Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Riepilogo

Qui si descrive un insieme di montaggio fluorescente In situ Ibridazione (FISH) protocollo per la determinazione delle proprietà di espressione e la localizzazione di RNA espressi durante l'embriogenesi nel moscerino della frutta, Drosophila melanogaster.

Abstract

Valutare il pattern di espressione di un gene, come pure le proprietà localizzazione subcellulare di suo RNA trascritti, sono caratteristiche essenziali per la comprensione della funzione biologica durante lo sviluppo. RNA ibridazione in situ (ISH-RNA) è un potente metodo utilizzato per visualizzare le proprietà di distribuzione di RNA, sia ai organismal, livelli cellulari o subcellulari ^1. RNA-ISH si basa sulla ibridazione di una sonda di acido nucleico marcato (ad esempio RNA antisenso, oligonucleotidi) complementare alla sequenza di un mRNA o non codificante RNA bersaglio di interesse ^2. Poiché la procedura richiede informazioni di sequenza primaria sola sequenza per generare sonde specifiche, può essere universalmente applicata a una vasta gamma di organismi e campioni di tessuto ^3. Infatti, un certo numero di studi ISH larga scala sono state attuate per documentare l'espressione genica e RNA dinamiche localizzazione in vari organismi modello, che ha portato allacreazione di risorse comunitarie importanti ^4-11. Mentre una serie di etichettatura sonda e strategie di rilevazione sono state sviluppate nel corso degli anni, l'uso combinato di reagenti di rivelazione in fluorescenza marcati enzimatici e di amplificazione di segnale offrono miglioramenti significativi della sensibilità e risoluzione del procedimento ^12. Qui, descriviamo un metodo fluorescente ottimizzata in ibridazione in situ (FISH) utilizzando l'amplificazione del segnale tiramide (TSA) per visualizzare l'espressione di RNA e dinamica in scena localizzazione in embrioni di Drosophila. La procedura viene eseguita in formato a 96 pozzetti piastra PCR, che facilita notevolmente la lavorazione simultanea di un gran numero di campioni.

Protocollo

1. RNA Probe Preparazione

Descrizione: La sezione seguente descrive i passaggi necessari per rendere digossigenina (Dig), sonde di RNA adatta ai pesci. Il primo passo consiste clonazione o PCR amplificazione di una sequenza corrispondente alla regione trascritta di un gene di interesse che verrà utilizzato per generare una sequenza sonda specifica. Ciò può essere ottenuto clonando il primo segmento di gene in un plasmide in cui è affiancato il sito di clonaggio multiplo da elementi promotori batteriofago (T7, T3 e SP6), che può quindi servire come stampo per PCR usando primer fiancheggianti che incorporano le sequenze promotrici , generando così un prodotto lineare PCR con sequenze promotrici diverse in ciascuna estremità (Figura 1A). In alternativa, per evitare il passaggio di clonazione, si può anche effettuare l'amplificazione PCR da DNA genomico o cDNA utilizzando oligonucleotidi che includono T7, T3 e SP6 sequenze al loro 5 'estremità (es T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). I prodotti di PCR lineari vengono poi utilizzati come modelli per senso Dig-marcato o sonde di RNA antisenso per scorrimento trascrizione in vitro con la polimerasi appropriata (Figura 1B). Quando si effettuano sonde per geni specifici, si consiglia di preparare sia il senso e antisenso sonde di RNA polimerasi utilizzando distinti, che saranno utili per la valutazione del segnale specificità FISH (vale a dire a meno che il gene di interesse viene trascritto in orientamento antisenso, il senso di RNA sonda rivelerà la livello del segnale di fondo). In tutti i seguenti passaggi, si dovrebbe fare molta attenzione per evitare il degrado potenziale ribonucleasi contaminanti (RNasi) per prima cosa la pulizia di tutte le aree e le attrezzature da banco con il 70% di etanolo o commerciali, soluzioni per la decontaminazione RNasi e utilizzando RNasi-free forniture (ad esempio acqua, punte, tubi microcentrifuga).

Mammateriali

• 1,5 ml microprovette, (ABgene, Rochester, NY, USA cat. N 0900)
• Gel-estrazione kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada,. Cat. No. 28706).
• RNasi acqua gratuita (Wisent, Cat Inc.. 809-115-CL)
• RNA polimerasi (T7, T3, o SP6). (20 U / mL, Fermentas Biosciences. N. di cat. EP0101, EP0111, EP0131).
• RNasi-OUT inibitori ribonucleasi (40 U / mL), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019).
• Digossigenina (DIG) miscele di nucleotidi (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910).

Attrezzatura

• Piano micro-centrifuga
• Gel-elettroforesi apparato

1. Amplificare PCR gene-specifica sequenza di DNA genomico, cDNA o DNA plasmidico per generare un prodotto lineare PCR fiancheggiato da batteriofago T7, T3 o sequenze promotore SP6. Seguire le raccomandazioni del costruttore per le condizioni di PCR.
2. Verificare la qualità e SIze del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Accise e purificare prodotto PCR utilizzando uno standard di gel-kit di estrazione secondo la produce raccomandazioni ed eluire il prodotto in 50 pl di tampone.
3. Precipitare il prodotto PCR aggiungendo 5 ml di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e 150 ml di etanolo ghiacciato 100%, e posizionare le provette a -70 ° C per una notte. Centrifugare le provette a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C e lavare il pellet con etanolo 70%. Gira di nuovo, eliminare ogni traccia di etanolo e asciugare il pellet. Risospendere in 25-50 ml di acqua priva di RNasi.
4. Trascrivere Dig-sonda marcata con 200-500 ng purificato prodotto di PCR in una reazione di 20 microlitri come segue: 2 microlitri di tampone 10X trascrizione T7 (Invitrogen), 1 ml (20 U / pl) inibitore di RNAsi, 2 microlitri Dig-NTP mix , e 2 microlitri T7 RNA polimerasi (20 U / pl). Portare il volume finale di 20 pl di acqua priva di RNasi. Incubare la reazione di trascrizione a 37 ° C per 3-4 ore.
5. Regolare transcmix rizione a 50 microlitri con acqua priva di RNasi e precipitare la Dig-marcato RNA sonda come descritto al punto 4. Risospendere il pellet di RNA lavato in 100 ml di acqua priva di RNasi. Conservare i campioni risospeso a -70 ° C.
6. Quantificare la sonda utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Per verificare la qualità della sonda, eseguire un campione di 1-2 microlitri su un 1-2% gel di agarosio colorato con bromuro di etidio.

2. Raccolta e fissazione di embrioni di Drosophila

Descrizione: In questa sezione viene descritta la procedura per la raccolta e la lavorazione in scena embrioni di Drosophila. A seconda del numero di embrioni necessari, mosche possono essere mantenuti in gabbie di popolazione di varie dimensioni. I seguenti passaggi sono per le collezioni eseguita utilizzando 900 centimetri ³ gabbie cilindriche con 100 millimetri piastre di raccolta succo di mela. La corretta fissazione richiede la rimozione di due strati protettivi che circondano l'embrione: il corion esterno e l'interno vitelline membrana ^13. Una volta raccolte, gli embrioni vengono prima immersi in una soluzione di candeggina 50% per rimuovere il corion, poi vengono miscelati in una soluzione bifasica contenente eptano (permeabilizes la membrana vitellina), e PBS contenente 3,7% di formaldeide. La membrana vitellina viene quindi rimosso mediante cracking e trasferimento degli embrioni in una miscela bifasica di eptano e metanolo. Fissazione embrione corretto e rimozione della membrana vitellina è fondamentale per il successo della procedura FISH valle.

Materiale

• Apple-Succo di piastre di agar (40% succo di mela, 4% di saccarosio, 3,5% agar, 0,3% metilparaben) con monetina dimensioni pasta di lievito (lievito di birra mescolato con acqua per consistenza del burro)
• Paraformaldeide in polvere (Scienze della microscopia elettronica, Hatfield, PA, Stati Uniti d'America,. Cat. No. 19208)
• Eptano
• Metanolo
• Bleach soluzione al 3%
• Vetro da 20 ml fiale di scintillazione (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada,. Cat No. 03-337-15).

Attrezzatura

• Popolazione gabbie
• Cestelli di raccolta (fatta utilizzando una maglia Nitex e la porzione superiore di un taglio tubo 50 ml polipropilene in cui un foro è stato tagliato nel coperchio).
• Pennello Piccolo
• Tabella vortice top

1. Pre-chiari ben nutriti gabbie di popolazione con un fresco succo di mela / lievito piastra per 1 ora a 25 ° C.
2. Aggiungi un nuovo succo di mela / lievito piastra alla gabbia per raccogliere embrioni nelle fasi iniziali. Incubare la gabbia per 4 ore a 25 ° C (si noti che i tempi di raccolta può essere regolato a seconda delle fasi desiderati).
3. Preparare la soluzione di formaldeide al 37% combinando 3,7 g di paraformaldeide in polvere, 70 ml di KOH 2N, e 7,3 ml di acqua MilliQ in una fiala di scintillazione in vetro sotto cappa chimica. Far bollire la soluzione fino a quando la polvere paraformaldeide è completamente sciolto, poi raffreddare a temperatura ambiente e filtrare in fiala di scintillazione nuova.
4. Preparare una soluzione bifasica fissazione da partecombinando 2,25 ml di PBS 1X con 250 ml di 37% di formaldeide in una fiala di scintillazione, aggiungendo poi 7,5 ml di eptano.
5. Raccogliere la piastra di succo di mela dalla gabbia e raccogliere gli embrioni con l'aggiunta di un po 'di acqua di rubinetto temperatura ambiente e delicatamente spazzolare gli embrioni fuori il piatto con il pennello. Trasferire gli embrioni risospeso in un cesto e risciacquare con acqua tiepida.
6. Embrioni Dechorionate per 90 sec per fare il bagno i cestini di raccolta nella soluzione di candeggina, quindi risciacquare abbondantemente con acqua del rubinetto tiepida (fino a quando l'odore di candeggina è andato).
7. Smontare il cestello di raccolta, raccogliere embrioni delicatamente con un pennello e trasferirli nella soluzione di fissaggio bifasica. Gli embrioni si accumulano in corrispondenza dell'interfaccia tra il PBS e strati eptano.
8. Seal scintillazione fiale e fissarlo ad un miscelatore vortex. Agitare per 20 minuti a più basso.
9. Rimuovere ed eliminare la maggior parte delle fasi inferiore e superiore eptano PBS utilizzando una pipetta Pasteur. Aspirareil restante PBS / eptano / embrioni miscela nella pipetta. In modo goccia a goccia, eliminare la fase inferiore PBS dalla pipetta, facendo attenzione a non eliminare gli embrioni. Depositare gli embrioni in una provetta da 1,5 ml contenente una soluzione bifasica di 500 microlitri eptano (fase superiore) e 500 microlitri metanolo (fase inferiore).
10. Agitare vigorosamente a mano tubi per 30-45 secondi per rompere le membrane vitellino. Una volta rotto, gli embrioni affondano nel metanolo.
11. Eliminare la fase superiore eptano ed embrioni uncracked all'interfase eptano / metanolo, e aggiungere 500 ml di metanolo. Agitare per 5 sec.
12. Lavare 3 volte con metanolo e conservare gli embrioni a -20 ° C (a questo punto gli embrioni possono essere conservati per settimane / mesi).

3. Post-Processing di fissaggio, ibridazione e di post-ibridazione Lavaggi

Descrizione: Questa sezione descrive le fasi di lavorazione per la permeabilizzazione embrione prima FISH, pre-ibridazione,ibridazione con le sonde di RNA e post-ibridazione lavaggi. Per le fasi iniziali permeabilizzazione gli embrioni vengono gestite come una piscina in un unico tubo (punti 1-9 di seguito, puntando il 10-15 ml di embrioni regolati / campione), ma sono frazionato in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti PCR prima di procedere con la pre-ibridazione step (passo 10). Questo aiuta a garantire anche il trattamento di tutti gli embrioni nelle fasi iniziali dell'esperimento. Quando si imposta un esperimento FISH, è importante includere controlli negativi per determinare il livello del segnale di fondo in esperimenti singoli. Per questo, si consiglia anche a campione, un 'no-sonda' e, come indicato al punto 1, un campione ibridato con il 'senso' della sonda di RNA, che in genere un segnale paragonabile a condizionare il 'no-sonda'.

Materiali:

• Metanolo
• Tampone fosfato con 0,1% Tween-20 (PBT)
• Proteinasi-K 1 mg / ml di soluzione concentrata (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Catalog No. P2308)
• Glycine (20 mg / ml di soluzione concentrata)
• Soluzione ibridazione: 50% formammide, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml di DNA di sperma di salmone tosata, 100 pg / ml di eparina.
• 0,2 ml halfskirted 96 pozzetti piastre PCR, ABgene, Rochester, NY, Stati Uniti d'America Cat. No 0900)

Attrezzatura

• Bagno fornetto, blocco riscaldante digitale o acqua regolabile a 56 ° C, 80 ° C o 100 ° C, o una macchina PCR.
• Pipette multicanale (consigliato per semplificare fasi di lavaggio)
• Oscillante mixer

1. Risciacquare gli embrioni in metanolo, poi in una miscela 1:1 di metanolo: PBT, e quindi due volte in PBT.
2. Fissare gli embrioni per 20 min in 1 ml di PBT contenente 3,7% di formaldeide (preparata come descritto nel passaggio 11) con dondolo costante su un nutator.
3. Lavare gli embrioni per 3 volte per 2 minuti in PBT mentre a dondolo.
4. Preparare una soluzione di 3 mg / ml di proteinasi K (PK) diluito in PBT e aggiungere500 microlitri di soluzione di campioni. Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Mescolare embrioni ogni 2 minuti di getto con una pipetta o delicatamente invertendo i tubi.
5. Trasferire campioni embrioni in ghiaccio per 1 ora.
6. Spostare i campioni a temperatura ambiente e rimuovere la soluzione PK. Lavare 2 volte per 2 min con 1 ml di PBT + 2 mg / ml di glicina.
7. Fissare i campioni 20 min in 1 ml di formaldeide PBT + 3,7% a dondolo. Risciacquare embrioni 5 volte in PBT.
8. Risciacquare embrioni con 1 ml di una miscela 1:1 di PBT e soluzione Hyb. Sostituire con 0,5-1 ml di soluzione di ibridazione 100% (in questa fase gli embrioni possono essere conservati per diversi giorni / settimane a -20 ° C).
9. Embrioni aliquote nei singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (obiettivo per ~ 10-15 microlitri di embrioni regolati / pozzetto, aver cura di utilizzare punte ampia apertura per evitare di danneggiare gli embrioni).
10. Bollire 100 pl / campione di soluzione di ibridazione per 5 minuti e poi raffreddare in ghiaccio per 5 min. Questa soluzione viene utilizzata per il campione pre-ibridazione (Pre-Hyb).
11. Aggiungere 100 microlitri / campione di pre-ibridazione soluzione e incubare per almeno 2 ore a 56 ° C.
12. Per ciascun campione, diluire ~ 100 ng di sonda in 100 microlitri di soluzione di ibridazione. Riscaldare a 80 ° C per 3 minuti, poi raffreddare in ghiaccio per 5 min (sonde riscaldate possono essere tenuti in ghiaccio per diverse ore).
13. Rimuovere il pre-ibridazione soluzione da embrioni e sostituirlo con la soluzione della sonda RNA.
14. Ibridare a 56 ° C per 12-16 ore.
15. Pre-riscaldare le seguenti soluzioni di lavaggio a 56 ° C: (A) 200 microlitri / campione di soluzione di ibridazione; (B) 100 microlitri / campione di una miscela 3:1 di ibridazione: PBT; (C) 100 pl / campione di 01:01 mix di ibridazione: PBT, (D) 100 pl / campione di una miscela 1:3 di Ibrid: PBT, (E) 400 microlitri / campione di PBT.
16. Lavare i campioni con 100 ml di soluzione di lavaggio A, quindi eseguire la fase di lavaggio con 100 pl / campione di AD soluzioni a 56 ° C per 15 minuti ciascuno. Poi, lavare i campioni 4 volte per 5 min con 100 pl / campione di soluzione a 56 ° C.
17. Campioni raffreddare a temperatura ambiente.

4. Sonda di rilevamento

Sommario: Questa sezione descrive gli anticorpi e reagenti di rilevazione utilizzati per rilevare e visualizzare la distribuzione del segnale della sonda di ibridazione RNA seguente. Questi passaggi sono illustrati schematicamente in figura 2. Qui si presenti solo i reagenti di rivelazione standard che utilizziamo per l'amplificazione del segnale robusta, ma esiste una varietà reagenti disponibili in commercio che possono essere utilizzati come alternative, particolarmente quando effettua doppio FISH esperimenti di co-RNA rilevare simultaneamente per proteina-RNA a doppio colorazione. Esempi di risultati ottenuti con questo protocollo sono visualizzati nel mosaico mRNA espressione / localizzazione schema in Figura 3.

Materiale

• HRP-coniugato monoclonale di topo anti-DIG (Jackson Laboratories ImmunoResearch Cat Inc.. No. 200-032-156)
• Biotina-coniugato monoclonale di topo anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Cat Inc.. No. 200-062-156)
• Streptavidina-HRP coniugato (Molecular Probes, Eugene, USA, cat. No.S991)
• Cy3-tiramide coniugati (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, Stati Uniti d'America, N. di cat. SAT704A)
• DABCO soluzione di montaggio: In una provetta da 50 ml, diluire 1,25 grammi di DABCO (1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano; Sigma D-2522) in 15 ml di PBS 1X, quindi aggiungere 35 ml di glicerolo e mescolare fino a completa omogenea. Premiscelando con PBS, la polvere viene sciolta DABCO molto rapidamente. Conservare la soluzione di montaggio a -20 ° C.
• Vetrini coprioggetto

Attrezzatura

• Oscillante mixer
• Pipetta multicanale
• Microscopio a fluorescenza

1. Preparare soluzione PBTB, contenente PBT + 1% non-grassi del latte secco (di solito 50-100 ml è sufficiente per tutti l'incubazione di rilevamento reattivo e fasi di lavaggio).
2. Bloccare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente in 100 PBTB pl / campione, mentre a dondolo su nutator.
3. Rimuovere la soluzione di blocco da embrioni e campioni incubare per 1,5-2 ore a temperatura ambiente con 100 pl / campione della biotina monoclonale anti-DIG soluzione di anticorpi (diluito 1/400 da magazzino in PBTB) con dondolo.
4. Lavare i campioni 6 volte per 5 minuti ciascuna con 100 PBTB pl / campione con dondolo.
5. Incubare 1,5 ore a temperatura ambiente con 75 ml / campione di streptavidina-HRP soluzione (diluito 1/100 a magazzino in PBTB, 10 pg / ml concentrazione finale) con dondolo.
6. Lavare i campioni 6 volte per 5 minuti ogni 100 PBTB pl / campione con dondolo (per il DNA di contrasto, diluire DAPI a 1X concentrazione di lavoro in PBTB e utilizzare questa soluzione nel passaggio primo lavaggio).
7. Sciacquare embrioni con PBT, quindi lavare 2 volte per 5 minuti con PBS.
8. Incubare campioni per 2 ore a temperatura ambiente sulla nutator con 50 pl / campione di Cy3-tiramide soluzione (diluito 1/50 in tampone di amplificazione tiramide). Da questo punto in poi, assicurarsi di mantenere i campioni in un recipiente luce schermato.
9. Lavare i campioni 6 volte per 5 minuti ciascuno con 100 ul di PBS / campione nutator.
10. Rimuovere PBS e aggiungere 100-125 pl / campione di soluzione di montaggio contenente il 70% di glicerolo e del 2,5% (DABCO). Conservare i campioni a 4 ° C. Questi campioni possono essere conservati per diversi anni.
11. Utilizzando un ampio foro punta, risospendere gli embrioni pipettando gentilmente i campioni e trasferire 25 pl di embrioni su un vetrino, quindi inserire un coprioggetto sopra gli embrioni e tenuta sul vetrino con smalto per unghie.
12. Analizzare campioni embrioni usando un microscopio a fluorescenza.

Risultati

Se eseguito con successo, questa procedura offre un livello sorprendentemente maggiore di dettaglio spazio-temporale analisi dell'espressione genica e della dinamica di localizzazione di mRNA durante i primi embriogenesi Drosophila. Infatti, come illustrato nella figura 3A per la classica coppia di regola-runt gene (pista), si può usare questo protocollo per osservare eventi di espressione genica attraverso l'individuazione dei focolai trascritto nascente in gruppi di...

Discussione

Per la procedura di sintesi della sonda, di solito generano run-off sonde di RNA antisenso mediante trascrizione in vitro da full-length cDNA Drosophila amplificati da plasmidi presenti nel gene Drosophila Collection (DGC), una risorsa dettagliato al seguente indirizzo: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html ^14,15. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato in grandi studi di ISH di scala volte a espressi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
T7, T3 e SP6 RNA polimerasi	Fermentas Life Sciences	EP0101, EP0111, EP0131	I kit contengono tampone di reazione.
DIG RNA Labeling Mix	Roche Applied Science	11 277 073 910
RNAguard	Amersham Biosciences	27-0816-01
3M sodio acetato
Freddo etanolo 100%.
Etanolo freddo al 70%.
Soluzione di candeggina al cloro diluito 1:1 con acqua.
Eptano
Metanolo
proteinasi K	Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada	Catalog No. P2308
Soluzione al 40% di formaldeide, preparata
PBS-Tween soluzione (PBT)		1xPBS, 0,1% Tween-20
Glycine soluzione		2 mg / ml di glicina in PBT
HRP-coniugato monoclonale di topo anti-DIG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc	200-032 - 156	(1/400 di una diluizione 1 mg / ml di soluzione concentrata in PBTB
HRP-coniugato pecore monoclonale anti-DIG	Roche Applied Sciencece, Laval, QC	1 207 733	1/500 di diluizione della soluzione di riserva in PBTB
Biotina-coniugato monoclonale di topo anti-DIG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, Stati Uniti d'America	200-062-156	(1/400 di una diluizione 1 mg / ml di soluzione concentrata in PBTB
Streptavidina-HRP coniugato	Molecular Probes, Eugene, USA	S991	(Diluizione 1/100 di una mcg / ml 1 stock