FISH pour le diagnostic préimplantatoire génétique

Résumé

Cet article décrit la sélection des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliquées au diagnostic génétique pré-implantatoire (DPI) dans un contexte clinique.

Résumé

Diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) est une alternative établie pour le diagnostic prénatal, et implique la sélection pré-implantatoire des embryons à partir d'une cohorte générées par la technologie de reproduction assistée (TRA). Cette sélection peut être nécessaire en raison de maladie familiale monogénique (par exemple la mucoviscidose), ou parce que l'un des partenaires réalise un réarrangement chromosomique (par exemple une translocation réciproque dans les deux sens). Le DPI est disponible pour les couples qui ont déjà eu des enfants affectés et / ou dans le cas des réarrangements chromosomiques, fausses couches à répétition, ou l'infertilité. Les ovocytes aspirés stimulation ovarienne sont fécondés par la suite à l'immersion dans le sperme in vitro (FIV) ou par injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde individuel (ICSI). Pré-implantatoire des embryons au stade clivage sont biopsiées, habituellement par le prélèvement d'une cellule unique sur 3 jours après la fécondation, et la cellule de biopsie est testé pour établir le statut génétique de l'embryon. L'hybridation fluorescente in situ (FISH) sur les noyaux de cellules fixes biopsiés avec la cible spécifique des sondes d'ADN est la technique de choix pour détecter les déséquilibres chromosomiques associées à des réarrangements chromosomiques, et de sélectionner les embryons féminins dans les familles avec des maladies liées à l'X pour lesquels il n'existe aucune mutation spécifique de test. FISH a également été utilisé pour les embryons de l'écran de l'aneuploïdie chromosomique spontanée (aussi connu comme PGS ou PGD-AS), afin de tenter d'améliorer l'efficacité de la procréation assistée, mais la valeur prédictive de ce test en utilisant la diffusion et la technique de FISH décrite ici est susceptible d'être beaucoup trop faible dans les mains de la plupart des gens, et il n'est pas recommandé pour une utilisation clinique de routine. Nous décrivons le choix des sondes appropriées pour les mono-cellules de poisson, les techniques de propagation pour les noyaux des blastomères, et l'hybridation in situ et la notation du signal, appliqué aux DPI dans un cadre clinique.

Protocole

1. Lyse et la diffusion de noyau d'une blastomère biopsiés

1. Tampon de lyse cellulaire des cellules propagation (0,2% de Tween 20 dans 0,01 M HCl, pH 2,0) doit être préparée 24 heures à l'avance et stocké à -20 ° C. Préparer 100 ml et 20 ml de filtre dans un conteneur de 30 ml stériles universelle en utilisant une seringue stérile de 20 ml et un filtre seringue. Distribuer des aliquotes de 1 mL dans 10 à 15 1,7 ml microtubes stériles, fermer et étiqueter les tubes avant de le congeler. Il est recommandé d'avoir deux lots différents est l'utilisation, le nouveau lot et le lot précédent, qui a été testé et peut être utilisé si le nouveau lot est insatisfaisante.
2. Décongeler le tampon de lyse à température ambiante 30 minutes avant la biopsie. Pour des raisons pratiques, la température de travail se situe entre la température ambiante et la température de la main.
3. Score d'un petit cercle (environ 5 mm de diamètre) sur la partie inférieure d'une lame d'amine-couché (par exemple Genetix) en utilisant un stylo de diamants et de pré-label de la diapositive avec le numéro de dossier, numéro de la diapositive unique, et la date de biopsie. Utilisez une lame séparée pour chaque blastomère dans l'ordre numérique, et l'étiquette avec le numéro de l'embryon. Les diapositives doivent être étiquetés avec un crayon dur comme 4H, et "effacé" avec un gant de latex pour enlever toute la poussière de graphite.
4. Placez un petit volume de tampon de lyse dans le cercle.
5. Transférer le blastomère biopsié dans le tampon de lyse. Si nécessaire, ajouter un tampon de lyse dans le cercle jusqu'à ce que la cellule commence à se lyser, la cellule doit lyser complètement et le cytoplasme se disperser avant le séchage de la mémoire tampon.
6. Observez le noyau afin de s'assurer qu'il reste dans le cercle et ne sont pas perdues; si la cellule n'a pas de noyau ou a noyaux multiples, la biopsie d'une autre cellule.
7. Laisser la lame sécher à l'air à température ambiante.

2. Hybridation in situ d'un seul noyau de blastomères

1. Préparer une série d'éthanol (70, 90 et 100%), composé dans l'eau distillée stérile.
2. Allumez-le et mettre le bloc chaud (par exemple Hybaid Omnislide ou Vysis Hybrite) à 75 ° C.
3. Sondes de dégivrage, vortex et centrifuger. Les réactifs doivent être témoin et vérifiées pour être correcte avant de faire le mélange de la sonde. Volumes de pipette comme spécifié par le fabricant pour rattraper le mélange de sonde dans un tube à 0,65 ml microtubes stériles et le vortex et centrifuger avant l'utilisation. Le volume total du mélange de la sonde devrait être suffisante pour permettre à 2 l par le noyau pour être testé et arrondi au plus proche des 10 uL pour permettre une marge de sécurité.
4. Pré-laver les lames dans des bocaux Coplin en utilisant un tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,0: 0,14 M de NaCl, 3 mM de KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO ₄₎ pendant 5 min à température ambiante.
5. Rincer les lames à deux reprises dans de l'eau distillée stérile.
6. Déshydrater les lames avec la série d'éthanol (70, 90 et 100%) pendant 2 min chacun à la température ambiante et l'air sec. Assurez diapositives sont entièrement immergés et si toute la poussière de graphite flotte à la surface, éponger avec un tissu propre.
7. Enregistrer la position du noyau dans le cercle en visualisant avec un microscope à contraste de phase.
8. Déshydrater à l'éthanol à 100% pendant 2 min à température ambiante et l'air sec.
9. Appliquer 2 pl de mélange de sonde, et couvrir avec une lamelle de 9 x 9 mm (un quart de 18 x 18 mm lamelle n ° 1).
10. Scellez les bords de la lamelle de caoutchouc ciment (gomme de vache par exemple; Proofing vache).
11. Codenature les diapositives sur un bloc chaude à 75 ° C pendant 5 min, puis l'hybridation des diapositives nuit (16-20 h) dans une chambre humidifiée à 37 ° C. Mêle sonde constitués entièrement de sondes centromère (ie pour liée au sexe des cas) donnera un résultat satisfaisant après 60 min d'hybridation.
12. Préparez un bain d'eau avec des jarres Coplin suffisant et la chaleur à 71 ° C.
13. Préparer un 0.4x citrate saline standard (SSC) de solution de lavage sévères (pH 7,0 à 71 ° C, 0,06 M de NaCl, 6 mM C ₆ H ₅ Na ₃ O ₇ .2 H ₂ O) et de chaleur dans l'eau du bain.
14. Déposer 50 ml de lavage rigoureuses par Coplin jar nécessaires et vérifier que la température est de 71 ° C immédiatement avant l'utilisation à l'aide d'un thermomètre propre.
15. Retirer délicatement le ciment de caoutchouc de chaque diapositive et rincer la lamelle à l'aide 4x SSC/0.05% de Tween 20 (pH 7,0) à température ambiante.
16. Laver les lames dans le lavage SSC 0.4x strictes à 71 ° C pendant 5 min. Lavez pas plus de 6 diapositives par jarre de Coplin.
17. Laver les lames dans Tween 20% SSC/0.05 4x à température ambiante pendant 2 min.
18. Si le mélange sonde contient la sonde indirectement marqué (s), égoutter les diapositives de l'excès de liquide et d'appliquer 20 uL d'anticorps par fluorescence conjugué dans un carré de 20 x 20 mm de Parafilm.
19. Incuber dans une chambre humidifiée à 37 ° C pendant 15 min.
20. Retirez le Parafilm et laver une fois dans Tween 20% SSC/0.05 4x à température ambiante pendant 2 min.
21. Laver deux fois pendant 2 min dans du PBS unela température ambiante t et égoutter les lames.
22. Appliquer 6 uL d'DAPI / Vectashield (160 ng de 4 ',6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure dans 1 ml de milieu de montage Vectashield, Vector Laboratories) à un 22 x 22 mm non. 0 lamelle et inverser la glisser sur la lamelle.
23. Blot et sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent.

3. Analyse au microscope à fluorescence convenablement équipé avec des filtres appropriés pour les sondes utilisées.

1. Score signaux par visualisation directe en utilisant un microscope à fluorescence et unique filtres passe-bande pour chaque fluorochrome dans le dosage. Chaque noyau devrait être marqué par deux analystes. Une ligne directrice générale devrait conduire à marquer d'un signal unique lorsque deux signaux sont espacées de moins d'un domaine (le signal de largeur) à part, cependant, le jugement fondé sur l'expérience doit être exercé à interpréter les signaux de taille variable, l'intensité et de séparation.
2. Utiliser un logiciel d'imagerie (par exemple Isis, métasystèmes, Altlussheim, Allemagne; CytoVision, Genetix) pour capturer une image du noyau pour la confirmation du diagnostic visuel, et pour l'archivage des images dans le cadre d'un plan d'assurance qualité du laboratoire.

4. Les résultats représentatifs:

Métaphase et noyaux interphasiques de cultures de lymphocytes du sang périphérique devraient être examinés pour confirmer que les sondes sélectionnées sont spécifiques pour les chromosomes de translocation, instructive pour les points d'arrêt (les sondes subtelomere devrait s'hybrider seulement pour les segments translocation et la sonde centromère (s) à l'centric segment (s)) et les signaux dans les noyaux interphasiques doit être brillante et discrète. Notation du nombre de signaux pour chaque sonde dans 100 noyaux interphasiques de chaque partenaire est recommandé d'évaluer l'efficacité de l'essai. Dans ce cas, deux signaux ont été marqués en 95% -99% de noyaux pour chaque sonde. La figure 1 montre une métaphase et noyau interphasique d'une préparation à une translocation réciproque entre les bras courts des chromosomes 5 et 9.

Signaux dans les noyaux interphasiques à partir de blastomères d'embryons doit être brillant et discret et marqué à l'aide séparées filtres passe-bande pour les couleurs utilisées. La figure 2 montre un noyau de blastomères avec un motif de signal normal (2 copies pour tous les loci testés) compatible avec un complément chromosomique normal ou équilibré pour le chromosome 5 et 9, et un noyau avec un modèle de signal anormal compatible avec un produit de la translocation déséquilibrée qui a monosomie (une copie) pour le segment transloqué du chromosome 5 et trisomie (3 copies) pour le segment transloqué du chromosome 9.

Figure 1 Un écart métaphase et un noyau interphasique préparés à partir de cultures de lymphocytes du sang périphérique à partir d'un porteur d'une translocation réciproque entre les bras courts des chromosomes 5 et 9 avec points d'arrêt à 5p14.3 et 9p24.1:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). Sondes FISH ont été sélectionnés pour les deux segments translocation (5p14.3 → 5pter, rouge Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, vert Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) et centrée sur le segment du chromosome 9 (9p24.1 → 9qter, bleu Abbott CEP 9 alpha-satellites SpectrumAqua).

Signaux Figure 2. Blastomère en interphase noyaux de jours-3 embryons capturées à l'aide d'un filtre différent pour chaque fluorochrome et ont fusionné pour former une image composite. (A) Deux signaux pour chaque sonde indiquant deux copies de chaque locus, ce qui est cohérent avec un complément normal ou équilibré pour les chromosomes de translocation. (B) Un signal rouge, vert et trois signaux de deux signaux bleu indiquant une copie du segment transloqué du chromosome 5, trois copies du segment transloqué du chromosome 9 et deux copies du segment centrique du chromosome 9, ce qui est cohérent avec les voisins -1 ségrégation de la translocation résultant en un produit déséquilibrée avec monosomie pour 5p14.3 → 5pter et une trisomie pour 9p24.1 → 9pter.

Discussion

L'application de l'hybridation fluorescente in situ (FISH) à une cellule d'embryon unique (blastomère) présente des défis particuliers à la fois dans les pratiques et dans l'interprétation du modèle de signal. La cellule de biopsie doit être réparti dans une zone pré-définie sur la lame afin de faciliter ses poissons de localisation suivants; un soin extrême doit être pris en veillant à ce que la cellule est lysée, que le cytoplasme a été dispersée, et que le noyau est visible et intacte, et, comme le diagnostic repose sur les résultats de cette cellule unique, la notation et l'interprétation stricte des lignes directrices devraient être appliquées. Toutefois, dans des mains expérimentées, le poisson est une technique robuste pour diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) en pratique clinique. Le principe du DPI par FISH est que les sondes spécifiques de la cible d'ADN marqués avec des fluorochromes différents ou haptènes peuvent être utilisés pour détecter le nombre de copies de loci spécifiques, et ainsi de détecter les déséquilibres chromosomiques associées à de ségrégation méiotique des réarrangements chromosomiques (1), y compris Robertsonienne translocations, translocations réciproques, inversions, et des réarrangements complexes (2). Le poisson peut aussi être utilisé pour sélectionner des embryons féminins dans les familles avec X-linked maladie, pour laquelle il n'existe pas de test de mutation spécifique (3, 4). De façon plus controversée, le poisson a également été utilisé pour dépister l'aneuploïdie chromosomique sporadiques afin d'essayer d'améliorer l'efficacité de la reproduction assistée (5, 6); toutefois, la valeur prédictive de ce test à l'aide FSIH est susceptible d'être trop bas dans la plupart des gens les mains et il n'est pas recommandé pour une utilisation clinique de routine (7). Cet article se concentre sur les aspects techniques et les limites de la FISH appliquée aux cliniques unicellulaires diagnostic.

Les méthodes de propagation et la fixation des blastomères simples comprennent méthanol / acide acétique (5, 8), Tween / HCl (9), et une combinaison de Tween / HCl et méthanol / acide acétique (10). Les variations incluent le traitement hypotonique des cellules avant l'épandage et / ou la pepsine et le traitement paraformaldéhyde après fixation. La méthode doit être correctement validé pour le laboratoire (14). La méthode Tween / HCl est décrite en détail dans cet article. La méthode Tween / HCl est techniquement simple et hautement reproductibles dans différents laboratoires. Cette méthode peut être utilisée pour préparer des noyaux simples pour le diagnostic FISH de la détermination du sexe et des réarrangements chromosomiques avec une précision acceptable de diagnostic (7).

Mêle sonde peut combiner directement et indirectement étiqueté sondes marquées, et des sondes de différents fabricants. Sondes pour connaître les régions du chromosome polymorphe (11, 12), ou ceux qui sont connus de contre-s'hybrider de façon significative avec d'autres chromosomes (13) doit être évitée, mais peut être utilisé s'il est démontré d'être précis et adapté à un DPI par des essais préalables sur les deux partenaires de reproduction . Fluorochromes disponibles / haptènes et des stratégies pour les sondes discriminante sont les suivantes: le rouge Texas (TR), l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondes biotinylées détectés avec TR-avidine, FITC-avidine, ou Cy-5 streptavidine (visualisés à l'aide d'un filtre Farred), un mélange de sondes rouges et vertes pour produire un signal jaune, un second tour de l'hybridation et une troisième couleur créé par la capture séquentielle des SpectrumOrange utilisant un TexasRed et un filtre SpectrumGold).

Un ensemble de sondes contenant trois sondes, spécifiques pour les régions de l'centromère des chromosomes X et Y et un autosome, est recommandé pour la détermination du sexe (14); la sonde autosomique est utilisé pour établir la ploïdie et ainsi faire la différence entre X trisomie (2n, 47 , XXX) et triploïdie (3n, 69, XXX), et entre tétrasomie X (48, XXXX) et tétraploïdie (4n, 92, XXXX). Une sonde typique située à appliquer dans ce contexte est le mélange AneuVysion Abbott contenant l'alpha-satellites X, Y, et 18; cet ensemble de sonde a été démontré que le polymorphisme ont un taux très faible, et donc de pré-traitement du travail de reproduction des partenaires Il n'est pas nécessaire (14).

Le mélange de sonde pour tout réarrangement spécifique doit: Idéalement contiennent des sondes au moins suffisant pour détecter tous les produits attendus de la transposition à un déséquilibre chromosomique. Si cela n'est pas possible, la sonde se mélange où les produits détectés déséquilibrés ont été évalués comme non viables dans une grossesse reconnaissables et sont susceptibles d'avoir une très faible prévalence peut être acceptable (14). Être testés sur des cultures de lymphocytes métaphases des deux partenaires de la reproduction. Au moins dix propage métaphase devraient être examinés pour la spécificité de la sonde, polymorphismes et hybridation croisée, et, pour le transporteur réarrangement chromosomique, afin de s'assurer que les sondes hybrident comme prévu aux différents segments du réarrangement. En outre, au moins 100 noyaux interphasiques de ces préparations doit être marqué d'évaluer la spécificité du signal, la luminosité et discret (14).

Commercial ensembles PGS sonde sont disponibles (par exemple, Abbott MultiVysion PB ou TCP), en ciblant les chromosomes les plus fréquemment trouvés à aneuploïdes dans les produits de la conception, et comprenant une seule sonde par chromosome ciblé. Typiquement le noyau peut avoir un seconde hybridation avec des sondes pour les chromosomes supplémentaires fournissant un test pour les chromosomes 13, 15, 16, 18, 21, 22, et XY (14). La valeur prédictive de ce test en utilisant la diffusion et la technique de FISH décrite ici est susceptible d'être beaucoup trop faible dans les mains de la plupart des gens et il n'est pas recommandé pour une utilisation clinique de routine (7, 15).

Des techniques telles que l'hybridation génomique comparative (CGH) appliquée à des cellules individuelles sont en mesure de tester pour le nombre de copies de chaque chromosome (Wilton et al. 2001), et l'utilisation de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) des tableaux et l'analyse quantitative (Wells et al . 2008) ou "karyomapping« génotypage (Handyside et al. 2009) sont prometteurs techniques alternatives pour détecter l'aneuploïdie chromosomique. Toutefois, la limite de résolution et de précision pour le déséquilibre du segment restent incertaines et il est probable que les poissons continuent d'être la technique de choix pour les réarrangements chromosomiques impliquant de petits segments.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrochloric Acid, 2.5L		VWR	101254H
Sodium Chloride, 5Kg		VWR	443827W
Potassium Chloride, 250g		VWR	26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g		VWR	102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g		VWR	10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g		VWR	28245.265
Tween20, 500mL		VWR	663684B
Ethanol, 2.5L		VWR	8.18760.2500	Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg		VWR	27833.363
Cow Gum, 250mL		Cow Proofings Ltd.	No longer available	Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul		Cytocell	DES500L	150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL		Boots	10088316001
Amine-coated Slides, 25		Genetix	K2615
DAPI, 0.1mL		Sigma-Aldrich	D-9542
Vectashield, 10mL		Vector Laboratories	H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2016
FITC-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL		GE Healthcare	PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500		Thistle Scientific	AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000		Thistle Scientific	AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400		Sterilin	128B	Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick		VWR VWR VWR	451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes		Fisher Scientific	PMK-300-052R
Dissecting Microscope		Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes		NHS SUPPLY CHAIN	MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays		VWR	682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece		Scientific Laboratory Supplies	HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter		Fisher Scientific	FDM-340-010U
Diamond Pen		VWR	818-0021
Hot Block for Slides		Thermo Hybaid	HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll		NHS SUPPLY CHAIN	MJT004
Schieferdecker Jar		VWR	631-9313
Coplin Jar		VWR	631-9331
Forceps, Fine		VWR	232-2123
Forceps, Blunt		VWR	232-2113
1000mL Beaker		VWR	213-1642
Phase Contrast Microscope		Nikon	E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100		Fisher Scientific (Raymond Lamb)	SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3206
1mL Syringe, box of 100		NHS Supply Chain	FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000		Thistle Scientific	AX-T-1000-C-L-R
Incubator		LEEC
Waterbath		Grant	W22
Alcohol Thermometer				Various sources available
pH Meter		Jenway	3305
pH Electrode		VWR	662-1759	BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer		Bibby	HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500		Scientific Laboratory Supplies	PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m		VWR	291-1214