모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

요약

유전자가 뎅그열 바이러스에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 내에서 바이러스 감염을 방지에의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 뎅그열 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액에있는 바이러스를 성장하고, 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

초록

이 절차의 목적은 실험실 조건에서 뎅그열 바이러스 Aedes의 모기를 감염하고 모기가 조직의 감염 수준 및 바이러스의 역학을 조사하는 것입니다. 이 프로토콜은 정기적으로, 특히 벡터 능력을 확인할 수있는 새로운 호스트 요인의 식별, 모기 바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 전체 실험은 BSL2의 연구실에서 수행되어야합니다. Plasmodium falciparum 감염과 마찬가지로, 장갑과 실험 복을 포함한 적절한 복장은 항상 착용해야합니다. 실험 후, 바이러스와 접촉 온 모든 자료는 일반 세탁기와 함께 진행하기 전에 75 % 에탄올과 표백로 치료해야합니다. 다른 모든 자료는 폐기 앞에 autoclaved해야합니다.

프로토콜

A.이 C6/36 세포주에 바이러스를 전파.

1. 세포는 ^75cm이 플라스크에 confluency 80 % 성장;
2. 술병에 남아 3-4 ML과 미디어를 제거;
3. 0.5 ML 주식 바이러스를 가지고 세포 당 1.5 바이러스 입자의 감염의 다중성과 함께 위의 셀에 추가합니다. 서서히 실온에서 15 분 동안 휴대용 술병을 흔들어.
4. 5% CO _2와 37 ° C에서 45 분 동안 품어
5. 30 ML 미디어를 추가, 5 일 동안 알을 품다.

B. 바이러스와 혈액의 혼합물 준비

1. 스크레이퍼로 세포를 분리하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포와 미디어를 전송;
2. 10 분 800g에 Centrifugate, 표면에 뜨는를 수집하지만, 세포 펠렛과 함께 뜨는의 1ml를 떠나;
3. ° C 물 목욕, 반복 2 ~ 3 배 37 해동 후 건조 CO _2에 위의 세포 펠렛을 고정하고,
4. 뜨는을하고, 3 단계에서 수집한 뜨는와 결합, 10 분 800g에 Centrifugate;
5. Plasmodium falciparum과 아노 펠 레스 모기를 감염시킬 수 gametocyte 문화의 준비에 대해 동일한 절차 (3 단계)와 전체 인간의 혈액을 수집;
6. 4 단계에서 바이러스 뜨는와 함께 위의 모든 인간의 혈액의 동일한 금액을 결합, 그리고 (전체 볼륨의 10 %) 인간의 혈청을 추가합니다.
7. 37 ° C 물 목욕 30 분 인간의 혈액과 뎅그열 바이러스의 상기 혼합물을 품어

C. 먹이 모기

이 절차는 모기에 Plasmodium falciparum 감염에 대한 섹션에서 설명했던 일들을 거의 동일합니다. 우리는 일 7시 분석 midgut 감염, 피로 수유 후 14 일에서 타액 감염. 바이러스와 접촉에 온 모든 자료는 75 % 에탄올과 10 %의 다음 표백제 처음에 처리됩니다.

D. 어세 모기 조직에서 바이러스 titer

1. 2-3 일 모기 조직의 절개 전에 세포는 분석이 실시되는 하루 confluency 80 %에 도달 이러한 24 잘 접시에 C6/36 세포를 성장;
2. 모기가 4 anesthetized 아르 ° C, 희생과 1 분 75 % 에탄올에서 그들을 담글하여 멸균 표면. 그렇다면 모기는 해부 현미경 midgut 또는 침샘의 해부 전에 두 번 멸균 물로 씻어되었습니다. 이 단계에서 아래의 모든 절차는 생물 학적 안전 캐비닛 같은 무균 환경에서 실시해야합니다. 이러한 조직은 150 μl 미디어를 포함하는 튜브에 옮겨 90 초간 Kontes 펠렛 유봉 모터 균질되며
3. 990 μl 미디어에 homogenate 10 μl를 추가하여 1:100 희석하다;
4. 추가 1 확인 : 10, 1:100 및 96 잘 판에 매체와 1:1000 희석을;
5. 24 잘 판에있는 미디어를 제거하고 각 해당 잘하려면 위의 네 dilutions 각각 100 μl를 추가합니다;
6. 그리고 5 %에서 45 분 동안 부화 상온에서 15 분에 대해 천천히 접시를 흔들어 CO ₂ 37 ° C;
7. 각 잘하는 프로필 메틸 셀룰로오스 오버레이 (1 %)의 1ml을 추가합니다;
8. 37 접시를 품어 ° C 오일에 대한 5 % CO _2;
9. 여기에서 단계 멸균 환경을 필요로하지 않지만 같은 다른 병원체주의는 항상 주의해야한다. 각 플레이트의 프로필 메틸 셀룰로오스 오버레이를 취소하고 여분 미디어를 제거 얼룩
10. 각 잘하는 메탄올 / 아세톤 정착액 (1:1)의 1ml을 추가합니다. 1 시간 4 ° C에 보관;
11. 정착액을 붓고하고, 1X PBS로 한번 씻어;
12. 5% 곤드레 만 드레 취한와 바이러스에 대한 기본 항체에 1:1000 희석하다;
13. 1 시간 각 37 품어, 잘 ° C로 희석 hyperimmune 액체 200 μl를 추가합니다;
14. 1 X PBS로 hyperimmune 유체 및 세척 플레이트를 제거합니다
15. 5% 곤드레 만 드레 취한 (1 X PBS의 100 ML에 5g 분말 탈지 우유)에 염소 안티 마우스 공액의 1:1000 희석 (KPL 캣 # 074-1806)를 준비하고, 다음 각 잘 200 μl을 추가하고에서 알을 품다 1 시간을위한 37 ° C;
16. 다음과 같이 기판을 준비 : 해산 후, 1 X PBS의 20 ML에 3' - Diaminobenzidine terrahydrochloride 1 타블렛 (시그마 고양이 # D5905)을 추가하고 다음 30 % 수소 퍼옥시데이즈 8 μl를 추가
17. 각 잘하려면 위의 기판 200 μl를 추가합니다. 10 분 실온에서 서합시다
18. 기판을 제거하고 각 잘하는 증류수의 1ml을 추가하여 반응을 정지
19. 건조에 물 얼룩 접시를 부어
20. 바이러스 입자를 카운트

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito