Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Résumé

Cet article présente une cytométrie en flux à base méthode pour étudier la composition immunitaire des aortes. Le document montre aussi une technique supplémentaire qui permet d'examiner l'adventice environnante et paroi de la cuve séparément. Cette méthode ouvre des possibilités d'effectuer des analyses phénotypiques des leucocytes aortique et appliquer plusieurs tests immunologiques pour les études de l'athérosclérose.

Résumé

L'athérosclérose est un processus inflammatoire chronique des navires de taille moyenne et grande taille qui se caractérise par la formation de plaques constituées de cellules de la mousse, les cellules immunitaires, les cellules vasculaires endothéliales et musculaires lisses, les plaquettes, la matrice extracellulaire, et un noyau riche en lipides avec une nécrose extensive et fibrose des tissus environnants. ¹ Le bras innée et adaptative de la réponse immunitaire sont impliqués dans l'initiation, le développement et la persistance de l'athérosclérose. ^{2, 3} Il existe un important corpus de preuves que différents sous-ensembles des cellules immunitaires, telles que les macrophages, dendritiques cellules, les lymphocytes T et B, sont présents dans les aortes des souris saines et l'athérosclérose sujettes ^4. En outre, les cellules immunitaires se trouvent dans l'adventice aortique entourant ce qui suggère un rôle important de ce tissu dans l'athérogenèse. ²

Depuis quelque temps, la détection quantitative des différents types de cellules immunitaires, leur état d'activation, et la composition cellulaire dans la paroi aortique a été limitée par RT-PCR et les méthodes immunohistochimiques pour l'étude de l'athérosclérose. Peu de tentatives ont été faites pour réaliser la cytométrie en flux utilisant aortes humaines, et un certain nombre de problèmes, comme une autofluorescence élevée, ont été rapportés ^5,6. Homme plaques d'athérosclérose ont été digérés par la collagénase 1, et les cellules libres ont été recueillies et colorées pour CD14 + / CD11c + pour mettre en évidence des cellules spumeuses macrophages dérivés. Dans cette étude, une "maquette" canal a été utilisé pour éviter les faux positifs coloration. ⁶ matériaux nécrotiques s'accumulent au cours du processus de digestion donner lieu à une grande quantité de débris qui génère une autofluorescence élevées dans les échantillons de l'aorte. Pour résoudre ce problème, un panneau de contrôles positifs et négatifs a été proposée, mais seulement double coloration pourrait être appliqué dans ces échantillons. Nous avons développé un nouveau flux cytométrie méthode basée sur ⁷ pour analyser la composition des cellules immunitaires et de caractériser l'activation, la prolifération, la différenciation des cellules immunitaires dans l'aorte saine et l'athérosclérose sujettes. Cette méthode permet l'étude de la composition des cellules immunitaires de la paroi aortique et ouvre des possibilités d'utiliser un large éventail de méthodes immunologiques pour les enquêtes sur les aspects immunitaires de cette maladie.

Protocole

1. Isolement des aortes murines

L'approbation du comité institutionnel IACUC de la procédure est nécessaire pour travailler avec des souris.

1. Préparer heparinzed PBS en ajoutant 1000 unités d'héparine sodique à 50 ml de PBS et en inversant le tube pour mélanger. Préparer un tube de collecte vide pour le sang et un tube contenant du PBS pour chaque aorte à être collectées. Conservez tous les tubes sur la glace.
2. Hépariner une seringue pour prélever du sang (0,1 ml d'Héparine sodique 1000 U / ml), préparer les outils chirurgicaux (deux paires de pinces courbes, une paire de ciseaux à disséquer, et une paire de microshears), et une scène de dissection pour la dissection.
3. Euthanasier une souris en utilisant le dioxyde de carbone dans une chambre approuvés à la suite des NIH et institutionnel des politiques du comité IACUC sujet de l'euthanasie des rongeurs. Vérifier l'efficacité avant de transférer la souris à l'étape de dissection.
4. Brièvement tremper les souris avec 70% d'éthanol et fixez la souris à l'étape de la dissection. Prélever du sang de la souris par ponction cardiaque.
5. Ouvrez les cavités abdominales et thoraciques. En utilisant une seringue de 10 ml avec une aiguille de 25 g, complètement perfuser le système vasculaire avec du PBS contenant 2% de l'héparine pour supprimer complètement le sang des vaisseaux par ponction cardiaque. Assurez-vous qu'il n'y a pas de sang dans les tissus aortiques. La perfusion doit être effectuée lentement, avec peu de pression pour s'assurer que toutes les plaques dans la paroi des vaisseaux restent intacts.
6. Disséquer et enlever les organes viscéraux, les organes génito-urinaires, le diaphragme et la rate, laissant les reins, le cœur et l'aorte intacte.
7. Soigneusement disséquer les tissus adipeux et les ganglions lymphatiques para-aortiques loin de l'aorte, laissant l'aorte et l'adventice intacte. Recueillir l'aorte entier, y compris l'arc aortique, ascendant, descendant, thoraciques, abdominales et des portions. Placez l'aorte isolée dans un tube collecteur avec du PBS. Pendant la procédure d'isolement, essayez de garder l'humidité du bâtiment.

2. Préparation des suspensions cellulaires simples

1. Créer une aorte 1X solution de dissociation enzymatique des stocks (ADES) (125 U / ml de collagénase de type XI, 60 U / ml de type hyaluronidase 1-s, 60 U / ml de DNase I, et 450 U / ml collagénase de type I, dans 2,5 ml de PBS, modifié par Galkina et al. ^7). Toutes les enzymes sont de Sigma-Aldrich. Placer la solution enzymatique d'actions sur la glace.
2. Retirez le CPE du tube contenant l'aorte. Ajouter 2,5 ml de 1X ADES à chaque aorte. Couper les aortes en petits morceaux pour faciliter la digestion enzymatique ou quittent l'aorte entière intacte. Incuber les aortes avec la solution enzymatique 1X pendant 1 heure à 37 ° C (plus lent secousse est optionnel).
3. Suite à l'incubation de 1 heure, préparer des suspensions seule cellule de l'aorte digérés par cisaillement les aortes part et les passant à travers une passoire 70 um cellule dans 5ml polypropylène FACS tubes (BD Falcon). Pellet les cellules par centrifugation (400xg, à 5 minutes, 4 ° C).
4. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon FACS (PBS supplémenté avec 1% de BSA et 0,05% NaN ₃₎ et de déterminer combien de cellules sont présentes dans la suspension cellulaire aortique utilisant le bleu trypan, un hémocytomètre, et d'un microscope optique. Le nombre total de cellules obtenues après la digestion dépend de l'âge de la souris et le régime alimentaire ou la sévérité de l'athérosclérose.

3. Coloration par cytométrie en flux

1. Étiquette d'un nombre approprié de tubes FACS nouvelle. En général, les expériences de cytométrie en flux doit avoir un tube témoin non souillé, jeu de tubes de couleur unique, appropriée par fluorescence-moins-un contrôle (FMO) ^8, les contrôles isotype approprié, et un ensemble de tubes expérimentaux. Comme il ya un nombre limité de leucocytes aortique qui peut être isolé, leucocytes spléniques peuvent être utilisés pour effectuer des taches de contrôle unique.
2. Nous utilisons un protocole de cytométrie de flux standard pour colorer les suspensions cellulaires aortique. Brièvement, le transfert d'une partie aliquote de 0,5-1x10 ⁶ cellules d'une suspension de cellules dans un tube de l'aorte FACS (s). Ajouter 1 ml de tampon FACS et un culot cellulaire par centrifugation. Retirer le surnageant des cellules en culot par décantation.
3. Préparer la solution de bloc Fc des anticorps et des cocktails pour les tubes expérimentaux, la fluorescence-moins-un des tubes, des tubes et des isotypes. Ajouter 100 pi de Fc bloc tampon FACS (14.2μg/ml, clone 2.4G2) pour l'ensemble des tubes et de feuilleter un doigt ou doucement au vortex pour remettre les cellules. Incuber les échantillons pendant 15-20 minutes à température ambiante.
4. Préparer coloration des anticorps, des taches ou des cocktails isotype FMO coloration de contrôle. Déterminer la concentration optimale d'anticorps dans vos expériences de titration préliminaire. En présence de bloc de Fc, ajouter des cocktails d'anticorps (100ul/0.5-1.0x10 ⁶ cellules) pour les tubes d'échantillons. Incuber pendant 20-30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
5. Ajouter 1ml de tampon FACS dans chaque tube, vortex pour mélanger, et un culot de cellules par centrifugation. Répétez la procédure une fois de plus.
6. Décanter le surnageant et remettrele culot cellulaire dans 300μl de 2% en PFA. Exécuter les échantillons sur un cytomètre en flux.
   • Remarque: Généralement d'anticorps anti-CD45 (antigène leucocytaire commun marqueur) est ajoutée à l'ensemble des échantillons en vue de la porte de leucocytes CD45 ⁺ tard ⁷ En outre, CD45 FMO et contrôle isotype doit être d'abord utilisé pour placer la porte leucocytes CD45 ⁺ que. CD45 expression peut varier parmi les leucocytes.
   • Remarque: Pour détecter la faible densité exprimant des antigènes de surface ou d'antigènes événement de bas, utilisez "fluorochromes brillant" comme le R-phycoérythrine (PE) ou allophycocyanine (APC). En outre, les événements rares peut être détecté par la mise en commun de plusieurs aortes correspondre ensemble, mais si plus d'un million de cellules sont utilisées, la quantité d'anticorps utilisés par test devrait être augmenté proportionnellement.
   • Remarque: Pour s'assurer qu'il ya un minimum de sang contaminations dans les aortes isolées et par conséquent dans la suspension de cellules de l'aorte, dans certaines expériences coloration supplémentaire a été effectué pour les TER-119, ⁷ un antigène exprimé par les globules rouges (RBC). Le nombre de RBC aux globules blancs (WBC) dans le sang est d'environ 10x10 ⁶ cellules / ul à 8x10 ³ cellules / ul. Basé sur l'expression des TER-119 dans des échantillons de l'aorte, le pourcentage de dérivés du sang les globules blancs dans l'échantillon peut être calculée. Typiquement, nous avons moins de 0,02% de dérivés du sang WBC dans des échantillons de l'aorte. (Fig.1)
   • Remarque: Comme le traitement enzymatique peut affecter l'expression des antigènes de surface, la résistance à la digestion enzymatique devrait être déterminé pour les antigènes d'intérêt. Brièvement, les ganglions lymphatiques périphériques (PLN) ou de petits morceaux de la rate sont incubées avec ou sans cocktail enzymatique pendant 1 heure à 37 ° C. Après 1 heure, l'expression des antigènes est déterminée par cytométrie en flux. Le cocktail enzymatique n'a aucun effet sur ​​de multiples antigènes de surface (Fig.2) ^7. Dans d'autres cas, le traitement enzymatique a entraîné une perte significative de l'expression des antigènes. Ce problème peut être contourné en utilisant des marqueurs cellulaires alternatives.
   • Remarque: Live / Dead coloration viabilité des cellules peut être réalisée après l'étape 4, si désiré. Typiquement utiliser Live / Dead kit Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen, Molecular Probes). Pour tacher les cellules avec un colorant Live / Dead, de créer une solution 1x Live / Dead en ajoutant 1 microlitre de la re-dissous vivants / morts colorant dans 1ml de PBS et de vortex pour mélanger. Ajouter 100 à 200 l de colorant 1x Live / Dead à l'vivants / morts unique, un cocktail, la FMO et des échantillons de contrôle isotypique. Incuber les échantillons avec le colorant à la température ambiante pendant 10 minutes dans l'obscurité. Le tube de contrôle unique pour Live / Dead doivent être incubées à 56 ° C dans l'obscurité pendant 10 minutes pour tuer les cellules par choc thermique. Laver les cellules avec 1 ml de PBS et un culot de cellules par centrifugation. Reprendre le protocole à l'étape 5.
   • Remarque: coloration intracellulaire des antigènes intracellulaires et des cytokines est compatible avec ce protocole. Brièvement, la coloration intracellulaire peut être effectuée en utilisant la fixation de cellules / réactifs de perméabilisation de BD Pharmingen, eBioscience, ou des laboratoires Caltag - selon les antigènes d'intérêt. Pour fixer et perméabiliser les cellules pour la coloration intracellulaire, effectuer l'étape de fixation / perméabilisation, suivant les instructions du fabricant, après l'étape de coloration extracellulaire (section 3, étape 5). Après l'étape de lavage intracellulaire, reprendre notre protocole à l'étape 6 (section 3, étape 6).

4. L'analyse par cytométrie en flux des isolés entourant l'adventice et la paroi des vaisseaux

Comme les leucocytes peuvent migrer vers l'adventice aortique ainsi que les plaques d'athérosclérose dans la paroi aortique, d'examiner les leucocytes adventiciel et aortique par cytométrie en flux d'un protocole pour isoler et effectuer la cytométrie de flux sur ces deux sites anatomiques a été développé. ⁹ brièvement, avant de les aortes toute sont digérés par l'ADES (Section 2, étape 2) l'adventice aortique est partiellement digérés et enlevée du reste du navire. Une fois que l'adventice est enlevé et mis de côté, le reste de l'aorte est digéré par l'ADES pour libérer les leucocytes de la paroi du vaisseau.

• Aortique adventice isolement Protocole

1. Suite à la préparation de 1X ADES (article 2 de l'étape 1), préparer 2,5 ml / aorte de 1X aortique adventice solution enzymatique de digestion (AADES) (781.25 U collagénase II et 14.0625 U élastase dans 2.5mls PBS (Worthington Biochemical Corp, Lakewood, New Jersey )). ⁹ Placez la solution stock sur la glace jusqu'à utilisation.
2. Retirez le CPE du tube contenant l'aorte. Ajouter 2,5 ml de 1X à chaque AADES aorte. Ne pas couper les aortes en petits morceaux. Incuber les aortes avec la solution 1X enzyme adventice pendant 10-20 minutes à 37 ° C.
3. Après la digestion 10-20 minutes, le transfert de l'aorte partiellement digérés de la 1X AADES à une boîte de Pétri avec du PBS frais. Très soigneusement, en utilisant deux paires de pinces courbes, peler la couche adventiciel loin from l'aorte comme une seule unité.
   • Remarque: les temps de digestion plus longues rendent plus faciles à enlever l'adventice, mais si l'adventice est sur-digérée qu'il va déchirer.
4. Lorsque l'adventice a été complètement enlevé, le transfert de l'adventice et de l'aorte de se séparer des tubes FACS. Ajouter 1ml de PBS sur le tube de l'adventice, et placer le tube sur la glace. Ajouter 2,5 ml de solution enzymatique 1X aorte de dissociation au tube aorte et incuber l'aorte pendant 40 minutes à 37 ° C.
   • Note: Pour faciliter la digestion enzymatique, l'aorte peut être divisé en petits morceaux à ce point.
5. Après la digestion de 40 minutes, placer le tube sur la glace et l'aorte, préparer des suspensions seule cellule de l'aorte et l'adventice par cisaillement les aortes et l'adventice à part et les passant à travers une passoire 70 um cellule dans 5ml polypropylène FACS tubes (BD Falcon). Pellet les cellules par centrifugation (400xg, à 5 minutes, 4 ° C). Retourner à l'étape 4 l'article 2 et de reprendre le protocole.

5. Les résultats représentatifs

Nous présentons ici un certain nombre de chiffres qui démontrent la cytométrie en flux coloration pour analyser la composition immunitaire des aortes ensemble, la paroi des vaisseaux de l'aorte et l'adventice aortique environnantes. Premièrement, nous démontrons une parcelle représentative FACS qui montre un TER-119 sur la coloration du sang total et de suspension de cellules isolées aortique (figure 1). TER-119 positives globules rouges représentaient 18% des cellules dans la suspension de cellules de l'aorte, ce qui indique que seuls 0,014% des cellules isolées à partir de suspensions cellulaires aortique sont dérivés du sang. Ceci est une expérience de contrôle important qui démontre clairement que les navires digéré, mais pas le sang circulant périphérique est la source de la plupart des leucocytes analysés dans la suspension de cellules aortiques. En outre, pour valider la méthode, nous avons évalué les effets de la dissociation de l'aorte cocktail enzymatique sur les antigènes de surface de splénocytes (Fig. 2). Le cocktail enzymatique n'a pas d'effets sur l'expression de plusieurs antigènes, y compris, CD45, CD19, CD3, TCRap, TCRγδ et plusieurs autres antigènes de surface ^7.

CD45 coloration en conjonction avec le colorant de viabilité Live / Dead et de contrôles appropriés isotype sont utilisés pour détecter et sous-populations de la porte d'intérêt majeur et d'exclure les débris cellulaires pendant l'analyse. Dans la Fig.3, l'aorte direct leucocytes CD45 ⁺ ont été fermée pour déterminer le pourcentage de l'IFN _Υ + cellules T dans les aortes regroupée de deux jeunes Apoe ^{- / -} souris. Pour souligner la polyvalence de cette méthode, en utilisant le système de déclenchement présentés dans Fig.3, nous présentons dans la Fig.4 coloration intracellulaire représentant pour CD68 + CD11b + macrophages et IFN + + TCRap cellules provenant de deux ApoE ^{- / -} souris nourries ouest alimentation pour 12 semaines. Comme prévu, dans l'ouest de l'alimentation Apoe nourris ^{- / -} aortes, la majorité des leucocytes au sein de l'aorte sont les macrophages (40% CD68 + CD11b +) ou d'autres cellules myéloïdes (CD68 + CD11b ^faible et CD11b + CD68-). En outre, les cellules Th1 comprennent une partie importante de l'aorte s'infiltrant TCRap cellules T (Fig.4). Comme le pourcentage global des leucocytes aortique et sous-ensembles de leucocytes varie en fonction de l'âge de la souris et la sévérité de l'athérosclérose, la stratégie optimale pour gating grandes populations d'intérêt doivent être déterminées empiriquement

Pour démontrer la faisabilité d'isoler l'adventice aortique pour la coloration de la cytométrie de flux, nous présentons représentant CD45 ⁺ coloration des leucocytes pour les suspensions de cellules de l'aorte et l'adventice (figure 5). En bref, trois ans Apoe ^{- / -} aortes de souris ont été digérées et mises en commun tel que décrit ci-dessus (articles 2 et 4). Infiltrer CD45 ⁺ leucocytes ont été détectés dans les deux l'adventice (18% de la suspension cellulaire) et l'aorte restante (11% de la suspension cellulaire).

Figure 1. TER-119 coloration en suspension de cellules aortiques digéré. Aorte a été perfusé par ponction cardiaque avec du PBS contenant de l'héparine 2%. Puis l'aorte a été digéré par l'enzyme de cocktails pendant 1 heure à 37 ° C. Aortique de suspension des cellules et des échantillons de sang (comme un contrôle positif) ont été colorés avec des anti-TER-119-PE Abs et analysées par cytométrie de flux. TER-119-positifs cellules rouges du sang compte pour 18% de toutes les cellules de la suspension de cellules aortiques indiquant que seuls 0,014% de tous les leucocytes isolés aortes sont susceptibles d'être dérivées du sang des leucocytes.

Figure 2. Enzyme-cocktail traitement n'a aucun effet sur ​​le CD45 (en haut) ou CD19 (en bas) l'expression sur les lymphocytes. à partir de suspensions cellulaires non traitées (A, B) et traité avec l'enzyme-cocktail (C, D) LN ont été obtenus, et colorés avec APC-Cy7 conjugué anti-CD45 et APC-conjugué anticorps monoclonaux anti-CD19. (A, C) Les chiffres représentent les pourcentages de leucocytes CD45 + dans la porte R1. (B, D) Les chiffres représentent les pourcentages de CD45 ⁺ / CD19 ⁺ des lymphocytes. Les profils sont gated sur CD45 ⁺ leucocytes.

Figure 3 Stratégie Gating pour l'analyse des leucocytes aortique deux aortes ont été isolés et mis en commun à partir Apoe sujettes athérosclérose ^{-.. / -} Souris et les suspensions de cellules aortiques ont été préparés comme décrit ci-dessus. Les suspensions cellulaires ont été colorées pour CD45 (PerCP), TCRap (ITCF), IFNy (eFluor 450), et Live / Dead Aqua, et analysées en utilisant un Cytek DXP 8 Couleur améliorée BD FACS Calibur. Brièvement, CD45 ⁺ ont été Leucocytes gated (B) et une analyse plus poussée (FC). Les cellules mortes ont été retirés de l'analyse fondée sur la coloration Aqua Live / Dead (D) et des parcelles FSC (E). Leucocytes aortique en direct ont ensuite été examinés pour TCRap et IFN expression (F).

.. Les suspensions cellulaires figure 4 marquage intracellulaire des antigènes intracellulaires et les cytokines ont été préparées à partir d'un ensemble Apoe ^{- / -} aorte et la rate, comme décrit. Aortique (A) et des suspensions de cellules spléniques (B, C) ont été colorées pour CD45, CD11b, CD68 et ou un contrôle isotypique utilisant BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences). Les cellules ont été gated sur CD45 ⁺ leucocytes et de débris a été exclu sur la base des profils de diffusion vers l'avant et de côté. Pour la coloration intracellulaire IFN, les suspensions cellulaires de l'aorte et la rate ont été cultivées pendant cinq heures dans du RPMI 1640 additionné de Golgi arrêt, la PMA, et de l'ionomycine C, comme décrit précédemment. Stimulé ⁹ aortique simple (D) et spléniques (E, F) suspensions cellulaires ont été suite colorés avec CD45 (PerCP), TCRap (ITCF), CD3 (APC-Cy7), Live Aqua Morte, et IFN (eFluor 450; E) ou un isotype (IgG1-eF450, F). Les cellules T (DF) ont été gated de vivre CD45 + CD3 + leucocytes (CD45 + Live / Dead Aqua-) et examinés pour TCRap et IFNy.

.. Figure 5 image représentative de l'aorte isolée murin adventice et paroi vasculaire aortique complot cytométrie de flux représentant contrer démontre la présence de CD45 ⁺ cellules T dans l'adventice et la paroi aortique de l'apoE ans ^{- / -} souris. SSC côté disperser. Pour éliminer l'autofluorescence des débris et les tissus nécrosés, les parcelles ont été fermé pour la FSC> 750. Pour éviter autofluorescence supplémentaires de doublets les portes ont été également mis en place par le FSC <3500, SSC <3500. Les pourcentages indiquent les cellules CD45 ⁺ dans les portes.

Discussion

Ici, nous présentons une méthode cytométrie en flux à base de l'enquête de la composition des cellules immunitaires des aortes murines. L'avantage majeur de cette méthode est la capacité d'analyser l'aorte cellules immunitaires à un niveau simple cellule et de caractériser l'état d'activation des leucocytes aortique. Cette méthode n'est pas limitée aux aortes murines et nous (données non publiées) et d'autres ¹⁰ a utilisé cette approche pour analyser des spécime...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matériau	Nombre de catalogue	Société
Collagénase XI	C7657	Sigma-Aldrich
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
DNase I, de type 2	D4527	Sigma-Aldrich
Collagénase I	C0130	Sigma-Aldrich
Collagénase II	LS004174	Worthington Biochemical Corporation
Élastase	LS002292	Worthington Biochemical Corporation