Dans ce travail, nous décrivons un protocole qui utilise le logiciel SciGlass pour segmenter les données de cryo-tomographie électronique. SciGlass est un logiciel basé sur la réalité virtuelle qui fournit une interface immersive et intuitive pour segmenter les télégrammes cryo-ET, nous démontrons que la VR est un outil viable qui peut être intégré dans les pipelines de segmentation cryo-ET. Cryo-ET progresse rapidement avec, vous savez, des innovations et des concentrations.
Pour des échantillons plus minces et des méthodes de collecte de données plus rapides, et l’utilisation d’algorithmes d’apprentissage automatique pour améliorer la sélection de particules segmentées, vous savez, toutes ces avancées aboutissent à une meilleure cryo-ET et à l’adoption de très grandes informations biologiques. Cryo-ET est confronté à des défis tels que la cryo à faible débit. Pour les échantillons d’une épaisseur supérieure à 500 nanomètres et la difficulté à cibler les régions d’intérêt en raison du faible nombre de copies.
De plus, le traitement des données reste un goulot d’étranglement, nécessitant une annotation manuelle approfondie pour le prélèvement et la segmentation des particules, ainsi qu’une expertise spécialisée, vous savez, dont vous avez besoin en cryo-ET, de sorte que tout cela ralentit le flux de travail global. Nous avons constaté que la réalité virtuelle améliore l’efficacité de la segmentation par rapport aux méthodes traditionnelles. Son environnement immersif complète les approches automatisées en comblant les lacunes et en réduisant les faux positifs.
De plus, cette plate-forme VR est très efficace pour la formation et l’éducation, ce qui en fait un outil polyvalent dans l’analyse de données cryo-ET. Notre protocole s’attaque à l’inefficacité de la segmentation traditionnelle, qui comprend des processus manuels et lents et difficiles, donc en tirant, vous savez, la nature immersive et intuitive de la réalité virtuelle, nous visons à rationaliser la segmentation en rendant le processus plus rapide et plus convivial. Pour commencer, convertissez les tomogrammes cryo-ET bruts dans un format de données compatible avec SciGlass, tel que les piles TIFF.
Réglez le signal à l’aide d’ImageJ pour vous assurer que les particules sont blanches sur noires. Accédez à Traiter, puis à Améliorer le contraste, puis cochez Égaliser l’histogramme" et Traiter toutes les tranches. Lancez le logiciel de réalité virtuelle sur l’ordinateur.
Accédez au menu Fichier" et sélectionnez Créer un projet. Cliquez sur Créer un nouveau projet, puis sur Ajouter des fichiers" dans le logiciel. Naviguez jusqu’à l’emplacement des fichiers TIFF et importez-les dans le projet.
Lorsque vous y êtes invité, vérifiez que les fichiers ne font pas partie d’une série chronologique après avoir cliqué sur Non.Suivant, attribuez un nom au projet et cliquez sur Enregistrer" pour créer le projet dans la liste des projets. Double-cliquez sur le projet pour ouvrir le tomogramme et le charger dans l’environnement interactif de réalité virtuelle. Pour configurer la réalité virtuelle, ou VR, connectez le casque VR et les manettes à l’ordinateur.
Suivez les instructions à l’écran pour calibrer l’environnement VR. Ajustez le système pour vous assurer que la zone souhaitée pour la segmentation se trouve dans le champ de vision de l’environnement VR, puis cliquez sur le bouton de visualisation dans l’interface du logiciel. Ajustez les options de visualisation telles que le contraste, le fenêtrage, la luminosité et les curseurs de seuil pour améliorer le signal et minimiser le bruit.
Utilisez les manettes pour rapprocher le tomogramme ou le repousser pour un meilleur examen. Activez l’outil de coupe à l’aide de la manette gauche. Inspectez visuellement les différentes tranches du tomogramme.
Naviguez dans le tomogramme jusqu’à la tranche souhaitée où la segmentation commencera. Activez l’option de région d’intérêt, ou ROI, dans le menu d’annotation à l’aide des manettes. Une boîte verte apparaîtra sur le tomogramme.
Ajustez la taille et la position de la boîte verte à la zone à segmenter. Maintenant, verrouillez le retour sur investissement à l’aide de la manette de gauche. L’outil passera en mode peinture pour la segmentation.
Zoomez ou dézoomez sur le tomographe pour une segmentation précise. Ajustez la taille du pinceau avec des rotations dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour un contrôle optimal. Segmentez soigneusement la région d’intérêt, telle que les membranes mitochondriales, dans la zone tridimensionnelle.
Ajustez le rayon de la balle de manière appropriée tout en effectuant la segmentation. Activez le mode d’effacement à l’aide du déclencheur du contrôleur secondaire pour corriger les erreurs de segmentation et utilisez le même mouvement que la segmentation pour effacer. Répétez le processus de segmentation pour toutes les régions jusqu’à ce que le tomogramme soit entièrement segmenté.
Une fois la segmentation terminée, cliquez sur le projet terminé pour le mettre en surbrillance. Cliquez sur l’onglet « Projets » et sélectionnez ROI » pour continuer. Choisissez d’exporter l’intégralité du volume ou une région d’intérêt spécifique, puis spécifiez l’emplacement d’exportation des données segmentées.
Maintenant, chargez et analysez les données segmentées exportées de SciGlass dans le logiciel de votre choix pour une analyse supplémentaire des données segmentées. Après avoir préparé les données cryo-ET, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le projet et cliquez sur Ajouter des données de masque, puis naviguez jusqu’à l’endroit où la segmentation initiale est enregistrée et importez-la sous le même projet. Engagez l’annotation ROI pour apporter des modifications à la segmentation initiale.
Enfin, ajoutez ou effacez la segmentation pour nettoyer la segmentation initiale. La rétroprojection pondérée de tomogrammes reconstruits à 16 angströms par pixel a révélé des structures mitochondriales et membraneuses après débruitage et correction du coin manquant. La visualisation dans un environnement immersif de réalité virtuelle a permis une inspection 3D détaillée des membranes après que l’égalisation de l’histogramme ait amélioré le contraste.
La segmentation manuelle a délimité les structures mitochondriales et les organites avec une grande précision à l’aide d’outils de RV, y compris la cartographie précise des limites membranaires et des ROI. Les rendus 3D finaux ont révélé des caractéristiques mitochondriales détaillées telles que les membranes externe et interne. Et des dépôts de phosphate de calcium avec des mailles lissées.
