamente 200.000 iPSC CAR diseñadas por pocillo en una placa precodificada de matriz de membrana basal de seis pocillos que contiene excedente de MT, incubar las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, después de dos días, eliminar el medio de cultivo y separar las células incubando con un mililitro de TrypLE Select precalentado a 37 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, disocie cuidadosamente los agregados de células en una suspensión de una sola célula y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue tres mililitros de PBS para detener la reacción de disociación.
A continuación, vuelva a suspender las células en medio MK SR-plus y fíltrelas a través de un colador de células de 70 micrómetros para eliminar los agregados. Centrifuga las células. Lave el pellet con cinco mililitros de PBS y luego vuelva a suspenderlos en un mililitro de medio de formación EB.
Después del recuento, diluya las células a la densidad adecuada utilizando un medio de formación de EB que contenga citocinas y un inhibidor de ROCK de 10 micromolares. Usando una pipeta multicanal, siembre de 3000 a 10.000 células por pocillo en 100 microlitros de medio EB en una placa de 96 pocillos. Centrifugar las células a 300 g durante cinco minutos e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante seis días.
Para verificar la calidad corporal del embrión, primero prepare cuatro mililitros de tripsina 0,25% precalentado con suero de pollo 0,4% para disociar los EB. después de seis días, transfiera de 10 a 30 EB a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue la solución de suero de pollo de tripsina a los EB e incube en un baño de agua.
Vórtice de los EB durante la disociación cada tres a cinco minutos durante 10 minutos. Pipetear los EB tripsinizados mezclándolos hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una disociación completa. A continuación, añade cinco mililitros de PBS para detener el proceso de tripsinización.
Filtre la solución celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un nuevo tubo cónico. A continuación, centrifugue las células a 300 g durante cinco minutos y vuelva a suspender el pellet en tres a cinco mililitros de medio EB fresco. Después de contar, tiña las células con marcadores EB típicos.
Añadir el volumen recomendado de anticuerpos a cada tubo que contenga células individuales disociadas de EB en 100 microlitros de tampón de flujo e incubar en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células dos veces con tampón de flujo. Agregue la tinción de muertos vivos azules SYTOX y analice mediante análisis de citometría de flujo.
Comience codificando cada pocillo de una placa de seis pocillos con cinco a 10 microlitros de una solución de gelatina esterilizada al 2%. Incube la placa a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, aspire cualquier solución de gelatina restante y agregue tres mililitros del asesino natural o medio de diferenciación NK que contenga citocinas a cada pocillo de la placa de seis pocillos recubierta de gelatina.
A continuación, con una pipeta de un mililitro, transfiera con cuidado los EB de espín derivados de las iPSC CAR diseñadas a un plato de 10 centímetros. Agregue tres mililitros de medio de diferenciación NK que contenga citocinas a cada pocillo de la placa de seis pocillos. Con una micropipeta de un mililitro, se distribuyen de 16 a 20 EB en cada pocillo de la placa de seis pocillos y se incuban a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres o cuatro semanas.
Después de la incubación, evalúe la expresión de los marcadores de células NK CD45 positivos y CD56 positivos mediante citometría de flujo en células en suspensión. Cuando más del 80% de las células en suspensión expresan CD45 positivo y CD56 positivo. Recoja las células pasándolas a través de un filtro de 70 micrómetros para eliminar los grumos.
Antes de co-cultivar células presentadoras de antígenos artificiales o APC artificiales dentro de células NK, irradiar las APC artificiales con 100 gray y conservarlas como tallos congelados. Después de recolectar células NK, cultivarlas a una densidad de cinco veces 10 a una potencia de cinco células por mililitro en un medio de expansión NK suplementado con 50 unidades por mililitro de interleucina-2 e interleucina-15. Agregue APC artificiales irradiadas descongeladas a las células NK en una proporción de uno a uno e incube a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Para comenzar, encienda el citómetro de flujo. Evaluar la expresión del receptor de activación NK en las células NK derivadas de iPSC CAR anti GPC3 para determinar la actividad de la célula CAR case y el estado de maduración. Para los ensayos de Caspasa-3/7.
Cuente las células objetivo en células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC y téngalas previamente con el colorante violeta CellTrace a una concentración final de cinco micromolares en PBS bajo protección lumínica durante 15 minutos a 37 grados Celsius. Lave las células diana de la tinción en un medio de cultivo completo antes del cocultivo con células NK derivadas de iPSC con CAR en varias proporciones efectora-objetivo a 37 grados Celsius. Después de tres horas y 30 minutos de co-cultivo.
Agregue el reactivo de detección verde Caspasa-3/7 e incube durante otros 30 minutos. Agregue la solución de tinción de células muertas SYTOX durante los últimos cinco minutos de tinción y mezcle suavemente. Analice las células teñidas mediante citometría de flujo.
La formación de EBs de espín a partir de IPCs diseñados por GPC3 CAR se observó en el sexto día. Confirmando la diferenciación temprana. Las células asesinas naturales o NK diferenciadas de las GPC3 CAR IPC mostraron una morfología distinta en varias etapas desde el día tres hasta el día 28.
El análisis de citometría de flujo demuestra la expresión de los antígenos hematopoyéticos CD34 y CD31, así como una pequeña cantidad de CD43, pero aún no expresa CD45 tanto en el tipo salvaje como en las iPSC de CAR GPC3 derivadas de espín EB en el sexto día. En caso específico, se detectaron marcadores en el tipo salvaje maduro en células NK derivadas de GPC3 CAR, iPSC, el día 35. Confirmando la diferenciación exitosa en células NK.
Las células NK derivadas de iPSC CAR de tipo salvaje expandido y anti GPC3 CAR exhibieron varios marcadores de activación, lo que demuestra la maduración de las células NK. La expresión del antígeno GPC3 se confirmó en líneas celulares tumorales mediante citometría de flujo, validando la especificidad del objetivo para las células NK derivadas de iPSC anti GPC3 CAR. Las células NK derivadas de iPSC CAR anti GPC3 demostraron una mayor actividad citotóxica contra las líneas celulares HepG2, SNU-449, CAL 27 y SKOV3 que expresan GPC3 en comparación con las células NK iPSC de tipo salvaje.
