В данной работе мы описываем протокол, который использует программное обеспечение SciGlass для сегментации данных криоэлектронной томографии. SciGlass — это программное обеспечение на основе виртуальной реальности, которое предоставляет иммерсивный и интуитивно понятный интерфейс для сегментации крио-ET телеграмм, мы демонстрируем, что VR является жизнеспособным инструментом, который может быть интегрирован в конвейеры сегментации крио-ET. Cryo-ET быстро развивается, знаете ли, с инновациями и фокусом.
Для более тонких образцов и более быстрых методов сбора данных, а также использования алгоритмов машинного обучения для улучшения сегментированного отбора частиц, все эти достижения приводят к улучшению крио-ET и принятию действительно великих биологических знаний. Cryo-ET сталкивается с такими проблемами, как криотерапия с низкой пропускной способностью. Для образцов толщиной более 500 нанометров и трудностями нацеливания на области интереса из-за малого числа копий.
Кроме того, обработка данных остается узким местом, требующим обширного ручного аннотирования для отбора и сегментации частиц, наряду со специализированными знаниями, которые вам нужны в крио-ЭТ, поэтому все это замедляет общий рабочий процесс. Мы обнаружили, что виртуальная реальность повышает эффективность сегментации по сравнению с традиционными методами. Его иммерсивная среда дополняет автоматизированные подходы, заполняя пробелы и сокращая количество ложных срабатываний.
Кроме того, эта платформа виртуальной реальности очень эффективна для обучения и образования, что делает ее универсальным инструментом для анализа данных крио-ЭТ. Наш протокол устраняет неэффективность традиционной сегментации, которая включает в себя ручные и медленные, сложные процессы, поэтому, используя иммерсивную и интуитивную природу виртуальной реальности, мы стремимся оптимизировать сегментацию, делая процесс более быстрым и удобным для пользователя. Для начала преобразуйте необработанные томограммы крио-ЭТ в формат данных, совместимый с SciGlass, например, в стопки TIFF.
Установите сигнал с помощью ImageJ, чтобы убедиться, что частицы имеют белый цвет на черном. Перейдите в раздел «Обработать», затем «Усилить контраст» и отметьте «Выровнять гистограмму» и «Обработать все срезы». Запустите программное обеспечение виртуальной реальности на компьютере.
Перейдите в меню «Файл» и выберите «Создать проект». Нажмите на кнопку «Создать новый проект», а затем на кнопку «Добавить файлы» в программе. Перейдите к расположению файлов TIFF и импортируйте их в проект.
При появлении запроса убедитесь, что файлы не являются частью временного ряда, после нажатия кнопки «Далее», назначьте имя проекту и нажмите «Сохранить», чтобы создать проект в списке проектов. Дважды кликните по проекту, чтобы открыть томограмму и загрузить ее в интерактивную среду виртуальной реальности. Чтобы настроить виртуальную реальность (VR), подключите гарнитуру VR и ручные контроллеры к компьютеру.
Следуйте инструкциям на экране, чтобы откалибровать среду виртуальной реальности. Настройте систему так, чтобы желаемая область для сегментации находилась в поле зрения VR-среды, затем нажмите кнопку визуализации в интерфейсе программного обеспечения. Настройте параметры визуализации, такие как контрастность, оконное оформление, яркость и ползунки пороговых значений, чтобы усилить сигнал и свести к минимуму шум.
С помощью ручных контроллеров притяните томограмму ближе или отодвиньте ее для лучшего обследования. Активируйте режущий инструмент с помощью левого контроллера. Визуально осмотрите различные срезы в пределах томограммы.
Перейдите по томограмме к нужному срезу, где начнется сегментация. Активируйте опцию «Область интереса» (ROI) в меню аннотаций с помощью ручных контроллеров. На томограмме появится зеленая рамка.
Отрегулируйте размер и положение зеленого прямоугольника в соответствии с областью, которую нужно сегментировать. Теперь заблокируйте ROI с помощью левого контроллера. Инструмент переключится в режим рисования для сегментации.
Увеличивайте или уменьшайте масштаб томографа для точной сегментации. Отрегулируйте размер кисти с помощью поворотов по часовой стрелке или против часовой стрелки для оптимального контроля. Тщательно сегментируйте интересующую область, такую как митохондриальные мембраны, в трехмерной области.
Соответствующим образом отрегулируйте радиус шарика во время выполнения сегментации. Включите режим стирания с помощью вторичного триггера контроллера для исправления ошибок сегментации и используйте то же движение, что и сегментация, для стирания. Повторяйте процесс сегментации для всех областей до тех пор, пока томограмма не будет полностью сегментирована.
После завершения сегментации нажмите на завершенный проект, чтобы выделить его. Нажмите на вкладку «Проекты» и выберите «ROIs», чтобы продолжить. Выберите экспорт всего объема или определенной области интереса и укажите место экспорта сегментированных данных.
Теперь загрузите и проанализируйте экспортированные сегментированные данные из SciGlass в нужное программное обеспечение для дополнительного анализа сегментированных данных. После подготовки данных cryo-ET щелкните правой кнопкой мыши по проекту и выберите «Добавить данные маски», затем перейдите к месту сохранения исходной сегментации и импортируйте ее в тот же проект. Используйте аннотацию ROI, чтобы внести изменения в первоначальную сегментацию.
Наконец, добавьте или удалите сегментацию, чтобы очистить исходную сегментацию. Взвешенная обратная проекция томограмм, реконструированных с частотой 16 ангстрем на пиксель, выявила митохондриальные и пленчатые структуры после устранения шума и коррекции отсутствующего клина. Визуализация в иммерсивной среде виртуальной реальности позволила провести детальный 3D-осмотр мембран после того, как выравнивание гистограммы усилило контрастность.
Ручная сегментация с высокой точностью определила структуры митохондрий и органелл с использованием инструментов виртуальной реальности, включая точное картирование границ мембран и ROI. Окончательная 3D-визуализация выявила подробные митохондриальные особенности, такие как внешние и внутренние мембраны. И отложения фосфата кальция с разглаженными сетками.
