FISH per preimpianto Diagnosi Genetica

Riepilogo

Questo articolo descrive la scelta di sonde adatte per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla diagnosi genetica pre-impianto (PGD) in ambito clinico.

Abstract

Diagnosi pre-impianto genetico (PGD) è un'alternativa stabilito per la diagnosi prenatale, e coinvolge la selezione pre-impianto degli embrioni da una coorte generato dalla tecnologia di riproduzione assistita (ART). Questa selezione può essere richiesto a causa di malattie monogeniche familiare (per esempio la fibrosi cistica), o perché uno dei partner porta un riarrangiamento cromosomico (ad esempio un doppio senso traslocazione reciproca). PGD ​​è disponibile per coppie che hanno avuto precedenti figli affetti, e / o nel caso di riarrangiamenti cromosomici, aborti ricorrenti o infertilità. Ovociti aspirati stimolazione ovarica seguito vengono fecondati in vitro da parte in immersione nel liquido seminale (IVF) o mediante iniezione intracitoplasmatica di un singolo spermatozoo (ICSI). Pre-impianto scissione embrioni allo stadio sono sottoposte a biopsia, di solito con la rimozione di una singola cellula il 3 ° giorno post-fertilizzazione, e la cellula biopsia è testato per stabilire lo status genetico dell'embrione. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei fisso di cellule sottoposte a biopsia con target specifici per sonde di DNA è la tecnica di scelta per rilevare squilibrio cromosoma associata a riarrangiamenti cromosomici, e di selezionare gli embrioni femminili nelle famiglie con X-linked malattia per la quale non vi è nessuna mutazione specifica di test. PESCE è stato utilizzato anche per gli embrioni schermo per aneuploidie dei cromosomi spontanea (noto anche come PGS o PGD-AS) al fine di cercare di migliorare l'efficienza di riproduzione assistita, tuttavia, il valore predittivo di questo test utilizzando la diffusione e la tecnica FISH descritta qui è probabile che sia inaccettabilmente basso nelle mani di molte persone e non è raccomandato per l'uso clinico di routine. Descriviamo la selezione di apposite sonde per singola cella PESCE, tecniche di estensione per i nuclei blastomeri, e ibridazione in situ e segnando segnale, applicato alla PGD in ambito clinico.

Protocollo

1. Lisi e diffondere un nucleo da una biopsia di blastomeri

1. Buffer di lisi cellulare per diffusione di cellule (0,2% Tween20 di 0,01 M HCl, pH 2,0) deve essere preparato 24 ore di anticipo e conservati a -20 ° C. La preparazione di 100 ml e filtrare 20 ml in un contenitore sterile da 30 ml universale usando una siringa da 20 ml sterile e filtro siringa. Dispensare 1 ml di aliquote in 15/10 1,7 mL microcentrifuga sterili, chiudere ed etichettare le provette prima del congelamento. Si raccomanda di avere due partite diverse è uso, il nuovo lotto e il lotto precedente, che è stato testato e può essere utilizzato se il nuovo lotto non è soddisfacente.
2. Sbrinare il tampone di lisi a temperatura ambiente 30 minuti prima della procedura di biopsia. Ai fini pratici, la temperatura di esercizio sarà tra temperatura ambiente e temperatura della mano.
3. Punteggio ottenuto un piccolo cerchio (circa 5 mm di diametro) sul lato inferiore di una ammina rivestite scorrimento (ad esempio Genetix) utilizzando una penna di diamante e pre-etichetta la diapositiva con il numero del caso, numero di diapositiva unico, e data la biopsia. Utilizzare un vetrino separato per ogni blastomero in ordine numerico, e l'etichetta con il numero degli embrioni. Vetrini devono essere etichettati con una matita dura come 4H, e "cancellati" con un guanto in lattice per rimuovere la polvere di grafite.
4. Mettere un piccolo volume di tampone di lisi all'interno del cerchio.
5. Trasferire il blastomero biopsia nel buffer di lisi. Se necessario aggiungere tampone di lisi all'interno del cerchio fino a quando la cellula comincia a lisare, la cellula deve lisare completamente e il citoplasma disperdersi prima che si asciughi buffer.
6. Osservare il nucleo di modo che esso rimanga all'interno del cerchio e non è perduto, se la cella non ha un nucleo o ha nuclei multipli, biopsia un'altra cella.
7. Lasciare il vetrino asciugare all'aria a temperatura ambiente.

2. Ibridazione in situ di un nucleo singolo blastomero

1. Preparare una serie di etanolo (70, 90 e 100%) costituita in acqua distillata sterile.
2. Attivare e impostare il blocco caldo (ad esempio Hybaid Omnislide o Vysis Hybrite) a 75 ° C.
3. Sonde di sbrinamento, vortice, e centrifuga. I reagenti devono essere assistito e verificato di essere corretto prima che compongono la miscela della sonda. Volumi pipetta come specificato dal costruttore per costituire la miscela della sonda in una provetta da microcentrifuga 0,65 ml sterile e vortex e centrifugare prima dell'uso. Il volume totale della miscela sonda dovrebbe essere sufficiente per consentire 2 microlitri per ogni nucleo da testare e arrotondato al più vicino 10 microlitri per consentire un margine di sicurezza.
4. Prelavaggio i vetrini in vaschette Coplin con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M di NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO ₄₎ per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Sciacquare i vetrini due volte in acqua distillata sterile.
6. Disidratare le diapositive con la serie di etanolo (70, 90 e 100%) per 2 minuti ciascuna a temperatura ambiente e aria secca. Garantire scivoli sono completamente immersi e se la polvere di grafite galleggia in superficie, assorbire con un panno pulito.
7. Registrare la posizione del nucleo all'interno del cerchio da visualizzare con un microscopio a contrasto di fase.
8. Disidratare con il 100% di etanolo per 2 minuti a temperatura ambiente e aria secca.
9. Applicare 2 l di miscela della sonda, e coprire con un 9 x 9 millimetri coprioggetto (un quarto di un 18 millimetri x 18 n.1 coprioggetto).
10. Sigillare i bordi del coprioggetto con gomma cemento (ad esempio Mucca Gum, correzione di mucca).
11. Codenature i vetrini su un blocco calda a 75 ° C per 5 minuti, e poi ibridare le diapositive durante la notte (16-20 ore) in una camera umidificata a 37 ° C. Mescola sonda che è interamente costituita da sonde centromero (ad esempio per casi legato al sesso) darà un risultato soddisfacente dopo 60 min di ibridazione.
12. Preparare un bagno d'acqua con sufficiente vaschette Coplin e calore a 71 ° C.
13. Preparare una 0.4x citrato standard di soluzione salina (CSD), soluzione di lavaggio stringente (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M di NaCl, 6 mm C ₆ H ₅ Na ₃ O ₇ .2 H ₂ O) e di calore nel bagno d'acqua.
14. Dispensare 50 ml di lavaggio stringente per Coplin vaso richiesti e controllare che la temperatura è 71 ° C immediatamente prima dell'uso con un termometro pulito.
15. Rimuovere con cura il mastice di ogni diapositiva e risciacquare il coprioggetto utilizzando 4x SSC/0.05 Tween20% (pH 7,0) a temperatura ambiente.
16. Lavare le diapositive nel lavaggio 0.4x SSC stringenti a 71 ° C per 5 min. Lavare non più di 6 diapositive per vaschetta Coplin.
17. Lavare i vetrini in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min.
18. Se la miscela contiene sonda sonda indirettamente etichettati (s), scaricare le diapositive del liquido in eccesso e applicare 20 l di anticorpo fluorescente coniugato con un 20 x 20 mm quadrati di Parafilm.
19. Incubare in una camera umidificata a 37 ° C per 15 minuti.
20. Rimuovere il Parafilm e lavare una volta in 4x Tween20 SSC/0.05% a temperatura ambiente per 2 min.
21. Lavare due volte per 2 min in PBS, unt temperatura ambiente e drenare le diapositive.
22. Applica 6 ml di DAPI / Vectashield (160 ng di 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato in 1 ml di terreno Vectashield montaggio, Vector Laboratories) ad un 22 x 22 mm cod. 0 coprioggetto e invertire il vetrino sopra il coprioggetto.
23. Blot e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente.

3. Analisi utilizzando un microscopio a fluorescenza opportunamente attrezzato di appositi filtri per la sonde utilizzate.

1. Segnali punteggio visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a fluorescenza e singoli filtri passa-banda per ogni fluorocromo nel saggio. Ogni nucleo dovrebbe essere segnato da due analisti. Una regola generale dovrebbe portare al gol di un segnale unico in cui due segnali molto vicine tra loro sono meno di un dominio (segnale di larghezza) a parte, tuttavia, il giudizio sulla base dell'esperienza deve essere esercitato per interpretare i segnali di varie dimensioni, intensità, e la separazione.
2. Utilizzare software di imaging (ad esempio Iside, MetaSystems, Altlußheim, Germania; CytoVision, Genetix) per catturare un'immagine del nucleo per la conferma della diagnosi visiva, e per la archiviazione delle immagini come parte di un piano di assicurazione della qualità da laboratorio.

4. Rappresentante dei risultati:

Metafase e nuclei interfasici da colture di linfociti del sangue periferico devono essere esaminati per verificare che le sonde selezionati sono specifici per traslocazione dei cromosomi, informativo per i punti di interruzione (le sonde subtelomere dovrebbero ibridarsi solo ai segmenti traslocato e la sonda centromero (s) al centrica segmento (s)) e dei segnali in nuclei interfasici deve essere brillante e discreto. Segnando il numero di segnali per ogni sonda in 100 nuclei interfasici da ogni partner si consiglia di valutare l'efficacia del test. In questo caso 2 segnali sono stati segnati nel 95% -99% dei nuclei per ciascuna sonda. La figura 1 mostra una metafase e nucleo interfase da una preparazione per una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9.

Segnali in nuclei interfasici da blastomeri dell'embrione deve essere brillante e discreto e valutato con separato filtri passa banda per i colori utilizzati. La Figura 2 mostra un nucleo blastomero con un modello normale segnale (2 copie per tutti i loci testati) coerenti con un corredo cromosomico normale o bilanciato per il cromosoma 5 e 9, e un nucleo con un modello di segnale anomalo in linea con un prodotto della traslocazione sbilanciata che ha monosomia (una copia) per il segmento del cromosoma 5 traslocato e trisomia (3 copie) per il segmento traslocato del cromosoma 9.

Figura 1 Uno spread metafase e un nucleo interfase preparati da colture di linfociti del sangue periferico da un portatore di una traslocazione reciproca tra i bracci corti dei cromosomi 5 e 9 con punti di interruzione in 5p14.3 9p24.1 e:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +);. 9) 5ptel48-, 9ptel30 + ( Sonde FISH sono stati selezionati per entrambi i segmenti traslocato (5p14.3 → 5pter, rosso Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) e il segmento centrica del cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, blu Abbott CEP 9 alfa satellite SpectrumAqua).

Segnali Figura 2. Nuclei in interfase blastomero dal primo giorno-3 embrioni catturate utilizzando un filtro diverso per ogni fluorocromo e uniti per formare un'immagine composita. (A) due segnali per ogni sonda indicare due copie di ogni luogo, che è coerente con un complemento normale o bilanciato per traslocazione dei cromosomi. (B) Un segnale rosso, tre segnali verdi e due segnali blu che indica una copia del traslocato segmento del cromosoma 5, tre copie del segmento di traslocazione del cromosoma 9 e due copie del segmento centrica del cromosoma 9, che è coerente con adiacente -1 segregazione della traslocazione determinando un prodotto non bilanciato con monosomia per 5p14.3 → 5pter e la trisomia per 9p24.1 → 9pter.

Discussione

L'applicazione di ibridazione in situ fluorescente (FISH) in una singola cellula embrionale (blastomero) presenta sfide particolari sia nel aspetti pratici e per l'interpretazione del modello del segnale. La cella biopsia deve essere diffuso all'interno di una zona di pre-definito sulla diapositiva in modo da facilitare la sua localizzazione seguenti pesci; estrema cura deve essere presa per assicurare che la cellula subisce una lisi, che il citoplasma è stato disperso, e che il nucleo è visibile e intatto, e, come la diagnosi dipende dai risultati di questa singola cella, segnando rigorose e interpretazione linee guida dovrebbero essere applicate. Tuttavia, in mani esperte, FISH è una tecnica robusta per la pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) nella pratica clinica. Il principio della PGD mediante FISH è che l'obiettivo sonde specifiche di DNA marcati con fluorocromi diversi o apteni possono essere usati per rilevare il numero di copie di loci specifici, e quindi di rilevare lo squilibrio dei cromosomi associati a segregazione meiotica di riarrangiamenti cromosomici (1), tra cui robertsoniane traslocazioni, traslocazioni reciproche, inversioni, e riarrangiamenti complessi (2). PESCE può anche essere usato per selezionare gli embrioni femminili nelle famiglie con X-linked malattia, per cui non esiste nessuna mutazione specifica di test (3, 4). Più controverso, PESCE è stato utilizzato anche per lo screening per aneuploidie dei cromosomi sporadici al fine di cercare di migliorare l'efficienza di riproduzione assistita (5, 6), ma il valore predittivo di questo test utilizzando FSIH è probabile che sia inaccettabilmente basso nella maggior parte delle persone mani e non è raccomandato per uso clinico di routine (7). Questo articolo si concentra sugli aspetti tecnici e le limitazioni della FISH applicata alla clinica cella singola diagnosi.

Metodi di diffusione e di fissaggio blastomeri singolo includono metanolo / acido acetico (5, 8), Tween / HCl (9), e una combinazione di Tween / HCl e metanolo / acido acetico (10). Le variazioni includono il trattamento ipotonico delle cellule prima di diffondere e / o pepsina ed il trattamento paraformaldeide dopo la fissazione. Il metodo deve essere opportunamente convalidato per il laboratorio (14). Il Tween / HCl metodo è descritto in dettaglio in questo articolo. Il Tween / HCl metodo è tecnicamente semplice e altamente riproducibile in diversi laboratori. Questo metodo può essere utilizzato per preparare singoli nuclei per la diagnosi FISH della determinazione del sesso e riarrangiamenti cromosomici con accettabile accuratezza diagnostica (7).

Mescola sonda può combinare direttamente etichettati e indirettamente sonde marcate, e le sonde di diversi produttori. Sonde per conoscere regioni cromosomiche polimorfici (11, 12), o quelli noti a cross-ibridare in modo significativo con altri cromosomi (13) dovrebbe essere evitata, anche se può essere utilizzato se dimostrato di essere appropriate e specifiche per la PGD da test prima su entrambi i partner riproduttivo . Fluorocromi disponibile / apteni e le strategie per sonde discriminanti sono le seguenti: Texas Red (TR), isotiocianato di fluorescina (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sonde biotinilato rilevati con TR-avidina, coniugati con avidina, o Cy-5 streptavidina (visualizzato per mezzo di un filtro FarRed), un mix di sonde rosso e verde per la produzione di un segnale giallo, un secondo round di ibridazione e di un terzo colore creato catturando in sequenza di SpectrumOrange utilizzando un TexasRed e un filtro SpectrumGold).

Un insieme sonda contenente tre sonde, specifici per le regioni del centromero i cromosomi X e Y e autosoma uno, è raccomandato per la determinazione del sesso (14), la sonda autosomica viene utilizzato per stabilire ploidia e quindi a distinguere tra X trisomia (2n, 47 , XXX) e triploidia (3n, 69, XXX), e tra tetrasomia X (48, XXXX) e tetraploidia (4n, 92, XXXX). Una sonda applicata in tipico di questa impostazione è il mix AneuVysion Abbott contenenti alpha-satellite X, Y, e 18; questo set sonda ha dimostrato di avere un tasso di polimorfismo molto basso, e quindi pre-trattamento work-up dei partner riproduttivo non è necessaria (14).

Il mix di sonda per qualsiasi riordinamento specifici devono: Idealmente contenere sonde almeno sufficiente a rilevare tutti i prodotti attesi del riassetto con squilibrio cromosomico. Se ciò non fosse possibile, la sonda si mescola in cui i prodotti non rilevati sbilanciato sono stati valutati per essere non vitali in una gravidanza riconoscibile e possono avere prevalenza molto bassa può essere accettabile (14). Essere testato su colture metafasi di linfociti da entrambi i partner riproduttivo. Almeno dieci diffonde metafase devono essere esaminati per la specificità della sonda, polimorfismi e cross-ibridazione, e, per il vettore riarrangiamento cromosomico, per garantire che le sonde ibridano come previsto ai diversi segmenti del riassetto. Inoltre, almeno 100 nuclei interfasici da questi preparati dovrebbero essere segnati per valutare la specificità del segnale, la luminosità e discretezza (14).

Commercial set sonda PGS sono disponibili (ad esempio Abbott MultiVysion PB o PGT), intese a promuovere l'cromosomi più frequentemente trovato per essere aneuploidi in prodotti del concepimento, e composta da una singola sonda per cromosoma mirati. In genere il nucleo può avere una seconda ibridazione con sonde per i cromosomi supplementari destinate a fornire un test per i cromosomi 13, 15, 16, 18, 21, 22, e XY (14). Il valore predittivo di questo test utilizzando la diffusione e la tecnica FISH qui descritto è probabile che sia inaccettabilmente basso nelle mani di molte persone e non è raccomandato per l'uso clinico di routine (7, 15).

Tecniche come ibridazione genomica comparativa (CGH) applicata a singole cellule sono in grado di testare per il numero di copie di ogni cromosoma (Wilton et al. 2001), e l'utilizzo di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) array e analisi quantitativa (Wells et al . 2008) o genotipizzazione "karyomapping" (Handyside et al. 2009) sono promettenti tecniche alternative per rilevare aneuploidie dei cromosomi. Tuttavia, il limite di risoluzione e precisione lo sbilanciamento segmento rimangono incerte ed è probabile che PESCE continuerà ad essere la tecnica di scelta per i riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono piccoli segmenti.

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrochloric Acid, 2.5L		VWR	101254H
Sodium Chloride, 5Kg		VWR	443827W
Potassium Chloride, 250g		VWR	26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g		VWR	102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g		VWR	10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g		VWR	28245.265
Tween20, 500mL		VWR	663684B
Ethanol, 2.5L		VWR	8.18760.2500	Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg		VWR	27833.363
Cow Gum, 250mL		Cow Proofings Ltd.	No longer available	Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul		Cytocell	DES500L	150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL		Boots	10088316001
Amine-coated Slides, 25		Genetix	K2615
DAPI, 0.1mL		Sigma-Aldrich	D-9542
Vectashield, 10mL		Vector Laboratories	H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2016
FITC-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL		GE Healthcare	PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500		Thistle Scientific	AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000		Thistle Scientific	AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400		Sterilin	128B	Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick		VWR VWR VWR	451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes		Fisher Scientific	PMK-300-052R
Dissecting Microscope		Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes		NHS SUPPLY CHAIN	MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays		VWR	682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece		Scientific Laboratory Supplies	HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter		Fisher Scientific	FDM-340-010U
Diamond Pen		VWR	818-0021
Hot Block for Slides		Thermo Hybaid	HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll		NHS SUPPLY CHAIN	MJT004
Schieferdecker Jar		VWR	631-9313
Coplin Jar		VWR	631-9331
Forceps, Fine		VWR	232-2123
Forceps, Blunt		VWR	232-2113
1000mL Beaker		VWR	213-1642
Phase Contrast Microscope		Nikon	E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100		Fisher Scientific (Raymond Lamb)	SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3206
1mL Syringe, box of 100		NHS Supply Chain	FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000		Thistle Scientific	AX-T-1000-C-L-R
Incubator		LEEC
Waterbath		Grant	W22
Alcohol Thermometer				Various sources available
pH Meter		Jenway	3305
pH Electrode		VWR	662-1759	BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer		Bibby	HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500		Scientific Laboratory Supplies	PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m		VWR	291-1214