우리의 연구는 침습성 진균 감염에 대한 기성품 CAR 세포 치료제 개발에 중점을 두고 있습니다. 우리는 최적의 치료 결과를 달성하기 위해 최상의 표적, CAR 설계 및 면역 세포 조합을 식별하는 것을 목표로 합니다. 자체 연구를 포함한 최근의 개발은 아스페르길루스 푸미가투스를 표적으로 하는 CAR T 세포 치료제 개발에 중점을 두고 있습니다.
이러한 조작된 세포는 전임상 모델에서 진균 부담을 크게 줄이고 항진균 면역을 제어하며 전체 생존을 개선함으로써 유망한 결과를 보여주었습니다. 현재 이 분야의 대부분의 연구는 바이러스 벡터 또는 수면 미용 전이 시스템을 사용하여 매우 제한된 표적 세트에 특이적인 CAR T 세포를 생산하는 데 집중되어 있습니다. 주요 과제는 최적의 진균 표적을 식별하고 임상 응용 분야에 효과적이고 확장 가능한 즉시 사용 가능한 세포 제품을 생산하는 것입니다.
이 프로토콜을 통해 비바이러스 CAR-NK 세포를 생성하기 위한 비용 효율적이고 확장 가능한 방법에 대한 필요성을 해결하고 있습니다. 이는 새로운 항진균 표적을 스크리닝하기 위한 접근 가능한 접근 방식을 제공하여 진균 감염에 대한 기성품 CAR-NK 세포 요법을 향한 근본적인 단계를 제공합니다. 시작하려면 현미경으로 NK-92 세포에 깨끗한 배경의 클러스터가 있는지 확인하고, 각 조건에 대해 웰당 2ml의 세포 배양 배지를 6웰 플레이트에 추가한 다음 플레이트를 5%의 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣습니다.
6개의 NK-92 세포의 전원으로 8 곱하기 10을 15ml 원뿔형 바닥 튜브에 넣고 200G에서 튜브를 3의 가속 및 감속으로 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버린 후 세포 펠릿이 들어있는 튜브에 최대 15ml의 예열 된 PBS를 채우고 다시 원심 분리기를 사용하십시오. 원심분리 중에 8마이크로그램의 Af-CAR 플라스미드 DNA와 4마이크로그램의 SB100X 미니서클을 하나의 반응 튜브에 피펫팅하고 두 번째 튜브 DNA를 모의 대조군 역할을 할 수 있도록 자유롭게 유지합니다.
transfection 시스템의 경우 첫 번째 튜브에 3ml의 전해 완충액을 추가하고 피펫 스테이션에 넣습니다. 원심분리 후, 상층액을 부드럽게 버리고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 재현탁액에 재현탁액에 재현탁합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 세포 현탁액을 두 개의 반응 튜브 각각에 넣고 부드럽게 혼합합니다.
transfection system 피펫을 사용하여 첫 번째 반응 튜브로부터 DNA 세포 혼합물을 피펫팅하고, 피펫 스테이션의 튜브에 수직으로 transfection 피펫을 삽입합니다. 첫 번째 펄스를 1, 650볼트로 설정하고 펄스 시간을 20밀리초 동안 설정한 후 start를 눌러 펄스를 시작합니다. 첫 번째 펄스 후 두 번째 펄스를 500볼트로 설정하고 펄스 시간을 100밀리초로 설정하고 두 번째 펄스를 시작합니다.
두 번째 펄스가 완료되면 피펫 스테이션에서 피펫을 천천히 제거합니다. 즉시 2ml의 예열된 세포 배양 배지가 들어 있는 준비된 배양 플레이트의 한 웰로 세포를 옮기고 플레이트를 원을 그리며 부드럽게 움직여 세포를 고르게 분포시킵니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 플레이트를 5%의 이산화탄소로 배양합니다.
30분의 배양 후 인터루킨-2를 밀리리터당 150 국제 단위의 최종 농도로 웰에 첨가합니다. 먼저 NK-92 세포를 원하는 플라스미드로 transfection합니다. 세포를 15ml 원추형 바닥 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 세포를 원심 분리하고 완충액을 사용하여 100 마이크로 리터 당 6 세포의 힘으로 1-2 곱하기 10의 농도로 희석합니다. 6개 세포의 거듭제곱에 10 곱하기 10당 1마이크로리터의 항 EGFR-T 비오틴을 추가하고 용액이 고르게 분포되도록 부드럽게 혼합합니다. 섭씨 4도에서 25분 동안 튜브를 배양합니다.
배양 후 튜브에 최대 10ml의 완충액을 채웁니다. 다음으로 튜브를 200G에서 가감속 3으로 5분간 원심분리하고 원심분리 후 상층액을 버립니다. 그런 다음 8마이크로리터의 콜드 버퍼를 추가한 다음 6개 세포의 거듭제곱에 10을 곱하기 당 2마이크로리터의 항비오틴 마그네틱 비드를 추가합니다.
튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 세포를 세척하려면 튜브에 최대 10ml의 완충액과 원심분리기를 채웁니다. 상층액을 버린 후 500마이크로리터의 완충액에 세포를 재현탁합니다.
최대 자석에 LS 컬럼을 넣고 3ml의 버퍼로 세척합니다. 버퍼가 컬럼을 통해 완전히 마이그레이션된 후 cell suspension을 추가합니다. 컬럼을 세척한 후 자석에서 컬럼을 제거하고 깨끗한 15ml 원추형 바닥 튜브에 넣습니다.
컬럼에 5ml의 완충액을 추가하고 플런저를 사용하여 EGF-R 양성 세포를 최대한 빨리 씻어냅니다. 회수 후 형질주입 효율은 10-20%에 도달하고 최대 농축으로 Af-CAR-NK-92 세포 순도가 95% 이상으로 증가먼저 자기 활성화 세포 분류 기술을 사용하여 농축된 전이유전자 발현 NK-92 세포를 얻습니다. 그런 다음 배지에서 밀리리터당 5 코니디아의 거듭제곱에 대해 2.5 곱하기 10의 농도로 Aspergillus fumigatus conidia 현탁액을 준비합니다.
100마이크로리터의 분생포자 현탁액을 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 분배하고 플레이트를 섭씨 25도에서 16시간 동안 배양합니다. 2일차에 모의 세포와 플라스미드 형질주입된 NK-92 세포를 배지로 2회 세척하고 곰팡이가 포함된 플레이트의 웰당 배지 당 100마이크로리터의 배지에 4개의 NK-92 세포의 거듭제곱에 5배의 10을 추가하여 공동 배양합니다. 섭씨 37도의 가습 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 최소 6시간 동안 배양합니다.
플레이트를 300G에서 5분 동안 원심분리한 후 바닥을 건드리지 않고 각 웰에서 100마이크로리터의 상층액을 수확합니다. 마지막으로 상등액을 반응 튜브로 옮겨 ELISA를 수행합니다. Af-CAR-NK-92 세포는 aspergillus fumigatus 생식관과의 공동 배양 동안 모의 NK-92 세포에 비해 훨씬 더 높은 인터페론 감마 분비를 보여주었습니다.
