Un modèle murin de In utero Transplantation

Résumé

Le modèle murin de In utero La transplantation est un outil polyvalent qui peut être utilisée pour étudier les applications cliniques potentielles de la transplantation de cellules souches et la thérapie génique chez le fœtus. Dans ce protocole, nous présentons une approche générale de l'exécution de cette technique de

Résumé

La transplantation de cellules souches et les virus in utero a un énorme potentiel pour le traitement des affections congénitales chez le fœtus humain. Par exemple, la transplantation in utero (IUT) de cellules souches hématopoïétiques a été utilisé avec succès pour traiter les patients souffrant d'immunodéficience ^1,2. Combinés dans plusieurs autres conditions, cependant, l'IUT a été tentée sans succès. ³ Compte tenu de ces résultats mitigés, la disponibilité d'une efficacité non-humain modèle pour étudier les séquelles biologiques de la transplantation de cellules souches et la thérapie génique est essentielle pour faire progresser ce domaine. Nous et d'autres ont utilisé le modèle murin de l'IUT d'étudier les facteurs affectant la prise de greffe réussie d'in utero transplanté des cellules souches hématopoïétiques dans les deux souris de type sauvage ^4-7 et ceux avec les maladies génétiques. ^8,9 L'environnement fœtal offre également des avantages considérables pour la succès de la thérapie génique in utero. Par exemple, la livraison de ¹⁰ adénoviraux, adéno-associés virale ^{10, 11} rétroviraux et les vecteurs lentiviraux ^12,13 dans le foetus a abouti à la transduction de multiples organes à distance du site d'injection avec l'expression des gènes à long terme. In utero la thérapie génique peut donc être considérée comme une stratégie de traitement possible pour des maladies monogéniques comme la dystrophie musculaire ou la fibrose kystique. Un autre avantage potentiel de l'IUT est la capacité à induire une tolérance immunitaire à un antigène spécifique. Comme on le voit chez des souris atteintes d'hémophilie, l'introduction du facteur IX au début de résultats de développement dans la tolérance à cette protéine. ¹⁴

En plus de son utilisation dans les enquêtes sur d'éventuelles thérapies humaines, le modèle murin de l'IUT peut être un outil puissant pour étudier des questions fondamentales en biologie cellulaire du développement et de la tige. Par exemple, on peut offrir diverses petites molécules d'induire ou d'inhiber l'expression génique spécifique à définir les étapes de gestation et de manipuler les voies de développement. L'impact de ces modifications peut être évalué à différents points de temps après la transplantation initiale. Par ailleurs, on peut transplanter pluripotentes ou de la lignée des cellules progénitrices spécifiques dans l'environnement du fœtus à l'étude différenciation des cellules souches dans un milieu d'accueil non irradiés et imperturbable.

Le modèle de souris de l'IUT a déjà fourni des indications nombreuses dans les domaines de l'immunologie et la biologie cellulaire du développement et de la tige. Dans ce protocole basé sur la vidéo, nous décrivons une approche étape par étape pour effectuer IUT de fœtus de souris et un aperçu des étapes critiques et les pièges potentiels de cette technique.

Protocole

1. Préparation des pipettes d'injection

1. Calibrer l'extracteur pipette tels que la séparation de la pipette en verre se produit dans les 15 secondes (voir les instructions du fabricant concernant l'étalonnage). La pipette aura un cône où il se sépare.
2. Coupez l'extrémité de la pipette de telle sorte que la distance entre le début du cône à l'extrémité de la pipette est 1.04cm à 1.05cm. La longueur de la pipette est inversement proportionnel au calibre de l'orifice de la pipette. Soyez conscient que faire un plus long pipette entraîne aussi un affaiblissement astuce qui est plus sensible à la casse lors de l'injection.
3. La prochaine étape dans la prise de la pipette est de créer un biseau en douceur en aiguisant la pointe de diamant sur une roue d'affûtage. Au moment de la coupe de la pipette à la taille appropriée, la pipette casse souvent avec un biseau naturelle à son extrémité qui doit être utilisé lorsque vous placez la pipette sur la roue. Pendant ce processus, il est important de douceur reste de la pipette sur la roue d'affûtage et de réévaluer périodiquement pour s'assurer que la pipette est encore en contact avec la roue (comme le biseau devient plus lisse, il perdra le contact avec la roue d'affûtage).
4. Une fois que le biseau est lisse, la pointe de la pipette doit être aiguisé (Figure 1). Surélever la pipette de telle sorte qu'il ne touche plus la roue d'affûtage, tournez dans le sens horaire par 10-50 degrés, et le lieu du dos pipette sur la roue tournante d'affûtage pour ~ 10 secondes. Retirer la pipette de la roue d'affûtage et maintenant examiner le bord. Cette étape doit habituellement être répété avec plusieurs petits ajustements afin de créer un bord tranchant. Si la pipette est placée sur son bord pendant trop longtemps, il est plus susceptible de développer une surface inégale (figure 1). Après avoir complété un côté, vous pouvez procéder à aiguiser le bord opposé en répétant les étapes ci-dessus.
5. Utilisez un marqueur indélébile pour dessiner une ligne circonférentielle tous les 4mm de départ où le cône de la pipette commence. Ces démarcations correspondent à 5uL de volume.

2. Transplantation in utero

1. Après avoir préparé le matériel injectable (par exemple des cellules, virus, etc), vous pouvez mettre en place pour l'injection. Nous utilisons un microinjecteur connecté à air comprimé avec les paramètres suivants: (réglages de pression: entrée 60-80 psi, remplir 40 psi, injecter 8-12 psi, de l'équilibre 0 psi, maintenez 0 psi, le temps d'injection de 100 millisecondes).
2. Pour stériliser la pipette d'injection, nettoyez-le à deux reprises avec EtOH à 70%, suivi par deux fois avec du PBS 1X stériles. Comme l'extrémité de la pipette est très fragile, nous ne recommandons pas l'autoclavage des pipettes d'injection.
3. Les injections peuvent être fait soit en utilisant des loupes de grossissement 2.5X-3.5x ou un microscope à dissection. Préparez votre région procédure avec une couverture chauffante, l'éclairage et les instruments chirurgicaux nécessaires.
4. Anesthésier les souris enceintes (nous utilisons l'isoflurane et oxygène délivré via une unité d'anesthésie à débit continu). Placez la souris sur un coussin chauffant en position couchée et apposer chaque membre avec du ruban adhésif pour sécuriser la souris en place.
5. Clip de la fourrure. Ensuite, le port de gants chirurgicaux stériles, la préparation de l'abdomen avec 10% de povidone-iode suivie par l'alcool, et à injecter une telle analgésiques comme la buprénorphine.
6. Faire une incision de 1 cm dans le bas ventre (l'aspect le plus inférieur de l'incision doit être d'environ 1 cm supérieur à l'orifice vaginal). Inciser la peau et le fascia. Soyez prudent de ne pas blesser les organes abdominaux (intestins et la vessie), qui sont immédiatement sous la mince couche de fascia.
7. En utilisant des tampons de coton, étirer doucement le fascia et de livrer l'utérus gravide à travers l'incision. Compter le nombre total de fœtus en identifiant d'abord les ovaires droit et gauche pour vous assurer que vous visualisez tout l'utérus. Placez l'utérus de retour dans la cavité abdominale avant de procéder pour que le fœtus restent au chaud pendant que vous préparez pour les injections.
8. Prélever le volume approprié de matériel pour le nombre de fœtus que vous prévoyez d'injecter. Lors du remplissage de l'aiguille avec votre échantillon, il est important de garder à l'extrémité de la pipette pour éviter l'aspiration submergée votre échantillon dans le tube microinjecteur. Comme les cellules sont généralement dans un petit volume, nous avons l'habitude de les placer dans une micro-petits (ex: 0,5 mL) tube ou directement sur un morceau de parafilm pour être en mesure de combler l'aiguille sans casser la pointe de la pipette.
9. Maintenez chaque fœtus et d'identifier la partie du fœtus que vous prévoyez d'injecter (par exemple le foie, la cavité péritonéale, une jambe, etc.) Avec votre pouce et votre index, vous devez stabiliser le foetus dans la cavité amniotique afin qu'elle ne tourne pas pendant que vous effectuez l'injection. Il est important de tenir le fœtus assez fermement pour le stabiliser, mais en douceur suffisant pour éviter de l'endommager.
10. Insérez soigneusement la pipette dans l'utérus, l'amnios et la peau du fœtus, et dans l'organe cible. Si la pipette est forte, elle devrait passer facilement à travers ces tissus. Si la pointe de la pipette est terne, vous wi LL tentes avis de l'utérus et les membranes amniotiques. Injecter le volume désiré dans chaque fœtus. Il est impératif que vos mouvements soient stables pendant le temps de l'insertion, l'injection et le retrait de la pipette.
11. Une fois le volume désiré est injecté, retirer la pipette soigneusement. Si c'est fait correctement, le matériel ne doit pas s'échapper de la cavité amniotique ou de l'utérus. Si un grand trou est créée dans l'amnios, dont on peut reconnaître par une fuite de liquide amniotique, puis la survie est compromise. Enfin, pour les études qui impliquent la récolte postnatale, tous les fœtus doivent recevoir des injections techniquement parfait car il n'y a aucun moyen de discerner les fœtus et les non-injecté injecté après la naissance.
12. Si vous effectuez les injections dans le foie fœtal, vous pouvez parfois voir du sang dans l'embout de la pipette est retirée après qu'elle-ce qui confirme que vous êtes dans la position correcte et ne devrait pas affecter la survie. Si vous effectuez des injections intra-péritonéales, le but légèrement en dessous du foie fœtal. Pour les injections intramusculaires, vous pouvez la position du fœtus à identifier la hanche et du fémur et d'injecter le muscle fessier. Enfin, pour les injections intra-ventriculaire, il est facile de voir les points de suture coronale pour diriger la pipette à la cible appropriée. Pour ces injections, des pipettes de calibre légèrement plus grandes sont nécessaires pour pénétrer le crâne sans casser la pipette.
13. Ensuite, placer soigneusement l'utérus dans la cavité abdominale. Assurez-vous qu'il n'est pas tordu sur lui-même ou autour de son apport vasculaire. Livrer 1ml de solution stérile PBS 1X dans la cavité péritonéale de la mère pour remplacer le liquide qui a été perdu lors de la procédure. Fermer l'incision en 2 couches avec une suture tressée 5-0 résorbables (ex: Vicryl). Fermez d'abord le fascia sans blesser l'intestin ou la vessie sous-jacente, puis fermez la peau.
14. A cette époque, post-opératoire des médicaments peuvent être administrés pour l'analgésie. Retour chaque femelle injecte à sa cage individuelle propre et placer la cage sur une couverture chauffante. Surveiller la souris jusqu'à ce qu'il soit en position verticale. Mettez la literie dans la cage et le lieu de la souris dans une zone calme de l'installation de la souris où il ne devrait pas être dérangé (ie pas de nettoyage des cages) jusqu'à plusieurs jours après l'accouchement. Minimiser tout stress supplémentaire pour l'animal va diminuer les chances d'accouchement prématuré.
15. Lorsque vous avez terminé les injections, nettoyer votre pipette stérile, à deux reprises avec du PBS 1X et une fois avec EtOH 70%.
16. Femelles injectées doivent être observés quotidiennement afin de s'assurer qu'ils se remettent de la procédure sans difficulté. L'incision doit être surveillée de gonflement, une inflammation des signes, la séparation des plaies, et d'autres de l'infection. Post-opératoire des analgésiques peuvent être administrés au besoin.

3. Les résultats représentatifs:

La survie du fœtus injectés à la livraison terme est le principal facteur limitant pour atteindre le succès avec cette technique. Selon le matériau injecté et la souche de souris utilisée, les taux de survie peut varier. En général, les injections de cellules hématopoïétiques dans souris de type sauvage au E14 devrait se traduire par au moins 50% nés vivants chiots. Des taux plus élevés de survie sont possibles en fonction à la fois les aspects techniques de l'injection ainsi que les caractéristiques de la souris étant injecté.

Minimiser le traumatisme pour les membranes amniotiques utérus et est l'aspect technique le plus important de ce protocole. Sharp, pipettes de petit calibre se traduira par un traumatisme minime utérine pendant l'injection. Nous ne recommandons pas l'utilisation d'aiguilles d'injection standard que le calibre des pré-fabriqués aiguilles est trop grand et donnerait lieu à un grand trou dans l'utérus. Fait à la main pipettes d'injection de verre sont les aiguilles de petit calibre ne peuvent être utilisées pour des injections intra-utérine. Complète et méticuleuse technique chirurgicale, y compris la manipulation douce de l'utérus et une courte anesthésie est également cruciale pour des résultats optimaux.

Caractéristiques spécifiques de la souris receveuses tels que le fond génétique, l'âge gestationnel, et la taille des portées peut également affecter la survie. Certaines souches de souris sont plus sensibles à la perte de travail prématuré et la grossesse en fonction de leur bagage génétique. ¹⁵ animaux transgéniques avec des défauts musculaires ou neurodégénératives peuvent avoir une capacité réduite pour livrer des fœtus par voie vaginale après avoir subi une laparotomie médiane. Ces ^huit femelles gravides peut exiger la livraison par césarienne. Nous avons également constaté que l'âge gestationnel au moment de l'injection peut avoir un impact viabilité. Les fœtus qui sont plus jeunes que 12 jours embryonnaires ont des taux inférieurs de survie que les plus âgés fœtus. Enfin, nous avons constaté que la taille des portées importantes (> 10 fœtus) ont tendance à avoir des taux élevés de mort fœtale après l'injection. Attention à la fois les aspects techniques de cette technique et les caractéristiques spécifiques de la souris étant injecté peut maximiser la survie des foetus injectées.

ve_content "> Quand ces méthodes sont exécutées correctement, on peut s'attendre à ce que tous les foetus sont exposés à la matière injectée. Similaire à la mise en postnatale, cependant, la prestation réussie de cellules ou de virus in utero n'a pas toujours lieu à des greffes de cellules ou un gène donateurs d'expression, respectivement. La prise de greffe de cellules souches, par exemple, dépend de plusieurs facteurs tels que la dose et la source des cellules transplantées. De même, le succès de la transduction virale est, en partie, déterminé par le type de vecteur viral utilisé. Il faut comprendre les nombreux facteurs que la survie de l'impact chiot, greffe cellulaire, et la transduction virale pour atteindre le succès avec ce protocole.

Figure 1. Diagramme montrant bon affûtage des pipettes d'injection (étape 1.4)

Discussion

Plus il ya 50 ans, Billingham, Brent et Medawar utilisé dans la transplantation in utero chez la souris pour induire une tolérance immunitaire aux protéines étrangères. ¹⁶ Depuis ce temps, plusieurs variantes de cette technique ont été utilisés pour répondre aux questions en immunologie et en biologie des cellules souches.

Le protocole détaillé ici est l'une des méthodes les plus accessibles pour les IUT. Le foie fœtal offre une cible facile à v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipettes	Kimble Chase	71900-100
Pipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-30
Microinjector	Narishige International	IM-300
Pipette sharpener	Sutter Instrument Co.	Model BV-10