בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בתוכנה SciGlass כדי לפלח נתוני טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים. SciGlass היא תוכנה מבוססת מציאות מדומה המספקת ממשק סוחף ואינטואיטיבי לפילוח מברקים cryo-ET, אנו מדגימים כי VR הוא כלי בר-קיימא שניתן לשלב בצינורות פילוח cryo-ET. Cryo-ET מתקדמת במהירות עם, אתה יודע, חידושים וממוקד.
עבור דגימות דקות יותר ושיטות איסוף נתונים מהירות יותר, ושימוש באלגוריתמים של למידת מכונה לשיפור ליקוט חלקיקים מפולח, אתם יודעים, כל ההתקדמות הללו מגיעה לשיאה לקריו-ET טוב יותר ולאימוץ תובנות ביולוגיות נהדרות באמת. Cryo-ET מתמודד עם אתגרים כמו קריו בתפוקה נמוכה. עבור דגימות עבות יותר מ-500 ננומטר וקושי להתמקד באזורים מעניינים בגלל מספרי עותקים נמוכים.
בנוסף, עיבוד נתונים נותר צוואר בקבוק, הדורש הערות ידניות נרחבות לאיסוף ופילוח חלקיקים, יחד עם מומחיות מיוחדת, אתה יודע, שאתה צריך ב-cryo-ET, כך שהכל מאט את זרימת העבודה הכוללת. מצאנו שמציאות מדומה משפרת את יעילות הפילוח בהשוואה לשיטות מסורתיות. הסביבה הסוחפת שלה מחמיאה לגישות אוטומטיות על ידי השלמת פערים והפחתת תוצאות חיוביות כוזבות.
בנוסף, פלטפורמת VR זו יעילה ביותר להדרכה וחינוך, מה שהופך אותה לכלי רב-תכליתי בניתוח נתוני cryo-ET. הפרוטוקול שלנו מתייחס לחוסר היעילות של הפילוח המסורתי, הכולל תהליכים ידניים ואיטיים וקשים, כך שעל ידי מינוף האופי הסוחף והאינטואיטיבי של מציאות מדומה, אנו שואפים לייעל את הפילוח על ידי הפיכת התהליך למהיר וידידותי יותר למשתמש. כדי להתחיל, המר טומוגרמות קריו-ET גולמיות לפורמט נתונים התואם ל-SciGlass, כגון ערימות TIFF.
הגדר את האות באמצעות ImageJ כדי להבטיח שהחלקיקים לבנים על שחור. נווט אל תהליך, ואחריו שפר ניגודיות, וסמן איזון היסטוגרמה"ועבד את כל הפרוסות. הפעל את תוכנת המציאות המדומה במחשב.
נווט אל קובץ בתפריט ובחר צור פרויקט. לחץ על צור פרויקט חדש, ולאחר מכן, על הוסף קבצים"בתוכנה. נווט למיקום של קבצי ה-TIFF וייבא אותם לפרויקט.
כאשר תתבקש, ודא שהקבצים אינם חלק מסדרת זמן לאחר לחיצה על לא.הבא, הקצה שם לפרויקט ולחץ על שמור"כדי ליצור את הפרויקט תחת רשימת הפרויקטים. לחץ פעמיים על הפרויקט כדי לפתוח את הטומוגרפיה ולטעון אותה לסביבת המציאות המדומה האינטראקטיבית. להגדרת מציאות מדומה, או VR, חברו את ערכת המציאות המדומה ואת בקרי היד למחשב.
עקבו אחר ההוראות שעל המסך כדי לכייל את סביבת המציאות המדומה. התאם את המערכת כדי להבטיח שהאזור הרצוי לפילוח נמצא בשדה הראייה של סביבת ה-VR, ולאחר מכן לחץ על כפתור ההדמיה בממשק התוכנה. התאם אפשרויות תצוגה חזותית כגון מחווני ניגודיות, חלונות, בהירות וסף כדי לשפר את האות ולמזער רעש.
השתמש בבקרי היד כדי לקרב את הטומוגרפיה או לדחוף אותה לבדיקה טובה יותר. הפעל את כלי החיתוך באמצעות הבקר השמאלי. בדיקה חזותית של פרוסות שונות בתוך הטומוגרמה.
נווט דרך הטומוגרמה לפרוסה הרצויה בה יתחיל הפילוח. הפעל את אפשרות אזור העניין, או ROI, בתפריט ההערות באמצעות בקרי היד. תיבה ירוקה תופיע בטומוגרמה.
התאם את הגודל והמיקום של התיבה הירוקה לאזור שיש לפלח. כעת, נעל את החזר ה-ROI באמצעות הבקר השמאלי. הכלי יעבור למצב צביעה לסגמנטציה.
הגדל או הקטן את התצוגה של הטומוגרף לפילוח מדויק. התאם את גודל המברשת עם סיבובים עם כיוון השעון או נגד כיוון השעון לשליטה מיטבית. פלח בזהירות את אזור העניין, כגון ממברנות מיטוכונדריאליות, בתוך האזור התלת מימדי.
התאם את רדיוס הכדור כראוי בעת ביצוע הפילוח. הפעל מצב מחיקה באמצעות הדק הבקר המשני כדי לתקן שגיאות סגמנטציה, והשתמש באותה תנועה כמו סגמנטציה כדי למחוק. חזור על תהליך הפילוח עבור כל האזורים עד שהטומוגרפיה תהיה מפולחת במלואה.
לאחר השלמת הפילוח, לחץ על הפרויקט שהושלם כדי להדגיש אותו. לחץ על הכרטיסייה פרויקטים ובחר החזר ROIכדי להמשיך. בחר לייצא את כל אמצעי האחסון או אזור עניין ספציפי, וציין את מיקום הייצוא עבור הנתונים המפולחים.
כעת, טען ונתח את הנתונים המפולחים המיוצאים מ-SciGlass לתוכנה הרצויה לבחירה לניתוח נוסף של הנתונים המפולחים. לאחר הכנת נתוני cryo-ET, לחץ לחיצה ימנית על הפרויקט ולחץ על הוסף נתוני מסכה, ולאחר מכן נווט למקום שבו נשמר הפילוח הראשוני וייבא אותו תחת אותו פרויקט. השתמש בהערת החזר ROI כדי לבצע עריכות בפילוח הראשוני.
לבסוף, הוסף או מחק פילוח כדי לנקות את הפילוח הראשוני. הקרנה אחורית משוקללת של טומוגרמות ששוחזרה ב-16 אנגסטרום לפיקסל חשפה מבנים מיטוכונדריים וקרומיים לאחר ביטול רעשים ותיקון טריז חסר. הדמיה בסביבת מציאות מדומה סוחפת אפשרה בדיקה תלת מימדית מפורטת של הממברנות לאחר השוואת היסטוגרמה שיפרה את הניגודיות.
פילוח ידני תיאר מבנים מיטוכונדריאלים ואברונים בדיוק גבוה באמצעות כלי VR, כולל מיפוי מדויק של גבולות הממברנה והחזר ההשקעה. עיבודי תלת מימד סופיים חשפו תכונות מיטוכונדריאליות מפורטות כגון ממברנות חיצוניות ופנימיות. ומרבצי סידן פוספט עם רשתות מוחלקות.
