Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Özet

Burada bir bütün montaj floresan tarif In situ hibridizasyon (FISH) protokolü, Drosophila melanogaster.

Özet

Bir gen, hem de kendi RNA transkripsiyonu hücre içi lokalizasyonu özellikleri, salgılama modelini değerlendirilmesi gelişme sırasında biyolojik işlevlerini anlamada için önemli özellikleri vardır. In situ hibridizasyon RNA (RNA-ISH) RNA dağılımı özelliklerine görselleştirmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir, organizmalar, hücresel ya da hücre içi düzeylerinin ¹ olması. RNA-ISH bir mRNA veya ilgi ^içinde bir ² kodlayıcı olmayan RNA hedef sekansına tamamlayıcı bir etiketli nükleik asit sondası (örneğin, antisens RNA, oligonükleotidler) ve hibridizasyon dayanmaktadır. Işlem dizi spesifik prob oluşturmak için tek başına birincil sıralama bilgisinin gerektirdiği gibi, evrensel organizmalar ve doku örnekler, ^3, geniş bir alanda uygulanabilir. Gerçekten de, büyük ölçekli ISH çalışmalar bir dizi gen ekspresyon belgelemek ve çeşitli model organizmaların yerelleştirme dinamikleri RNA uygulanan edilmiştir hangi yol açtıönemli topluluk kaynaklarını ^4-11 kurulması. Prob etiketleme ve algılama çeşitli stratejiler yılda geliştirilmiş olmasına rağmen, floresan-etiketli algılama reaktifler ve enzimatik sinyal amplifikasyon adımlar kombine kullanımı prosedürü ¹² hassasiyet ve çözünürlük önemli iyileştirmeler sunuyor. Burada sahnelenen Drosophila embriyolar RNA ekspresyonu ve lokalizasyonu dinamikleri görselleştirmek için tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) kullanılarak in situ hibridizasyon metodu (FISH), optimize edilmiş floresan tarif. Işlem çok sayıda numune eş zamanlı olarak işlem kolaylaştırır 96-kuyulu plaka PCR formatında gerçekleştirilir.

Protokol

1. RNA Prob Hazırlanması

Genel Bakış: Aşağıdaki bölümde FISH için uygundur digoxigenin (Dig) etiketli RNA problar yapmak için gereken adımları açıklar. İlk adım, bir klonlama ya da dizi spesifik prob oluşturmak için kullanılacak bir ilgi geninin transkripsiyonu bölgeye karşılık gelen bir dizi yükselterek PCR ile yapılır. Bu, çoklu klonlama sitesi sonra oluşturulmuş arttırıcı dizileri dahil komşu primerler kullanılarak PCR için bir şablon olarak hizmet edebilir bakteriyofaj promotör elemanları (T7, T3 ya da SP6) ile takviye edildiği bir plazmid içine ilk klonlama gen segmenti ile elde edilebilir böylece her bir uç (Şekil 1A) farklı promotor sekansları olan bir doğrusal PCR ürünü üreten. : Alternatif olarak, klonlama aşaması önlemek için, bir de genomik DNA ya da cDNA, T3, T7, ya da 5 'uçlarında SP6 dizileri (örneğin, T7 içeren oligonükleotidler kullanılarak PCR amplifikasyon gerçekleştirebilir5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Doğrusal PCR ürünleri daha sonra çalıştırmak mahsus uygun polimerazı (Şekil 1B) ile in vitro olarak transkripsiyonu ile DIG-labeled duyu veya antisense RNA probları sağlamak için şablon olarak kullanılır. Belirli genler için problar yaparken, biz FISH sinyal spesifitesi (yani faiz gen antisens yönde transkripsiyonu sürece değerlendirmek için yararlı olacak farklı polimerazlar kullanılarak duygusu ve antisens RNA problar hem hazırlanması tavsiye, sense RNA probu ortaya çıkaracaktır arka sinyal seviyesi). Aşağıdaki adımların tümünü, bir (örneğin su, ilk% 70 etanol veya ticari RNAse dekontaminasyon çözümleri ile tüm tezgah alanları ve ekipmanın temizlik ve RNAse-ücretsiz kaynakları kullanarak kirletici ribonükleazlar (RNaz) tarafından potansiyel düşüşü önlemek için büyük özen ipuçları, mikrosantrifüj tüpleri).

Anneterials

• 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri, (Abgene, Rochester, NY, ABD Cat. No 0900)
• Jel-ekstraksiyon kitleri (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada;. Cat No 28706).
• RNAse ücretsiz su (Wisent, Inc Kat. No 809-115-CL)
• RNA polimeraz (T3, T7, ya da SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131).
• RNAse-OUT Ribonükleaz inhibitörü (40 U / ml '), (Invitrogen, Burlington. Canada.Cat. No 10777-019 ON).
• Digoxigenin (DIG) nükleotid karışımları (DIG-11-UTP, Roche Uygulamalı Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910).

Ekipman

• Masa üstü mikro-santrifüj
• Jel elektroforez cihazları

1. PCR genomik DNA, cDNA, veya bakteriyofaj T7 ve T3 ya da SP6 promoter dizileri ile çevrili bir doğrusal PCR ürünü üretmek için plazmid DNA ile gen spesifik sekans yükseltmek. PCR koşulları için üretici tavsiyelerine uyun.
2. Kalite ve si doğrulamaagaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü ze. Tavsiyeler üretir ve 50 ul tampon içinde ürün elüt edilmesi için uygun bir standart Jel çıkarma kiti kullanılarak Tüketim ve temizleyen bir PCR ürünü.
3. 3M sodyum asetat (pH 5.2) ve buz gibi soğuk% 100 etanol 150 ul 5 ul ilave edilerek PCR ürünü çökeltmek ve -70 ° C'da gece boyunca tüpleri. 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüje tüpler ve% 70 etanol ile pelet yıkayın. Yeniden Spin, etanol ve hava pelet kuru tüm izlerini kaldırmak. RNAse-serbest su 25-50 ul süspanse edin.
4. 10X T7 transkripsiyon tamponu 2 ul (Invitrogen), RNAse inhibitörü, 2 ul Dig-NTP karışımı 1 ul (20 U / ml ') aşağıdaki gibi bir 20 mikrolitre reaksiyon içinde 200-500 ng saflaştırılmış PCR ürünü kullanılarak DIG-etiketli prob uyarlamak ve 2 ul T7 RNA polimeraz (20 U / ml 'den). RNAse-serbest su ile 20 ul son hacim getirin. 3-4 saat boyunca 37 ° C 'de transkripsiyon reaksiyon inkübe edin.
5. Transc ayarlayınRNAse-serbest su ile 50 ul ription karışımı ve benzeri gibi Aşama 4'te tarif DIG-labeled RNA probu hızlandırabilir. RNAse-serbest su ve 100 ul içinde yıkanmış RNA pelet yeniden süspanse edin. -70 ° C'de saklayın numuneleri yeniden süspanse
6. Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak prob sayısal. Prob kalitesini doğrulamak için, etidyum bromür ile% 1-2 agaroz jel lekeli bir 1-2 ul örnek çalıştırın.

2. Drosophila embriyolar toplanması ve Fiksasyon

Genel Bakış: Bu bölümde sahnelenen Drosophila embriyo toplama ve işleme için gereken adımları açıklar. Ihtiyaç duyulan embriyo sayısına bağlı olarak, farklı büyüklükte sinekler nüfus kafesler içinde muhafaza edilebilir. Koleksiyonları 100mm elma suyu toplama plakaları kullanılarak 900 cm ³ silindirik kafesler kullanılarak yapılır için aşağıdaki adımlar vardır. Uygun fiksasyon embriyo çevreleyen iki koruyucu katmanlarının çıkarılması gerekir: Dış koryon ve iç Vitelline zar ^13. Bir kez hasat edilir, embriyolar birinci koryon çıkarmak için% 50 ağartıcı çözelti ile yıkanmış, daha sonra da heptan (vitellin zar permeabilizes) ve PBS% 3.7 formaldehit ihtiva eden ihtiva eden bir iki fazlı çözelti içinde karıştırılır. Vitellin zar sonra kırık ve heptan ile metanol ve bifazik bir karışım içine embriyo transfer ile ortadan kaldırılmaktadır. Uygun embriyo fiksasyon ve vitellin membran çıkarılması mansap FISH prosedürünün başarısı için kritik öneme sahiptir.

Malzemeler

• Apple suyu on sent büyüklüğünde maya hamurlu agar plaklarına (% 40 elma suyu,% 4 sakkaroz,% 3.5 agar,% 0.3 metil paraben) (ekmek mayası tereyağı tutarlılık su ile karıştırılarak)
• Toz paraformaldehid (Elektron Mikroskobu Bilimler, Hatfield, PA, USA;. Cat No 19208)
• Heptan
• Metanol
• 3% Bleach çözümü
• 20 ml cam sintilasyon şişeleri (Kanada, Thermo Fisher Scientific, Ottawa;. Cat No 03-337-15).

Ekipman

• Nüfus kafesleri
• Toplama sepetler (Nitex bir ağ ve bir delik kapak olarak kesilmiş olan bir kesik 50 ml polipropilen tüpün üst kısmını kullanarak yapılır).
• Küçük boya fırçası
• Masa üstü vorteks

1. 25 1 saat için taze elma suyu / maya plaka ile Pre-net, iyi beslenen nüfusun kafesleri ° C.
2. Erken evre embriyo hasat kafese yeni bir elma suyu / maya plaka ekleyin. 25 4 saat boyunca kafes inkübe ° C (toplama saatleri istenen aşamaları bağlı olarak ayarlanabilir unutmayın).
3. 3.7 g paraformaldehid tozu, 2N KOH 70 ul ve kimyasal başlık altında bir bardak sintilasyon flakon milliQ su 7.3 ml birleştirerek yeni bir% 37 formaldehit solüsyonu hazırlayın. Paraformaldehid tozu tamamen eriyene kadar yeni sintilasyon şişenin içine oda sıcaklığında ve filtre sonra serin, kaynatıp.
4. Bir bifazik fiksasyon çözeltisi hazırlayındaha sonra 7.5 ml heptan ekleyerek, bir sintilasyon şişesi içinde% 37 formaldehit 250 ml ile 1X PBS içinde 2.25 ml birleştirerek.
5. Kafesinden elma suyu plaka Harvest ve oda sıcaklığındaki musluk suyu biraz ekleyerek ve ince fırça ile plaka embriyolar fırçalayarak embriyolar toplamak. Bir sepet içine yeniden süspanse embriyo transferi ve ılık musluk suyu ile durulayın.
6. Çamaşır suyu çözeltisi içinde toplama sepetleri banyo tarafından 90 sn Dechorionate embriyolar, daha sonra ılık musluk suyu (çamaşır suyu kokusu gidene kadar) ile iyice yıkayınız.
7. Toplama sepeti sökün, hafifçe bir fırça kullanılarak embriyolar toplamak ve bifazik tesbit çözeltisi içine aktarabilirsiniz. Embriyolar PBS ve heptan katmanları arasındaki arayüzü de birikir.
8. Mühür sintilasyon şişeleri ve bir vorteks mikser sabitleyin. Düşük ayarda 20 dakika boyunca çalkalanır.
9. Çıkarın ve Pasteur pipeti kullanarak alt PBS ve üst heptan aşamalarının çoğu atın. Soluklupipet içine geri kalan PBS / heptan / embriyolar karışımı. Damla damla moda, embriyolar ortadan kaldırmak için özen, pipetle alt PBS faz atın. Bir 500 ul heptan iki fazlı çözelti (üst faz) ve 500 ul metanol (alt faz) ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içine embriyolar yatır.
10. Vitellin membranlar çatlamak 30-45 sn için elle kuvvetlice tüpler sallayın. Bir kere kırık, embriyoların metanol içine batar.
11. Heptan / metanol ara yüzeyinde üst faz heptan ve çatlamamış embriyolar Sil ve metanol 500 ul ilave edin. 5 saniye sallayın.
12. Metanol ile 3 kere yıkayın ve -20 ° C (bu noktada embriyolar hafta / ay süreyle saklanabilir) de embriyolar saklayın.

3. Post-fiksasyon İşleme, Hibritleşme ve Post-hibridizasyon Yıkama

Genel Bakış: BALIK Bu bölüm detayları embriyo permeabilization için işlem adımları önceden, öncesi melezleme,RNA problar ve post-hibridizasyon yıkar ile hibridizasyon. İlk permeabilization adımlar için embriyolar tek bir tüp (aşağıdaki adımları 1-9, yerleşmiş embriyo / numune 10-15 ul amaçlayan) bir havuz olarak işlenir, ancak bir 96-PCR plate bireysel kuyulara aliquoted edilir Ön hibridizasyon adım (Adım 10) ile devam etmeden önce. Bu deney ilk aşamalarında bile her embriyo tedavi edilmesine yardım eder. Bir BALIK deney kurarken, bireysel deneylerde arka sinyal seviyesini belirlemek için negatif kontroller dahil etmek önemlidir. Bunun için bölüm 1, tipik bir 'no-prob' koşulu ile karşılaştırılabilir bir sinyal verecektir 'anlamda' RNA probu ile melez bir örnek belirtildiği gibi, 'no-prob' numune dahil tavsiye ve.

Malzemeler:

• Metanol
• Fosfat% 0.1 Tween-20 (PBT) ile tamponlu salin
• Proteinaz-K, 1 mg / ml stok çözeltisi (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog No P2308)
• Glisin (20 mg / ml stok çözeltisi)
• Hibritleşme çözeltisi:% 50 formamid, 5X SSC,% 0.1 Tween-20, yamultulmuş somon sperm DNA, 100 g / ml, 100 ug / ml heparin.
• 0.2 ml 96-PCR plakaları, Abgene, Rochester, NY, ABD halfskirted Cat. 0900 yok)

Ekipman

• 56 ile ayarlanabilir Hibridizasyon fırını, dijital ısıtma bloğu ya da su banyosu ° C, 80 ° C veya 100 ° C ya da bir PCR makinesi.
• Çok kanallı pipet (yıkama adımları basitleştirmek için önerilir)
• Karıştırıcı sallanan yanda

1. PBT iki kez daha sonra PBT, ve: metanol 1:1 lik bir karışım, daha sonra metanol içinde embriyolar durulayın.
2. PBT bir nutator sürekli sallama ile% 3.7 formalin (adım 11 'de tarif edildiği gibi, taze hazırlanmış) ihtiva eden 1 ml içinde 20 dakika için embriyolar düzeltildi.
3. PBT 2 dakika sallanan ise 3 kez embriyo yıkayın.
4. 3 mg / PBT seyreltilir proteinaz K (PK) ml bir çözelti hazırlayın ve eklemekÖrnekler çözüm 500 ul. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 10 dakika için numune inkübe edin. Bir pipet ile jeti veya yavaşça tersine tüpler tarafından embriyoların her 2 dk karıştırın.
5. 1 saat boyunca buz üzerinde embriyo örnekleri aktarın.
6. Oda sıcaklığına örnekleri Taşı ve PK çözüm çıkarın. PBT + 2 mg / ml glisin 1 ml ile 2 dakika süreyle 2 kez yıkayın.
7. Sallanan ile PBT +% 3,7 formaldehit 1 ml numune 20 dk Fix. Embriyolar PBT 5 kez durulayın.
8. PBT ve Krm çözeltisi bir 1:1 karışımı 1 ml embriyolar durulayın. 100% Krm solüsyonu (bu aşamada embriyo -20 ° C'de birkaç gün / hafta saklanabilir) ve 0.5-1 ml ile değiştirin.
9. 96-plaka (/ iyi, embriyoların zarar görmesini önlemek için geniş diyafram ipuçlarını kullanmaya özen yerleşen embriyoların ~ 10-15 ul için amaç) bireysel kuyulara tablet embriyolar.
10. 5 dakika buz üzerinde serin sonra 5 dakika için ve Krm çözelti 100 ul / numune kaynatılır. Bu çözelti (Ön Krm) örnek ön melezleme için kullanılmıştır.
11. Ön-Krm çözelti 100 ul / numune ilave edin ve 56 en az 2 saat süreyle inkübe ° C
12. Her numune için, Krm çözeltisinden 100 ul prob ~ 100 ng sulandırmak. 80 Isı 5 dakika (birkaç saat ısıtılmış problar için buz üzerinde muhafaza edilebilir) boyunca buz üzerinde daha sonra serin 3 dk için ° C.
13. Embriyolardan Öncesi Krm çözüm çıkarın ve RNA probu çözümü ile değiştirin.
14. 12-16 saat süre ile 56 ° C 'de melezleşir.
15. 56 de ön ısıtma aşağıdaki yıkama çözümler ° C: (A) 200 Krm çözeltisi ul / numune, (B) ve Krm 3:1 karışımından 100 ul / numune: PBT, bir (C) 100 ul / numune Krm 1:1 karışımı: PBT, (D) Krm 1:3 oranındaki karışımı 100 ul / numune: PBT, (E) PBT yaklaşık 400 ul / numune.
16. Yıkama solüsyonu A 100 ul örnekleri durulayın, daha sonra 15 dakika her biri için 56 de çözümler MS 100 ul / numune ile yıkama adımı ° C gerçekleştirin. Daha sonra, 56 ° C'de E çözeltisi 100 ul / numune ile 5 dakika için numune 4 kez yıkayın
17. Oda sıcaklığında Cool örnekleri.

4. Prob Algılama

Genel Bakış: Bu bölümde RNA prob sinyali aşağıdaki hibridizasyon dağılımını tespit etmek ve görselleştirmek için kullanılan antikorlar ve algılama reaktifler açıklar. Bu adımlar, Şekil 2, şematik olarak açıklanmaktadır. İşte biz güçlü sinyal amplifikasyon için kullandığınız standart saptama reaktifleri yalnızca mevcut, ancak protein-RNA çift için aynı anda farklı RNA'lar co-algılamak için çift BALIK deneyler özellikle çeşitli alternatifler olarak kullanılabilirler ticari reaktifler, orada var boyama. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar örnekleri Şekil 3 mRNA / lokalizasyon desen mozaik görüntülenir.

Malzemeler

• HRP-konjüge fare monoklonal anti-DIG (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc Cat. No 200-032-156)
• Biotin-konjüge fare monoklonal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Kedi. No 200-062-156)
• Streptavidin-HRP konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, ABD, Kedi. No.S991)
• Cy3-tyramide konjugatları (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A)
• DABCO çözüm montaj: bir 50 ml tüp içinde, DABCO 1.25 gram seyreltik (1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan; Sigma D-2522) tam olarak kadar 1X PBS içinde 15 ml, sonra 35 ml gliserol ve karıştırılır homojen. PBS ile önceden karıştırmadan olarak, DABCO toz çok hızlı bir şekilde çözülür. -20 ° C'de saklayın montaj çözümü
• Cam slayt, lamelleri

Ekipman

• Karıştırıcı sallanan yanda
• Kanallı pipet
• Flüoresans mikroskobu

1. PBT PBTB ihtiva eden çözelti, +% 1 yağsız kuru süt (genellikle 50-100 ml tüm tespit reaktif inkübasyon ve yıkama adımları için yeterli olan) hazırlayın.
2. Nutator sallanan ise PBTB 100 ul / numune içinde oda sıcaklığında 10 dakika için örnekler engelleme.
3. sallanan ile 100 ul / numune monoklonal biyotin anti-DIG antikor çözüm (PBTB içine stoktan 1/400 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1.5-2 saat boyunca embriyo ve inkübe örnekleri engelleme çözüm çıkarın.
4. Her sallanan ile 100 ul PBTB / numune ile 5 dakika boyunca numuneler 6 kez yıkayın.
5. Sallanan ile streptavidin-HRP çözeltisi (PBTB, 10 ug / ml nihai konsantrasyonda stok ile 1/100 sulandırılmış) 75 ml / numune ile, oda sıcaklığında 1.5 saat inkübe edin.
6. Örnekleri yıkayın 5 dakika boyunca 6 kere her sallanan (DNA counterstaining için, PBTB içinde 1X çalışma konsantrasyonu DAPI sulandırmak ve ilk yıkama adımda bu çözümü kullanabilirsiniz) ile 100 ul PBTB / örnek.
7. PBT embriyolar durulayın, daha sonra PBS ile 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
8. Cy3-tyramide çözeltisi (Tyramide amplifikasyon tampon içinde 1/50 seyreltilmiş), 50 ul / numune ile nutator oda sıcaklığında 2 saat için örnekler inkübe edin. Bu adımı itibaren, hafif korumalı priz örnekleri tutmak için emin olun.
9. 5 dk Her nutator 100 ul PBS / numune ile numuneler 6 kez yıkayın.
10. PBS çıkarın ve% 70 gliserol ve% 2.5 (DABCO) içeren montaj çözümü 100-125 ul / örnek ekleyin. Mağaza numuneler 4 ° C'de Bu örnekler, birkaç yıl boyunca saklanabilir.
11. Geniş çaplı ucu ile hafifçe örnekleri pipetleme embriyoların tekrar süspansiyon ve bir cam slayt üzerine embriyoların 25 ul aktarın, sonra tırnak cilası ile slayt üzerine embriyolar ve mühür üzerine lamel yerleştirin.
12. Bir floresan mikroskop kullanılarak embriyo örnekleri analiz edin.

Sonuçlar

Başarıyla yapıldığında, bu işlem erken Drosophila embriyogenez sırasında gen ekspresyonu ve mRNA lokalizasyonu dinamiklerinin uzay-zamansal analiz içerisinde detaylı bir çarpıcı gelişmiş seviyede sunuyor. Klasik çift-kural gen bücür (run) için Şekil 3A'da gösterildiği gibi, aslında tek çekirdekler ifade gruplarında henüz olgunlaşmamış transkript odaklarının tespiti yoluyla gen ekspresyonu olayları gözlemlemek için bu protokolü kullanabilirsiniz. ...

Tartışmalar

Prob sentez adımlar için, biz genellikle Drosophila Gen Koleksiyonu (DGC), aşağıdaki web sitesinden ayrıntılı bir kaynak bulunan plazmidler amplifiye tam uzunlukta Drosophila DNA'larının in vitro transkripsiyon tarafından işletilen-off antisens RNA problar oluşturmak: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html ^14,15. Bu yaklaşım sinek embriyolar ^9,16 haritalama gen ekspresyonu ve mRNA...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
T7, T3 veya SP6 RNA Polimeraz	Fermentas Yaşam Bilimleri	EP0101, EP0111, EP0131	Kitler reaksiyon tamponu içerir.
DIG RNA Etiketleme Mix	Roche Uygulamalı Bilimler	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
3M sodyum asetat
Soğuk% 100 etanol.
Soğuk% 70 etanol.
Klor ağartıcı çözelti su ile 1:1 seyreltilmiştir.
Heptan
Metanol
proteinaz K	Sigma Aldrich Oakville, ON, Kanada	Katalog No P2308
% 40 formaldehit solüsyonu, taze hazırlanmış
PBS-Tween solüsyonu (PBT)		1xPBS,% 0.1 Tween-20
Glisin çözümü		PBT içinde 2 mg / ml glisin
Monoklonal HRP-konjüge fare anti-DIG	Jackson Immunoresearch Laboratories Inc	200-032 - 156	(PBTB içinde bir 1 mg / ml stok çözeltisi 1/400 seyreltme
HRP-eşlenikli koyun anti-DIG monoklonal	Roche Uygulamalı Science, Laval, QC	1 207 733	PBTB stok solüsyonu 1/500 dilüsyon
Biotin-konjüge fare monoklonal anti-DIG	Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA	200-062-156	(PBTB içinde bir 1 mg / ml stok çözeltisi 1/400 seyreltme
Streptavidin-HRP konjugat	Moleküler Probları, Eugene OR, ABD	S991	(Bir 1 ug / ml stok, 1/100 seyreltme