Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

Özet

Dang virüsü için potansiyel refrakter olarak bir gen tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde viral enfeksiyonların önlenmesinde rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, dang sivrisinek enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı virüs büyüyor ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Özet

Bu prosedürün amacı, bir laboratuvar durumu dang virüsü ile enfekte Aedes sivrisinek ve sivrisinek dokularda enfeksiyon ve virüs dinamik incelemek için. Bu protokol rutin özellikle vektör yetkinlik belirlemek mümkün roman ana faktörlerin belirlenmesi, sivrisinek-virüs etkileşimleri çalışmak için kullanılır. Tüm deney bir BSL2 laboratuarda yapılmalıdır. Plasmodium falciparum enfeksiyonları için uygun kıyafetleri, eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere her zaman takılmalıdır. Deney sonra, virüs ile temas halinde gelen tüm malzemeler, normal yıkama ile devam etmeden önce% 75 etanol ve ağartılmış tedavi edilmesi gerekir. Tüm diğer malzemeler atarak onları önce otoklava gerekir.

Protokol

A. C6/36 hücre hattı virüs yayma.

1. Hücreler 75 cm ² balonuna confluency% 80 büyüyecek;
2. 3-4 ml cam şişe içinde kalan medya çıkarın;
3. 0.5 ml stok virüs atın ve yukarıdaki hücre içine, hücre başına 1,5 virüs partikülleri enfeksiyon çokluğu ile ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaş yavaş balonu çalkalamak.
4. % 5 CO ₂ ve 37 ° C de 45 dakika inkübe
5. 30 ml medya ekleyin ve 5 gün boyunca inkübe edin.

B. virüs ve kan karışımı hazırlayın

1. Kazıyıcı ile hücre ayırın ve 50 ml konik tüpler için hücre ve medya aktarımı;
2. 10 dakika için 800g Centrifugate; süpernatantı toplamak, ancak hücre pelet süpernatant 1 ml bırakın;
3. 37 ° C su banyosu, tekrar 2-3 kez Çözülme sonra kuru CO ₂ Yukarıdaki hücre pelletini Dondurma ve;
4. Süpernatantı almak ve 3. adımdan itibaren toplanan süpernatant ile birleştirmek, 10 dakika için 800g Centrifugate;
5. Plasmodium falciparum ile Anofel sivrisinek enfekte gametocyte kültürü hazırlanması için aynı prosedürü (adım 3) tüm insan kanı toplamak;
6. Adım 4 virüs süpernatant ile yukarıdaki bütün insan kanı eşit miktarda birleştirin ve insan serum eklemek (tüm hacminin% 10).
7. 37 ° C su banyosunda 30 dakika için, insan kanı ve Dang virüsü yukarıdaki karışımı inkübe

C. Besleme sivrisinek

Bu prosedür, sivrisinek Plasmodium falciparum enfeksiyonlar için bölümünde tarif edilmiştir ne hemen hemen aynıdır . Biz 7 gün tahlil midgut enfeksiyon, tükürük kan besleme 14 gün sonra enfeksiyon. Virüs ile temas halinde gelen tüm materyaller% 75 etanol ve% 10 çamaşır suyu ile tedavi edilir.

D. Testi sivrisinek doku virüs titresi

1. İki ya da üç gün sivrisinek doku diseksiyonu önce, hücre% 80 tahlil yapılır gün confluency ulaşmak gibi bir 24 plaka C6/36 hücre büyümesi;
2. Sivrisinekler, 4 anestezi ° C, kurban ve 1 dakika boyunca% 75 etanol onları iliklerine steril su yüzüne çıktı. Sonra sivrisinek diseksiyon mikroskobu altında midgut veya tükürük bezi diseksiyonu önce iki kez steril su ile yıkandı. Bu adım, altındaki tüm prosedürü, steril bir ortamda böyle bir biyolojik güvenlik kabini olarak yürütülmesi gerekmektedir. Bu dokular 150 ul medya içeren bir tüpe aktarılır ve 90 saniye boyunca bir Kontes pelet havaneli motor ile homojenize;
3. Homojenat 10 ul 990 ul medya ekleyerek 1:100 dilüsyon olun;
4. Daha 1: 10, 96 plaka, orta 1:100 ve 1:1000 dilüsyon;
5. 24 plaka medya çıkarın ve buna karşılık gelen her iyi yukarıdaki dört dilüsyonları her 100 ul eklemek;
6. Plaka, sonra% 5, 45 dakika boyunca inkübe oda sıcaklığında 15 dakika boyunca _yavaş yavaş sallayın CO 2 ve 37 ° C;
7. Her iyi methycellulose kaplama (1%) 1 ml ekleyin;
8. 37 ° plakaları inkübe ° C, 5 gün için% 5 _CO 2 ;
9. Burada adımları steril bir ortamda gerek yoktur, ancak her zaman başka bir patojen bakım alınmalıdır. Her plaka methycellulose bindirme atın ve aşırı ortamı çıkarmak için blot
10. Her bir kuyu için metanol / aseton fiksatif (1:1) 1 ml ekleyin. 1 saat 4 ° C'de tutun;
11. Fiksatif dökün ve 1X PBS ile bir kez yıkayın;
12. % 5 dut virüsüne karşı primer antikor 1:1000 dilüsyon olun;
13. 1 saat için her 37 inkübe, iyi ° C 200 ul seyreltilmiş hiper-immün sıvı ekleyin;
14. 1 X PBS ile hiper-immün sıvı ve yıkama plakası çıkarın
15. % 5 fitil (100 ml 1 X PBS 5g toz yağsız süt) keçi anti-fare konjuge 1:1000 dilüsyon (KPL Kedi # 074-1806) hazırlayın ve sonra her bir kuyunun 200 ul ekleyin ve inkübe 1 saat için 37 ° C;
16. Substrat aşağıdaki gibi hazırlayın: çözünmüş sonra, 1 X PBS 20 ml 1 tablet (Sigma Kedi # D5905) 3'-diaminobenzidin terrahydrochloride eklemek ve daha sonra% 30 hidrojen peroksidaz 8 ul eklemek
17. Her bir kuyunun 200 ul yukarıdaki substrat ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında bekletin.
18. Substrat çıkarın ve iyi 1ml distile su ekleyerek reaksiyonu durdurmak
19. Kuruması için su ve leke plakaları kapalı dökün
20. Virüs parçacık sayımı

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito