En este trabajo, describimos un protocolo que utiliza el software SciGlass para segmentar datos de tomografía crioelectrónica. SciGlass es un software basado en realidad virtual que proporciona una interfaz inmersiva e intuitiva para segmentar telegramas crio-ET, demostramos que VR es una herramienta viable que se puede integrar en las tuberías de segmentación de crio-ET. Cryo-ET está avanzando rápidamente con, ya sabes, innovaciones y enfocado.
En el caso de muestras más delgadas y métodos de recolección de datos más rápidos, y el uso de algoritmos de aprendizaje automático para mejorar la selección de partículas segmentadas, todos estos avances culminan en una mejor crio-ET y la adopción de conocimientos biológicos realmente excelentes. Cryo-ET se enfrenta a desafíos como la crioterapia de bajo rendimiento. Para muestras de más de 500 nanómetros de grosor y dificultad para apuntar a regiones de interés debido al bajo número de copias.
Además, el procesamiento de datos sigue siendo un cuello de botella, que requiere una extensa anotación manual para la selección y segmentación de partículas, junto con la experiencia especializada que se necesita en crio-ET, por lo que todo ralentiza el flujo de trabajo general. Hemos descubierto que la realidad virtual mejora la eficiencia de la segmentación en comparación con los métodos tradicionales. Su entorno inmersivo complementa los enfoques automatizados al llenar los vacíos y reducir los falsos positivos.
Además, esta plataforma de realidad virtual es muy eficaz para la formación y la educación, lo que la convierte en una herramienta versátil en el análisis de datos crio-ET. Nuestro protocolo aborda la ineficiencia de la segmentación tradicional, que incluye procesos manuales y lentos y difíciles, por lo que al aprovechar, ya sabe, la naturaleza inmersiva e intuitiva de la realidad virtual, nuestro objetivo es agilizar la segmentación haciendo que el proceso sea más rápido y fácil de usar. Para empezar, convierta los tomogramas crio-ET en bruto a un formato de datos compatible con SciGlass, como pilas TIFF.
Ajuste la señal con ImageJ para asegurarse de que las partículas sean blancas sobre negras. Vaya a Proceso, seguido de Mejorar contraste, y marque Ecualizar histograma y Procesar todos los sectores. Inicie el software de realidad virtual en la computadora.
Vaya al menú "Archivo" y seleccione Crear proyecto. Haga clic en Crear nuevo proyecto y, a continuación, en Agregar archivos" en el software. Vaya a la ubicación de los archivos TIFF e impórtelos en el proyecto.
Cuando se le solicite, confirme que los archivos no forman parte de una serie temporal después de hacer clic en No.Siguiente, asigne un nombre al proyecto y haga clic en Guardar" para crear el proyecto en la lista de proyectos. Haga doble clic en el proyecto para abrir el tomograma y cargarlo en el entorno interactivo de realidad virtual. Para configurar la realidad virtual, o VR, conecte el casco VR y los controladores de mano a la computadora.
Siga las instrucciones en pantalla para calibrar el entorno de realidad virtual. Ajuste el sistema para asegurarse de que el área deseada para la segmentación esté en el campo de visión del entorno de realidad virtual, luego haga clic en el botón de visualización en la interfaz del software. Ajuste las opciones de visualización, como el contraste, las ventanas, el brillo y los controles deslizantes de umbral para mejorar la señal y minimizar el ruido.
Utilice los controladores manuales para acercar el tomograma o alejarlo para un mejor examen. Active la herramienta de corte con el controlador de la mano izquierda. Inspeccione visualmente diferentes cortes dentro del tomograma.
Navegue a través del tomograma hasta el corte deseado donde comenzará la segmentación. Active la opción de región de interés, o ROI, en el menú de anotaciones utilizando los controladores manuales. Aparecerá un recuadro verde en el tomograma.
Ajuste el tamaño y la posición del cuadro verde al área a segmentar. Ahora, bloquee el ROI con el controlador de la mano izquierda. La herramienta cambiará al modo de pintura para la segmentación.
Acérquese o aléjese del tomógrafo para una segmentación precisa. Ajuste el tamaño del pincel con rotaciones en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj para un control óptimo. Segmente cuidadosamente la región de interés, como las membranas mitocondriales, dentro del área tridimensional.
Ajuste el radio de la bola adecuadamente mientras realiza la segmentación. Active el modo de borrado mediante el desencadenador del controlador secundario para corregir errores de segmentación y utilice el mismo movimiento que la segmentación para borrar. Repita el proceso de segmentación para todas las regiones hasta que el tomograma esté completamente segmentado.
Después de completar la segmentación, haga clic en el proyecto completado para resaltarlo. Haga clic en la pestaña "Proyectos" y seleccione ROI" para continuar. Elija exportar todo el volumen o una región específica de interés y especifique la ubicación de exportación para los datos segmentados.
Ahora, cargue y analice los datos segmentados exportados de SciGlass en el software deseado de su elección para un análisis adicional de los datos segmentados. Después de preparar los datos de crio-ET, haga clic con el botón derecho en el proyecto y haga clic en Agregar datos de máscara, luego navegue hasta donde se guarda la segmentación inicial e impórtela en el mismo proyecto. Activar la anotación de ROI para realizar ediciones en la segmentación inicial.
Por último, agregue o borre la segmentación para limpiar la segmentación inicial. La retroproyección ponderada de tomografías reconstruidas a 16 angstroms por píxel reveló estructuras mitocondriales y membranosas después de la eliminación de ruido y la corrección de cuña faltante. La visualización en un entorno inmersivo de realidad virtual permitió una inspección 3D detallada de las membranas después de que la ecualización del histograma mejorara el contraste.
La segmentación manual delineó estructuras mitocondriales y de orgánulos con alta precisión utilizando herramientas de realidad virtual, incluido el mapeo preciso de los límites de la membrana y los ROI. Las representaciones finales en 3D revelaron características mitocondriales detalladas, como las membranas externas e internas. Y depósitos de fosfato cálcico con mallas alisadas.
