Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Резюме

Здесь мы опишем весь монтаж флуоресцентных На месте Гибридизации (FISH) протокол для определения экспрессии и локализации свойств РНК, высказанные в ходе эмбриогенеза дрозофилы, Дрозофилы.

Аннотация

Оценка экспрессии генов, а также субклеточном свойства локализации его транскрипции РНК, являются ключевыми для понимания особенностей его биологической функции в процессе разработки. РНК в гибридизация (РНК-ISH) представляет собой мощный метод, используемый для визуализации свойств РНК распределения, будь то на организменном, клеточном и субклеточном уровнях ^1. РНК-ISH основан на гибридизации меченого зонда нуклеиновой кислоты (например, антисмысловую РНК, олигонуклеотиды), комплементарный последовательности мРНК и некодирующих РНК объектом интереса ^2. Так как процедура требует первичной информации о последовательности только для генерации последовательности конкретных датчиков, он может применяться универсально для широкого круга организмов и образцов тканей ^3. Действительно, ряд крупномасштабных ISH исследования были реализованы к документу экспрессии генов и РНК локализации динамики в различных модельных организмов, которые привели ксоздание важных ресурсов сообщества ^4-11. В то время как различные маркировки и обнаружения зонда стратегии были разработаны на протяжении многих лет, в сочетании использование флуоресцентно-меченных обнаружения реагентов и ферментативных реакций усиления сигнала предлагают значительные улучшения чувствительности и разрешающей процедуры ^12. Здесь мы описываем оптимизированы флуоресцентные на месте методом гибридизации (FISH) с использованием tyramide усиления сигнала (TSA) для визуализации экспрессии РНК и локализации динамику в постановке эмбрионов дрозофилы. Процедура проводится в 96-луночный ПЦР планшет формата, что значительно облегчает одновременную обработку большого количества образцов.

протокол

1. РНК-зонд подготовка

Обзор: В следующем разделе описаны шаги, необходимые, чтобы сделать дигоксигенин (Dig)-меченных РНК-зондов подходящих для рыбы. На первом этапе клонирования или ПЦР-амплификации последовательности, соответствующей транскрипции область интересующего гена, который будет использоваться для генерации последовательности конкретных зонда. Это может быть достигнуто путем клонирования первый сегмент гена в плазмиду, в которых сайт множественного клонирования в окружении бактериофага промоутер элементов (T7, Т3 или SP6), которая может служить в качестве шаблона для ПЦР с использованием фланкирующих праймеров, которые включают последовательности промотора , создавая таким образом линейную продуктов ПЦР с различных последовательностей промотора на каждой конечности (рис. 1А). Кроме того, чтобы избежать клонирования шаг, можно также выполнять ПЦР-амплификации с геномной ДНК или кДНК с использованием олигонуклеотидов, которые включают T7, Т3 или SP6 последовательности в их 5 'конечностей (например, T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Линейные продуктов ПЦР затем используются в качестве шаблонов, чтобы сделать Dig-меченных смысловой или антисмысловой РНК-зонды на стоке в пробирке транскрипции с соответствующей полимеразы (рис. 1b). При изготовлении датчиков для конкретных генов, мы рекомендуем подготовки как смысловой и антисмысловой РНК-зонды использованием различных полимераз, которые будут полезны для оценки FISH сигнал специфичность (т.е. если интерес ген транскрибируется в антисмысловой ориентации, чувство РНК-зонд покажет уровень фонового сигнала). Во всех следующих шагов, следует проявлять большую осторожность, чтобы избежать возможных деградации загрязняющих рибонуклеазы (РНКазы), сначала убрать все скамейки площадей и оборудования с 70% этанола или коммерческие дезактивации РНКазы решения и с помощью РНКазы без принадлежностей (например, вода, Советы, микроцентрифужных трубы).

Массачусетстериалов

• 1,5 мл микроцентрифужных трубы, (Abgene, Rochester, NY, USA кат. Нет 0900)
• Гель-экстракция наборы (QIAGEN, Mississauga, ON, Канада;. Кат № 28706).
• РНКазы свободной воды (зубра, Inc кат. № 809-115-CL)
• РНК-полимеразы (T7, T3, или SP6). (20 ед / мкл, Fermentas Biosciences. Кат. EP0101, EP0111, EP0131).
• РНКазы-OUT рибонуклеазы ингибиторы (40 ед / мкл), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Номер 10777-019).
• Дигоксигенин (DIG) нуклеотидные смеси (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Лаваль, Квебек, Канада. Кат. No.11209256910).

Оборудование

• Настольная микро-центрифуге
• Гель-электрофореза аппарата

1. ПЦР усилить ген-специфической последовательности из геномной ДНК, кДНК или плазмидной ДНК для создания линейного продукта ПЦР в окружении бактериофага Т7, Т3 или SP6 последовательностей промотора. Следуйте рекомендациям производителя по условиям ПЦР.
2. Проверка качества и сиZE продукта ПЦР методом электрофореза в агарозном геле. Акцизы и очищают ПЦР-продукта с использованием стандартной гель-экстракции комплект в соответствии с рекомендациями производителей и элюирования продукта в 50 мкл буфера.
3. Осадок продукта ПЦР добавлением 5 мкл 3М ацетата натрия (рН 5,2) и 150 мкл ледяного 100% этанола, и поместить трубы при -70 ° C в течение ночи. Центрифужные пробирки при 13000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и мыть гранул с 70% этанола. Побочные снова, удалите все следы этанола и воздушно-сухой осадок. Ресуспендируют в 25-50 мкл РНКазы без воды.
4. Расшифруйте Dig-меченого зонда с использованием 200-500 нг очищенного продукта ПЦР в 20 мкл реакции следующим образом: 2 мкл 10X буфера транскрипции Т7 (Invitrogen), 1 мкл (20 ед / мкл) ингибитор РНКазы, 2 мкл Dig-NTP смеси , и 2 мкл Т7 РНК-полимеразы (20 ед / мкл). Принесите конечный объем до 20 мкл РНКазы без воды. Инкубируйте транскрипции реакции при 37 ° С в течение 3-4 часов.
5. Отрегулируйте Закавкription смесь до 50 мкл РНКазы без воды и осаждения Dig-меченой РНК зонд, как описано в шаге 4. Ресуспендируют промытый осадок РНК в 100 мкл РНКазы без воды. Хранить ресуспендированных образцы при -70 ° C.
6. Количественная зонда с использованием NanoDrop спектрофотометр. Для проверки качества зонда, запуск 1-2 мкл образца на 1-2 окрашенных% агарозном геле с этидийбромидом.

2. Сбор и фиксация эмбрионов Drosophila

Обзор: В этом разделе описаны шаги для уборки и обработки поставил Drosophila эмбриона. В зависимости от количества эмбрионов необходимо, мухи могут быть сохранены в популяции клеток различных размеров. Следующие шаги для коллекции осуществляется с помощью 900 см ³ цилиндрическими клетками использованием 100-мм пластин яблочный сок коллекции. Правильная фиксация требует удаления из двух защитных слоев, окружающих зародыш: внешний хориона и внутренней vitellinэлектронной мембраны ^13. После уборки урожая, эмбрионы сначала купались в 50% раствором хлорной извести для удаления хориона, то они смешиваются в двухфазный раствор, содержащий гептан (permeabilizes желточной оболочки), и ФБР, содержащего 3,7% формальдегида. Желточной оболочки, затем трещины и удалена путем переноса эмбрионов в двухфазной смеси гептана и метанола. Правильное закрепление эмбриона и удаление желточной оболочки имеет решающее значение для успеха ниже процедуру FISH.

Материалы

• Сок яблочно-агара (40% яблочного сока, 4% сахарозы, 3,5% агара, 0,3% метилпарабен) с копейки размера дрожжей пасты (пекарских дрожжей смешивают с водой, маслом консистенции)
• Сухое параформальдегида (Electron наук микроскопии, Hatfield, Пенсильвания, США;. Кат № 19208)
• Гептан
• Метанол
• 3% раствор хлорки
• 20 мл стеклянные сцинтилляционные флаконы (Thermo Fisher Scientific, Оттава, Онтарио, Канада;. Кат № 03-337-15).

Оборудование

• Население клетки
• Коллекция корзины (с использованием сетки Nitex и верхней части разреза 50 мл полипропиленовые трубы, в которой дыра была сокращена в крышке).
• Малые кисти
• Столешница вихревой

1. Предварительно ясно сытого населения клетки с свежий яблочный сок / дрожжей плиты в течение 1 часа при 25 ° C.
2. Добавить новый яблочный сок / дрожжей пластины к клетке, чтобы урожай ранних эмбрионов стадии. Инкубируйте клетки в течение 4 часов при 25 ° C (обратите внимание, что коллекция раз может быть скорректирована в зависимости от желаемой стадии).
3. Подготовка свежих 37% раствор формальдегида, объединив 3,7 г параформальдегида порошка, 70 мкл 2N KOH и 7,3 мл MilliQ воды во флаконе сцинтилляционного стекла под химическим капот. Варить до тех пор пока решение параформальдегида порошок полностью не растворится, затем охлаждают до комнатной температуры и фильтр в новом флаконе сцинтилляционные.
4. Подготовка двухфазный раствор фиксацииобъединение 2,25 мл 1X PBS с 250 мл 37% формальдегида в сцинтилляционный флакон, затем добавить 7,5 мл гептана.
5. Заготавливают пластины яблочный сок из клетки и собирать эмбрионов, добавив немного воды комнатной температуры крана и деликатно чистки эмбрионов от пластины с кистью. Передача ресуспендированных эмбрионов в корзину и смойте теплой водой из-под крана.
6. Dechorionate эмбрионов в течение 90 сек, купаясь коллекции корзины в раствор отбеливателя, затем тщательно смыть теплой водой из-под крана (до отбеливатель запах ушел).
7. Разберите корзину для сбора, сбора эмбрионов осторожно помощью кисти и перенести их в двухфазной фиксации решения. Эмбрионы будут накапливаться на границе между PBS и гептана слоев.
8. Печать сцинтилляционные флаконы и крепятся к вихревой смеситель. Встряхните в течение 20 мин на минимальное значение.
9. Снимите и выбросьте самых нижних и верхних PBS гептан фаз при помощи пипетки Пастера. Произносить с придыханиемоставшиеся PBS / гептан / эмбрионов смесь в пипетку. В капле моды, отказаться от нижнего PBS фазы из пипетки, стараясь не устранит эмбрионов. Депозит эмбрионов в 1,5 мл пробирку, содержащую двухфазный раствор 500 мкл гептана (верхняя фаза) и 500 мкл метанола (нижняя фаза).
10. Встряхнуть труб энергично руки в течение 30-45 секунд, чтобы взломать желточной мембраны. Как только трещины, эмбрионы будут погружаться в метаноле.
11. Откажитесь от верхнего гептан фазы и без трещин эмбрионов на гептан / метанол интерфазе, и добавить 500 мкл метанола. Встряхивают в течение 5 сек.
12. Промыть 3 раза с метанолом и хранения эмбрионов при -20 ° C (на данный момент эмбрионы могут храниться в течение недель / месяцев).

3. После фиксации обработки, гибридизация и пост-гибридизации автомойки

Аннотация: В этом разделе подробно описываются этапы обработки эмбрионов пермеабилизации до FISH, предварительно гибридизации,гибридизации с РНК-зондов и пост-гибридизации стирок. Для первых шагов пермеабилизации эмбрионов обрабатываются как бассейн в одной пробирке (шаги 1-9 ниже, направленных на 10-15 мкл поселился эмбрионов / образец), но они аликвоты на отдельные лунки 96-луночный планшет ПЦР Прежде чем приступить к предварительной гибридизации шаге (шаг 10 ниже). Это помогает обеспечить даже лечения всех эмбрионов на начальных этапах эксперимента. При настройке FISH эксперимент, важно, чтобы включить отрицательного контроля для определения уровня фонового сигнала в отдельных экспериментах. Для этого, мы рекомендуем, в том числе образец «не-зонда и, как отмечено в разделе 1, пример гибридизации с« смысл »РНК-зондов, которые, как правило, дают сигнал сравним с условием« не-зонда.

Материалы по теме:

• Метанол
• Фосфатным буферным раствором с 0,1% Tween-20 (PBT)
• Протеиназы K-1 мг / мл маточного раствора (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Канада. Инвентарный номер P2308)
• Глицин (20 мг / мл раствора)
• Гибридизация решения: 50% формамида, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 мкг / мл стриженой ДНК спермы лосося, 100 мкг / мл гепарина.
• 0,2 мл halfskirted 96-луночные ПЦР планшеты, Abgene, Rochester, NY, USA кат. Нет 0900)

Оборудование

• Гибридизация печь, цифровой блок нагрева или водяной бане регулируемый до 56 ° C, 80 ° C или 100 ° C, или машина ПЦР.
• Многоканальные пипетки (рекомендуется для упрощения промывки)
• Nutating смеситель

1. Промойте эмбрионы в метаноле, затем в смеси 1:1 метанол: PBT, а затем дважды в PBT.
2. Исправить эмбрионов в течение 20 мин в 1 мл PBT содержащий 3,7% формальдегида (свежеприготовленный как описано в шаге 11) с постоянной покачивание на nutator.
3. Промойте эмбрионы 3 раза в течение 2 минут в PBT в то время как качалка.
4. Приготовить раствор из 3 мкг / мл протеиназы К (PK) разводят в PBT и добавьте500 мкл раствора для образцов. Инкубируйте образцы в течение 10 мин при комнатной температуре, без встряхивания. Смешать эмбрионов каждые 2 мин струйное с помощью пипетки или, мягко обращения трубы.
5. Трансфер эмбрионов образцы на льду в течение 1 часа.
6. Перемещение образца до комнатной температуры и удаления PK решение. Промойте 2 раза по 2 мин с 1 мл PBT + 2 мг / мл глицина.
7. Исправить образцы 20 мин в 1 мл PBT + 3,7% формальдегида с качалки. Промойте эмбрионы в 5 раз PBT.
8. Промойте эмбрионы с 1 мл смеси 1:1 PBT и Hyb решение. Заменить 0,5-1 мл на 100% Hyb решение (на этом этапе эмбрионы могут храниться в течение нескольких дней / недель при температуре -20 ° C).
9. Алиготе эмбриона на отдельные лунки 96-луночный планшет (цель на ~ 10-15 мкл поселился эмбрионов / а, заботиться, чтобы использовать широкую апертуру советов, чтобы избежать повреждения эмбрионов).
10. Отварить 100 мкл / образец Hyb раствор в течение 5 мин, а затем охлаждают на льду в течение 5 мин. Это решение используется для подготовки проб-гибридизации (Pre-Hyb).
11. Добавить 100 мкл / образец предварительного Hyb решения и инкубировать в течение не менее 2 ч при 56 ° C.
12. Для каждого образца, развести ~ 100 нг зонда в 100 мкл раствора Hyb. Тепло при 80 ° C в течение 3 мин, затем охлаждают на льду в течение 5 мин (с подогревом зонды могут быть сохранены на льду в течение нескольких часов).
13. Удалить предварительного Hyb раствор из эмбрионов и заменить решение зонд РНК.
14. Гибридизации при 56 ° C в течение 12-16 часов.
15. Предварительно теплой следующие решения стирка при 56 ° C: (A) 200 мкл / образец решения Hyb; (B) 100 мкл / образец со счетом 3:1 смесь Hyb: PBT; (C) 100 мкл / образец 1:01 сочетание Hyb: PBT; (D) 100 мкл / образец 1:03 сочетание Hyb: PBT; (E) 400 мкл / образец PBT.
16. Промыть образцов с 100 мкл промывочного раствора, а затем выполнить промывания с 100 мкл / образец AD решения при 56 ° C в течение 15 минут каждый. Затем вымыть образцов 4 раза по 5 мин с 100 мкл / образец решения E при 56 ° C.
17. Прохладный образцы до комнатной температуры.

4. Датчик обнаружения

Обзор: Данный раздел описывает антител и обнаружения реагентов, используемых для обнаружения и визуализации распределения сигнала РНК-зонд следующие гибридизации. Эти шаги изложены схематично на рисунке 2. Здесь мы только представляем стандартных реагентов обнаружения, которые мы используем для надежного усиления сигнала, но существует множество коммерчески доступных реагентов, которые могут быть использованы в качестве альтернативы, особенно при выполнении двойного FISH экспериментов по совместной выявления различных РНК одновременно для белка-РНК двойной окрашивание. Примеры результатов, полученных с помощью этого протокола отображается в экспрессию мРНК / локализации мозаики на рисунке 3.

Материалы

• HRP-конъюгированных моноклональных антител мыши-DIG (Jackson Laboratories, Inc ImmunoResearch Кат. 200-032-156)
• Биотин-сопряженных мышиных моноклональных анти-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc кат. Номер 200-062-156)
• Стрептавидин-HRP конъюгата (Molecular Probes, Eugene OR, США, кат. No.S991)
• Cy-3-tyramide конъюгатов (Perkin Elmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США, Кат. SAT704A)
• DABCO решение для монтажа: в 50 мл трубки, развести 1,25 грамма DABCO (1,4-диазабицикло [2.2.2] октан; Sigma D-2522) в 15 мл 1X PBS, а затем добавить 35 мл глицерина и перемешать до полного однородным. По предварительным смешиванием с PBS, порошок DABCO растворяется очень быстро. Магазин решение для монтажа при температуре -20 ° C.
• Предметные стекла, покровные

Оборудование

• Nutating смеситель
• Многоканальные пипетки
• Флуоресцентный микроскоп

1. Подготовка PBTB раствор, содержащий PBT + 1% сухого обезжиренного молока (обычно 50-100 мл достаточно для всех инкубации обнаружения реагентов и промывки).
2. Блок образцов в течение 10 мин при комнатной температуре в 100 мкл PBTB / образец в то время как покачиваясь на nutator.
3. Удалить блокирующий раствор из эмбрионов и инкубировать образцы в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре с 100 мкл / образец моноклональных биотин анти-DIG раствор антител (разбавленный 1/400 со склада в PBTB) с качалки.
4. Вымойте образцов в 6 раз по 5 мин с 100 мкл PBTB / образца с качалки.
5. Инкубируйте 1,5 часа при комнатной температуре с 75 мл / образец стрептавидин-HRP раствора (разводят 1/100 со склада в PBTB, 10 мкг / мл конечная концентрация) с качалки.
6. Вымойте образцов в 6 раз по 5 мин 100 мкл PBTB / образца с качалки (для ДНК counterstaining, развести DAPI в 1X рабочей концентрации в PBTB и использовать это решение на первом этапе стирки).
7. Промойте эмбрионы с PBT, затем промыть 2 раза в течение 5 мин с PBS.
8. Инкубируйте образцы в течение 2 часов при комнатной температуре на nutator с 50 мкл / образец Cy3-tyramide раствора (разводят 1/50 Tyramide в буфер усиления). С этого шага, убедитесь, хранить образцы в свете экранированные розетки.
9. Вымойте образцов в 6 раз по 5 мин с 100 мкл PBS / образца на nutator.
10. Удалить PBS и добавьте 100-125 мкл / образец монтажа раствора, содержащего 70% глицерина и 2,5% (DABCO). Магазин образцов при температуре 4 ° C. Эти образцы могут храниться в течение нескольких лет.
11. Использование широким отверстием наконечника, ресуспендируют эмбрионов, осторожно пипеткой проб и передать 25 мкл эмбрионов на предметное стекло, затем поместите покровное над эмбрионами и уплотнение на слайд с лака для ногтей.
12. Анализ эмбриона образцов с использованием флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Когда выполняется успешно, эта процедура предлагает поразительно повышения уровня детализации в пространственно-временной анализ экспрессии генов и динамику локализации мРНК во время раннего эмбриогенеза дрозофилы. Действительно, как показано на рисунке 3А для класси?...

Обсуждение

Для шагов зонд синтеза, мы обычно генерируют стоки антисмысловых РНК-зондов в пробирке транскрипции от полной длины кДНК Drosophila амплифицировали из плазмиды найден у дрозофилы ген Collection (РСК), ресурс подробно описаны на сайте: http://www .fruitfly....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (по желанию)
T7, Т3 или SP6 РНК-полимеразы	Fermentas Life Sciences	EP0101, EP0111, EP0131	Комплекты содержат реакции буфера.
DIG РНК маркировки Mix	Roche Applied Science	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
3М ацетата натрия
Холодные 100% этанола.
Холодный 70% этанола.
Хлор раствором хлорной извести разводят водой в соотношении 1:1.
Гептан
Метанол
протеиназы К	Sigma Aldrich Oakville, ON, Канада	Инвентарный номер P2308
40% раствор формальдегида, свежеприготовленного
PBS-Tween решение (PBT)		1xPBS, 0,1% Tween-20
Глицин решения		2 мг / мл глицина в PBT
HRP-конъюгированных моноклональных антител мыши-DIG	Джексон ImmunoResearch Laboratories Inc	200-032 - 156	(1/400 разведении 1 мг / мл маточного раствора в PBTB
HRP-конъюгированных овец моноклональных анти-DIG	Roche Applied Scienсе, Laval, QC	1 207 733	1/500 разбавление исходного раствора в PBTB
Биотин-сопряженных мышиных моноклональных анти-DIG	Джексон ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA, USA	200-062-156	(1/400 разведении 1 мг / мл маточного раствора в PBTB
Стрептавидин-HRP сопряженных	Молекулярные зонды, Евгений Орегон, США	S991	(1/100 разбавление 1 мкг / мл складе