Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d'infection

Résumé

Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires pour le virus de la dengue, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections virales dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des cas de dengue de moustiques peuvent être dosés. Les techniques pour cultiver le virus en culture, l'alimentation à membrane moustiques sang humain, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.

Résumé

Le but de cette procédure est d'infecter le moustique Aedes avec virus de la dengue dans un état de laboratoire et d'examiner le niveau d'infection et dynamique du virus dans les tissus des moustiques. Ce protocole est couramment utilisé pour étudier les interactions moustiques-virus, en particulier pour l'identification des facteurs de l'hôte roman qui sont en mesure de déterminer la compétence vectorielle. L'expérience entière doit être menée dans un laboratoire BSL2. Similaire à Plasmodium falciparum, une tenue correcte, y compris des gants et une blouse de laboratoire doit être porté en tout temps. Après l'expérience, tous les matériaux qui sont entrés en contact avec le virus doivent être traités avec de l'éthanol 75% et blanchi avant de procéder à un lavage normal. Tous les autres matériaux doivent être autoclavés avant de les jeter.

Protocole

A. propager le virus dans la ligne de C6/36 cellule.

1. Les cellules se développent à 80% de confluence dans flacon de ⁷⁵ cm2;
2. Retirez le support avec 3-4 ml restant dans le ballon;
3. Prenez 0,5 ml stock de virus et d'ajouter dans la cellule ci-dessus avec la multiplicité d'infection de 1,5 particules virales par cellule. Secouer le flacon pendant 15 minutes lentement à la température ambiante.
4. Incuber pendant 45 minutes à 5% de CO ₂ et 37 ° C
5. Ajouter 30 ml de milieu, et incuber pendant 5 jours.

B. Préparer le mélange de virus et de sang

1. Détachez la cellule avec le racloir et le transfert de la cellule et les médias pour les 50 ml tubes coniques;
2. Centrifugat à 800g pendant 10 minutes; recueillir le surnageant, mais laissez 1ml de surnageant avec le culot cellulaire;
3. Gel de la cellule au-dessus de granulés de CO ₂ sec puis dégel dans l'eau bain à 37 ° C, répéter deux à trois fois;
4. Centrifugat à 800g pendant 10 minutes, prenez le surnageant, et de combiner avec le surnageant recueilli de l'étape 3;
5. Collecter le sang total humain avec la même procédure (étape 3) pour la préparation de la culture des gamétocytes pour infecter des moustiques Anophèles par Plasmodium falciparum;
6. Combinez la même quantité de sang humain total ci-dessus avec le surnageant de virus de l'étape 4, et ajouter le sérum humain (10% de l'ensemble du volume).
7. Incuber le mélange ci-dessus du sang humain et le virus de la dengue pendant 30 minutes à 37 ° C bain d'eau

Nourrir les moustiques C.

Cette procédure est presque identique à ce qui a été décrit dans la section pour les infections à Plasmodium falciparum chez les moustiques. Nous dosage de l'infection intestin moyen au jour 7, et l'infection salivaires à 14 jours après le sang maternel. Tout le matériel ayant été en contact avec le virus sont d'abord traitées avec de l'éthanol 75% puis à l'eau de Javel à 10%.

D. Assay le titre du virus dans les tissus des moustiques

1. Deux ou trois jours avant la dissection des tissus de moustiques, de grandir dans une cellule de C6/36 plaque à 24 puits de telle sorte que la cellule atteindre 80% de confluence le jour lorsque le dosage est effectué;
2. Les moustiques sont anesthésiés à 4 ° C, sacrifiés et surface stériles en les trempant dans de l'éthanol 75% pendant 1 minute. Puis les moustiques ont été lavés avec de l'eau stérile à deux fois avant la dissection des glandes salivaires ou de l'intestin moyen sous la loupe binoculaire. A partir de cette étape, toute la procédure ci-dessous doit être menée dans un environnement stérile, comme une enceinte de sécurité biologique. Ces tissus sont transférés dans un tube contenant 150 ul des médias et homogénéisé avec un moteur Kontes granulés pilon pendant 90 secondes;
3. Faire une dilution de 1:100 en ajoutant 10 pl de l'homogénat dans les médias 990 ul;
4. Faire encore 1: 10, 1:100 et 1:1000 dilution avec le milieu dans la plaque de 96 puits;
5. Retirez le support de la plaque de 24 puits, et ajouter 100 ul de chacune de ces quatre dilutions dans chaque puits correspondants;
6. Agiter la plaque doucement pendant 15 minutes à la température ambiante, puis incuber pendant 45 minutes à 5% de CO ₂ et 37 ° C;
7. Ajouter 1ml de méthycellulose superposition (1%) dans chaque puits;
8. Incuber les plaques à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 5 jours;
9. Les étapes à partir d'ici n'ont pas besoin d'un environnement stérile, mais comme avec tous les soins d'autres agents pathogènes doivent être prises à tout moment. Jeter superposition méthycellulose de chaque plaque et éponger pour enlever l'excès des médias
10. Ajouter 1 ml de méthanol / acétone fixatif (1:1) à chaque puits. Conserver à 4 ° C pendant 1 h;
11. Verser le fixateur, et se laver une fois avec du PBS 1X;
12. Faire dilution de 1:1000 à l'anticorps primaire contre le virus avec 5% blotto;
13. Ajouter 200 pi de liquide hyperimmun dilué dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 1 heure;
14. Retirer du liquide hyperimmun et la plaque de lavage avec PBS 1 X
15. Préparer une dilution 1:1000 de chèvre anti-souris conjugué (Cat # 074-1806 KPL) dans 5% BLOTTO (lait écrémé en poudre 5g dans 100 ml d'une X PBS), puis ajouter 200 ul à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 1 h;
16. Préparer substrat comme suit: ajouter une tablette de 3'-diaminobenzidine terrahydrochloride (Cat Sigma # D5905) dans 20 ml de PBS 1 X, après dissolution, puis ajouter 8 l de peroxydase hydrogène à 30%
17. Ajouter 200 ul de substrat ci-dessus pour chaque puits. Laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes
18. Retirer substrat et arrêter la réaction en ajoutant 1 ml d'eau distillée dans chaque puits
19. Verser l'eau et des assiettes blot pour sécher
20. Comptez le nombre de particules virales

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito