Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Résumé

Nous décrivons ici un ensemble de montage fluorescent In situ Hybridation (FISH) pour la détermination des propriétés d'expression et la localisation des ARN exprimés au cours de l'embryogenèse chez la drosophile, Drosophila melanogaster.

Résumé

Évaluer le profil d'expression d'un gène, ainsi que les propriétés de localisation subcellulaire de ses ARN transcrit, sont des éléments clés pour la compréhension de sa fonction biologique au cours du développement. ARN hybridation in situ (ISH-ARN) est une méthode puissante utilisée pour visualiser les propriétés de distribution d'ARN, que ce soit au niveau de tous les organismes, cellulaires ou subcellulaires ^1. ARN-ISH est basée sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique marquée (par exemple un ARN antisens, oligonucléotides) complémentaire de la séquence d'un ARNm ou d'une cible non-codante d'ARN d'intérêt ^2. Comme la procédure exige des renseignements séquence primaire seul à générer une séquence des sondes spécifiques, il peut être universellement appliquée à un large éventail d'organismes et les échantillons de tissus ^3. En effet, un certain nombre d'études à grande échelle ISH ont été prises pour documenter l'expression des gènes et de l'ARN dynamique de localisation dans divers organismes modèles, ce qui a conduit à lamise en place de ressources communautaires importantes ^4-11. Bien qu'une variété de marquage des sondes et des stratégies de détection ont été développées au fil des ans, l'utilisation combinée des réactifs de détection à marquage fluorescent et enzymatiques étapes d'amplification du signal offrent des améliorations significatives dans la sensibilité et la résolution de la procédure ^12. Ici, nous décrivons une fluorescence optimisé méthode d'hybridation in situ (FISH) utilisant l'amplification du signal tyramide (TSA) pour visualiser l'expression de l'ARN et la dynamique de localisation des embryons de drosophile mis en scène. La procédure est réalisée en format 96 puits Plaque PCR, ce qui facilite grandement le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons.

Protocole

1. Préparation de la sonde d'ARN

Vue d'ensemble: La section suivante décrit les étapes nécessaires pour faire digoxigénine (DIG)-sondes marquées ARN Convient pour les poissons. La première étape consiste à cloner ou PCR amplification d'une séquence correspondant à la région transcrite d'un gène d'intérêt qui sera utilisé pour générer une sonde spécifique de la séquence. Ceci peut être obtenu par clonage premier segment de gène dans un plasmide dans lequel le site de clonage multiple est flanqué par des éléments promoteurs de bactériophage (T7, T3 ou SP6), qui peut alors servir de matrice pour la PCR en utilisant des amorces flanquantes qui incorporent les séquences promotrices , générant ainsi un produit de PCR linéaire avec des séquences promotrices différentes à chaque extrémité (figure 1A). En variante, afin d'éviter l'étape de clonage, on peut aussi réaliser une amplification par PCR à partir d'ADN génomique ou d'ADNc en utilisant des oligonucléotides qui comprennent T7, T3 ou SP6 dans leurs séquences 5 'extrémités (par exemple T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Les produits linéaires de PCR sont ensuite utilisés comme modèles pour donner un sens Dig-étiquetée ou des sondes d'ARN antisens par le ruissellement transcription in vitro avec la polymerase appropriée (figure 1B). Lors de sondes pour les gènes spécifiques, nous vous recommandons de préparer à la fois sens et antisens sondes d'ARN polymérases distinctes à l'aide, ce qui sera utile pour évaluer la spécificité du signal FISH (c.-à moins que le gène d'intérêt est transcrit dans l'orientation antisens, le sens sonde d'ARN révèle la niveau de bruit de fond). Dans toutes les étapes suivantes, il faut prendre grand soin d'éviter la dégradation potentielle par les ribonucléases contaminantes (ARNases) en commençant par le nettoyage de toutes les zones de banc et de l'équipement avec de l'éthanol à 70% ou commerciales des solutions de décontamination RNAse et en utilisant RNase-Free fournitures (par exemple l'eau, des conseils, des microtubes).

Mamanriaux

• Tubes de 1,5 ml microtubes, (Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900)
• Gel d'extraction de kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada, cat. N ° 28706).
• RNAse eau (Wisent, Cat Inc. N ° 809-115-CL)
• ARN polymérases (T7, T3 ou SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. No. de cat. EP0101, EP0111, EP0131).
• Inhibiteurs de ribonucléase RNase OUT (40 U / pl), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019).
• Digoxigénine (DIG) des mélanges de nucléotides (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910).

Équipement

• Plateau de micro-centrifugeuse
• Électrophorèse sur gel appareil

1. Amplifier par PCR spécifique d'un gène de séquence d'ADN génomique, d'ADNc, d'ADN plasmidique ou de générer un produit PCR linéaire flanqué de bactériophage T7, des séquences de promoteur T3 ou SP6. Suivez les recommandations du fabricant pour les conditions de PCR.
2. Vérifier la qualité et size du produit de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. D'accise et purifier des produits PCR en utilisant une norme de gel extraction kit selon recommandations du fabricant et éluer le produit dans 50 ul de tampon.
3. Précipiter le produit de la PCR en ajoutant 5 ul d'acétate de sodium 3M (pH 5,2) et 150 pi de glace 100% d'éthanol froid, et placer les tubes à -70 ° C pendant la nuit. Centrifuger les tubes à 13.000 xg pendant 10 min à 4 ° C et laver le culot avec de l'éthanol à 70%. Faites tourner encore une fois, éliminer toute trace d'éthanol et sécher à l'air le culot. Remettre en suspension dans 25-50 pi d'eau sans RNase.
4. Transcrire Creusez sonde marquée à l'aide 200-500 ng produit de PCR purifié dans une réaction de 20 ul comme suit: 2 pi de tampon de transcription T7 10X (Invitrogen), 1 pi (20 U / pl) d'inhibiteur de RNase, 2 pl Dig-NTP mélange , et 2 pl ARN polymérase T7 (20 U / pl). Amener le volume final de 20 ul avec de l'eau sans RNase. Incuber la réaction de transcription à 37 ° C pendant 3-4 heures.
5. Réglez transcription mélange à 50 pi avec de l'eau sans RNAse et précipiter le Dig-ARN marqué la sonde comme décrit à l'étape 4. Remettre en suspension le culot d'ARN lavé dans 100 ul d'eau sans RNase. Conserver les échantillons remis en suspension à -70 ° C.
6. Quantifier la sonde à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop. Pour vérifier la qualité de la sonde, exécutez un échantillon 1-2 ul sur un gel coloré à 1-2% d'agarose au bromure d'éthidium.

2. Collecte et fixation des embryons de drosophile

Vue d'ensemble: Cette section décrit les étapes de récolte et de transformation mis en scène embryon de drosophile. Selon le nombre d'embryons nécessaires, les mouches peuvent être maintenus dans des cages de différentes tailles de population. Les étapes suivantes sont effectuées à l'aide des collections de 900 cm ³ cages cylindriques, en utilisant des plaques de 100mm de pommes de collecte de jus. La fixation adéquate exige le retrait de deux couches de protection entourant l'embryon: le chorion extérieur et l'intérieur vitellinmembrane e ^13. Une fois récoltées, les embryons sont d'abord baigné dans une solution javellisée à 50% pour éliminer le chorion, puis ils sont mélangés dans une solution biphasique contenant de l'heptane (perméabilise la membrane vitelline) et du PBS contenant 3,7% de formaldéhyde. La membrane vitelline est ensuite éliminé par craquage et le transfert des embryons dans un mélange biphasique de l'heptane et de méthanol. Fixation embryon proprement dit et le retrait de la membrane vitelline est essentiel pour le succès de la procédure FISH aval.

Matériels

• Jus de pomme plaques de gélose (40% de jus de pomme, 4% de saccharose, de l'agar 3,5%, 0,3% de méthyl paraben) avec de la pâte de levure sou-entreprises (levure de boulanger mélangé avec de l'eau à la consistance du beurre)
• Paraformaldéhyde en poudre (Sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA, États-Unis, cat. N ° 19208)
• Heptane
• Méthanol
• Solution Bleach 3%
• 20 ml en verre flacons à scintillation (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada, cat. No 03-337-15).

Équipement

• Population cages
• Paniers de collecte (faites en utilisant un maillage Nitex et la partie supérieure d'une réduction de 50 ml tube en polypropylène dans lequel un trou a été découpé dans le couvercle).
• Petit pinceau
• Vortex dessus de table

1. Pré-claires bien nourris cages de population avec un jus de pomme / levure fraîche plaque pendant 1 heure à 25 ° C.
2. Ajouter un nouveau jus de pomme / levure plaque à la cage de récolter des embryons à un stade précoce. Incuber la cage pendant 4 heures à 25 ° C (à noter que les temps de collecte peut être ajustée selon les étapes souhaitées).
3. Préparer une solution de formaldéhyde fraîche 37% en combinant 3,7 g de paraformaldéhyde en poudre, 70 pi de KOH 2N et 7,3 ml d'eau milliQ dans un flacon à scintillation en verre sous une hotte chimique. Faire bouillir la solution jusqu'à ce que la poudre soit complètement dissoute paraformaldéhyde, puis laisser refroidir à température ambiante et filtrer dans un flacon à scintillation nouvelle.
4. Préparer une solution de fixation par biphasiquecombinant 2,25 ml de PBS 1X avec 250 ml de formaldéhyde à 37% dans un flacon à scintillation, puis en ajoutant 7,5 ml d'heptane.
5. Récolter la plaque de jus de pomme de la cage et la collecte des embryons en ajoutant un peu d'eau du robinet à température ambiante et délicatement brosser les embryons de la plaque avec le pinceau. Transférer les embryons remises en suspension dans un panier et rincer à l'eau tiède du robinet.
6. Embryons Dechorionate de 90 secondes par baignant les paniers de collecte de l'eau de Javel, puis rincer abondamment à l'eau tiède du robinet (eau de javel jusqu'en odeur a disparu).
7. Démonter le panier de collecte, la collecte des embryons délicatement à l'aide d'un pinceau et de les transférer dans la solution de fixation biphasique. Les embryons vont s'accumuler à l'interface entre le PBS et couches heptane.
8. Flacons à scintillation joint et le fixer à un vortex. Agiter pendant 20 min à réglage le plus bas.
9. Retirez et jetez la plupart des phases de CPE et supérieure inférieurs heptane à l'aide d'une pipette Pasteur. Aspirerle reste de PBS / heptane / embryons mélange dans la pipette. Goutte à goutte, élimine la phase inférieure du PBS de la pipette, en prenant soin de ne pas éliminer les embryons. Déposer les embryons dans un tube de 1,5 ml contenant une solution biphasique de 500 ul heptane (phase supérieure) et 500 ul de méthanol (phase inférieure).
10. Agiter les tubes vigoureusement à la main pendant 30-45 sec pour casser les membranes vitellines. Une fois fissurée, les embryons vont sombrer dans le méthanol.
11. Jeter la phase supérieure heptane et d'embryons non fissurées à l'interphase heptane / méthanol et ajouter 500 ul de méthanol. Agiter pendant 5 sec.
12. Laver 3 fois avec du méthanol et de stocker les embryons à -20 ° C (à ce stade, les embryons peuvent être conservés pendant des semaines / mois).

3. Post-traitement des lavages de fixation, d'hybridation et de post-hybridation

Vue d'ensemble: Cette section détaille les étapes de traitement de perméabilisation embryon avant FISH, pré-hybridation,hybridation avec les sondes d'ARN et de post-hybridation lavages. Pour les étapes initiales de perméabilisation les embryons sont traités comme une piscine dans un seul tube (étapes 1-9 ci-dessous, dans le but de 10-15 ul d'embryons installés / échantillon), mais ils sont répartie dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits PCR avant de procéder à l'étape de pré-hybridation (étape 10 ci-dessous). Cela permet d'assurer un traitement encore de tous les embryons dans les phases initiales de l'expérience. Lorsque la mise en place d'une expérience FISH, il est important d'inclure des contrôles négatifs pour déterminer le niveau du signal de fond dans les expériences individuelles. Pour cela, nous recommandons d'inclure l'échantillon «non-sonde» et, comme il est indiqué à l'article 1, un échantillon hybridé avec le «sens» sonde d'ARN, qui donnent généralement un signal comparable à l'état de la «non-sonde».

Matériaux:

• Méthanol
• Saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Tween-20 (PBT)
• Protéinase-K 1 mg / ml de solution mère (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Catalogue n ° P2308)
• Glycine (20 mg / ml de solution mère)
• Solution d'hybridation: formamide 50%, SSC 5X, 0,1% de Tween-20, 100 g / ml d'ADN de sperme de saumon cisaillé, 100 ug / ml d'héparine.
• 0,2 ml halfskirted plaques à 96 puits PCR, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Non 0900)

Équipement

• Four à hybridation bain, le bloc chauffant de l'eau ou numérique réglable de 56 ° C, 80 ° C ou 100 ° C, ou une machine de PCR.
• Pipettes multicanaux (recommandé pour simplifier les opérations de lavage)
• Nutation mélangeur

1. Rincer les embryons dans le méthanol, puis dans un mélange 1:1 de methanol: PBT, puis deux fois en PBT.
2. Fixer les embryons pendant 20 min dans 1 ml de PBT contenant du formaldéhyde 3,7% (fraîchement préparé comme décrit dans l'étape 11) avec balancement constant sur une nutator.
3. Laver embryons pour 3 fois pendant 2 min en PBT tout bascule.
4. Préparer une solution de 3 pg / ml de protéinase K (PK) dilué dans PBT et ajouter500 pi de solution à échantillons. Incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante sans agitation. Mélanger embryons toutes les 2 min par le jet avec une pipette ou en retournant doucement les tubes.
5. Transfert d'embryons échantillons sur la glace pendant 1 heure.
6. Déplacer des échantillons à la température ambiante et éliminer la solution de PK. Laver 2 fois pendant 2 minutes avec 1 ml de PBT + 2 mg / ml de glycine.
7. Fixer des échantillons 20 min dans 1 ml de formaldéhyde PBT + 3,7% avec bascule. Rincez embryons 5 fois en PBT.
8. Rincez embryons avec 1 ml d'un mélange 1:1 de PBT et de la solution Hyb. Remplacez-le par 0,5-1 ml de solution Hyb 100% (à cette étape, les embryons peuvent être conservés pendant plusieurs jours / semaines à -20 ° C).
9. Embryons aliquotes dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits (~ 10-15 pour but ul d'embryons installés / puits, prenez soin d'utiliser des embouts grande ouverture pour éviter d'endommager les embryons).
10. Faire bouillir 100 l / échantillon de solution Hyb pendant 5 min, puis refroidir sur glace pendant 5 min. Cette solution est utilisée pour l'échantillon de pré-hybridation (pré-Hyb).
11. Ajouter 100 ul / échantillon de pré-Hyb solution et incuber pendant au moins 2 heures à 56 ° C.
12. Pour chaque échantillon, diluer ~ 100 ng de sonde dans 100 ul de solution Hyb. Chauffer à 80 ° C pendant 3 min, puis refroidir sur glace pendant 5 min (sondes chauffées peuvent être conservés sur de la glace pendant plusieurs heures).
13. Enlever la solution de pré-Hyb à partir des embryons et la remplacer par la solution de sonde d'ARN.
14. S'hybrider à 56 ° C pendant 12-16 heures.
15. Préchauffer les solutions de lavage suivants à 56 ° C: (A) 200 l / échantillon de solution Hyb; (B) 100 l / échantillon d'un mélange 3:1 de Hyb: PBT; (C) 100 l / échantillon d'un 01h01 mélange de Hyb: PBT; (D) 100 l / échantillon d'un mélange 1:3 de Hyb: PBT; (E) 400 l / échantillon de PBT.
16. Rincer les échantillons avec 100 ul de solution de lavage A, puis effectuer l'étape de lavage avec 100 pl / AD échantillon de solutions à 56 ° C pendant 15 min à chaque fois. Puis, lavez échantillons 4 fois pendant 5 min avec 100 ul / échantillon de la solution E à 56 ° C.
17. Échantillons refroidir à température ambiante.

4. Détection de la sonde

Vue d'ensemble: Cette section décrit les anticorps et les réactifs de détection utilisées pour détecter et visualiser la répartition de l'hybridation sonde d'ARN signal suivant. Ces étapes sont décrites schématiquement dans la figure 2. Ici, nous présentons uniquement les réactifs de détection standard que nous utilisons pour l'amplification du signal robuste, mais il existe une variété de réactifs disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisés comme des alternatives, en particulier lors de l'exécution à double POISSONS expériences de co-détection des ARN différents simultanément pour les protéines-ARN double coloration. Des exemples de résultats obtenus avec ce protocole sont affichées dans la mosaïque motif de l'expression d'ARNm / localisation dans la figure 3.

Matériels

• HRP-conjugué anticorps monoclonal anti-DIG (Jackson Laboratories Inc ImmunoResearch Cat. No. 200-032-156)
• Conjugué à la biotine monoclonal de souris anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Cat. N ° 200-062-156)
• Streptavidine-HRP (Molecular Probes, Eugene, USA, Cat. No.S991)
• Cy3-tyramide conjugués (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, Etats-Unis, No. de cat. SAT704A)
• DABCO solution de montage: Dans un tube de 50 ml, diluer 1,25 g de DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane; Sigma D-2522) dans 15 ml de PBS 1X, puis ajouter 35 ml de glycérol et mélanger jusqu'à ce que tout homogène. Par mélange préalable avec du PBS, la poudre est dissoute DABCO très rapidement. Magasin solution de montage à -20 ° C.
• Lames de verre, des lamelles

Équipement

• Nutation mélangeur
• Pipette multicanaux
• Microscope à fluorescence

1. Préparer la solution PBTB, contenant PBT + 1% de lait écrémé sec (généralement 50-100 ml est suffisant pour tout le réactif de détection et d'incubation étapes de lavage).
2. Bloquer les échantillons pendant 10 min à température ambiante dans 100 ul PBTB / échantillon, tout en se balançant sur nutator.
3. Supprimer solution de blocage à partir d'embryons et des échantillons incuber pendant 1,5-2 heures à température ambiante avec 100 ul / échantillon de la solution de biotine anticorps monoclonal anti-DIG (dilué 1/400 en stock dans PBTB) avec bascule.
4. Laver les échantillons 6 fois pendant 5 min chacun avec 100 ul PBTB / échantillon avec bascule.
5. Incuber 1,5 h à température ambiante avec 75 ml / échantillon de solution de streptavidine-HRP (dilution 1/100 en stock au PBTB, 10 pg / ml de concentration finale) avec bascule.
6. Laver les échantillons 6 fois 5 min à chaque fois. 100 PBTB ul / échantillon avec basculement (pour la contre-coloration d'ADN, diluer la concentration 1X DAPI à travailler dans PBTB et utiliser cette solution dans la première étape de lavage)
7. Rincez embryons avec PBT, puis laver 2 fois pendant 5 min avec du PBS.
8. Incuber les échantillons pendant 2 heures à la température ambiante sur la nutator avec 50 pl / échantillon de Cy3-tyramide solution (dilué 1/50 dans du tampon d'amplification tyramide). A partir de cette étape, assurez-vous de garder les échantillons dans un récipient blindé léger.
9. Laver les échantillons 6 fois pendant 5 min chacun avec 100 ul de PBS / échantillon sur nutator.
10. Retirer du PBS et ajouter 100-125 l / échantillon de solution de montage contenant du glycérol à 70% et 2,5% (DABCO). Conserver les échantillons à 4 ° C. Ces échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs années.
11. En utilisant une pointe de gros calibre, remettre en suspension les embryons en pipetant doucement les échantillons et transférer 25 ul d'embryons sur une lame de verre, puis placez une lamelle sur les embryons et joint d'étanchéité sur la lame avec du vernis à ongles.
12. Analyser les échantillons d'embryons en utilisant un microscope à fluorescence.

Résultats

Quand elle est réalisée avec succès, cette procédure offre un niveau remarquablement améliorée de détail dans l'analyse spatio-temporelle de l'expression génique et la dynamique de localisation d'ARNm au cours de l'embryogenèse précoce chez la drosophile. En effet, comme illustré sur la figure 3A pour l'avorton gène pair-rule classique (piste), on peut utiliser ce protocole pour observer des événements expression des gènes via la détection d...

Discussion

Pour les étapes de synthèse de la sonde, nous générons habituellement en run-off des sondes d'ARN antisens par transcription in vitro à partir des ADNc pleine longueur drosophile amplifiés à partir des plasmides présents dans la collection de Drosophila Gene (DGC), une ressource en détail à l'adresse suivante: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html ^14,15. Cette approche a été large...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
T7, T3 ou SP6 ARN polymérase	Fermentas Life Sciences	EP0101, EP0111, EP0131	Les kits contiennent un tampon de réaction.
DIG RNA Labeling Mix	Roche Applied Science	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
L'acétate de sodium 3M
Froide éthanol à 100%.
Froide éthanol à 70%.
Solution de Javel diluée à 1:1 avec de l'eau.
Heptane
Méthanol
protéinase K	Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada	Catalog No. P2308
Solution de formaldéhyde à 40%, fraîchement préparé
Solution PBS-Tween (PBT)		1xPBS, 0,1% de Tween-20
Solution de glycine		2 mg / ml de glycine en PBT
HRP-conjugué anticorps monoclonal anti-DIG	Jackson Laboratories Inc ImmunoResearch	200-032 - 156	(1/400 de dilution de 1 mg / ml de solution mère dans PBTB
Conjugué à HRP moutons monoclonal anti-DIG	Roche Applied Science, Laval, QC	1 207 733	1/500 de dilution de la solution mère dans PBTB
Biotine-conjugué anticorps monoclonal de souris anti-DIG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA	200-062-156	(1/400 de dilution de 1 mg / ml de solution mère dans PBTB
Streptavidine-HRP	Molecular Probes, Eugene OR, USA	S991	(1/100 de dilution d'un 1 ug / ml de bouillon