Une méthode pour étudier l'impact de l'échec ovarien chimiquement induite sur la capacité d'exercice et cardiaque adaptation chez la souris

Résumé

Deux paradigmes de l'exercice ont été testés sur un modèle de souris de la ménopause induite chimiquement nouvellement mis au point pour examiner l'impact de la ménopause sur la capacité d'exercice et l'adaptation cardiaque à l'exercice.

Résumé

Le risque de maladies cardiovasculaires (MCV) augmente chez les femmes post-ménopausées, encore, le rôle de l'exercice, comme une mesure préventive pour le risque de maladies cardiovasculaires chez les femmes post-ménopausées n'a pas été suffisamment étudiée. En conséquence, nous avons étudié l'impact de l'exercice volontaire cage de roue et l'exercice sur tapis roulant forcé sur l'adaptation cardiaque chez la souris de la ménopause. Le modèle inductible le plus couramment utilisé pour simuler la ménopause chez les femmes est l'une ovariectomie (OVX) rongeur. Cependant, le modèle OVX a quelques différences de la ménopause chez les humains. Dans cette étude, nous avons administré le 4-vinylcyclohexène diépoxyde (VCD) à des souris femelles, ce qui accélère l'insuffisance ovarienne comme un modèle de la ménopause alternative à étudier l'impact de l'exercice chez les souris de la ménopause. VCD accélère sélectivement la perte des follicules primaires et primordiales résultant dans un état endocrinien qui imite de près la progression naturelle de la pré-Peri-et post-ménopause chez les humains. Pour déterminer l'impact de l'exercice sur l'exercicecapacités et l'adaptation cardiaque chez les souris femelles traitées VCD, deux méthodes ont été utilisées. Tout d'abord, nous avons exposé un groupe de souris VCD-traités et non traités à une roue de la cage volontaire. Deuxièmement, nous avons utilisé l'exercice sur tapis roulant forcé pour déterminer la capacité d'exercice dans un groupe de souris VCD-traités et non traités distincts mesurées comme une tolérance à l'exercice d'intensité et d'endurance.

Introduction

Le début de la ménopause naturelle est caractérisée par l'épuisement des follicules primordiaux de l'ovaire à travers l'atrésie, entraînant finalement la sénescence ovarienne. Aux États-Unis, plus de 30% de la durée de vie des femmes sera passé post-ménopausique. En réponse à une diminution de la fonction ovarienne, plusieurs conséquences physiologiques et psychologiques peuvent se produire, y compris l'adiposité accrue, l'instabilité vasculaire, et de l'humeur ou de troubles du sommeil. En raison de l'augmentation de l'obésité / adiposité rapport à leurs homologues non ménopausées ^1,2, les femmes ménopausées sont particulièrement plus sensibles au syndrome métabolique et les comorbidités associées, y compris les maladies cardiovasculaires (MCV) ^3. En outre, il devient de plus en plus évident que la réadaptation cardiaque réussie pour les patients atteints de maladies cardiovasculaires comprend l'exercice aérobie régulier, et que l'exercice réduit la morbidité et la mortalité cardiovasculaires chez ces sujets ^4,5. Pourtant, comment la capacité d'exercice changes pendant la transition pré-et post-ménopause n'a pas été bien étudié. Plus important encore, le rôle de l'exercice comme une mesure préventive pour le risque de maladies cardiovasculaires chez les femmes post-ménopausées demeure remarquablement peu étudié.

Le modèle inductible le plus couramment utilisé pour simuler la ménopause chez les femmes est l'une ovariectomie (OVX) rongeur. Récemment, le produit chimique au travail 4-vinylcyclohexène diépoxyde (VCD) a été montré pour cibler spécifiquement les petits follicules ovariens primaires et primordiales en accélérant le processus naturel de l'atrésie, entraînant finalement une insuffisance ovarienne avec aucune toxicité évidente dans d'autres tissus ^6. Le cycle oestral de souris VCD traité, qui est analogue à un cycle menstruel humain, cesse dans les 2-3 mois après la fin des injections de VCD, qui entraîne à son tour dans un retrait progressif de l'oestrogène, imitant le péri-et post-ménopausique transition. Ainsi, un follicule-épuisent, animal ovaire intacte se rapproche étroitement de l'humain naturelprogression à travers le pré-Peri à la transition post-ménopausique ^7-9. De plus, il offre une alternative non chirurgicale au modèle OVX réduire les complications de la chirurgie, comme l'infection. Dans cette étude, nous avons utilisé des souris de la ménopause induite VCD à étudier l'impact de l'exercice sur l'adaptation cardiaque chez la souris de la ménopause.

Il ya plusieurs cas qui suggèrent l'association entre l'oestrogène et l'exercice de la roue dans la cage rongeurs des deux sexes ^10-13. Œstrogènes épuisement par ovariectomie chirurgicale diminue l'activité de l'exercice volontaire chez la souris et le rat ^14,15. Deux méthodes d'exercice ont été utilisés dans cette étude pour tester la capacité d'effort de la ménopause souris VCD-induits. roue de la cage fonctionnement est généralement considéré comme un type d'exercice volontaire dans des modèles animaux et réalisée, sans doute, dans des conditions moins stressantes. Cependant, la roue de la cage fonctionnement n'est pas indicative de la capacité d'exercice relative des animaux, qui exige que les animaux exercisoi niveaux beaucoup plus élevés. L'exercice forcé de tapis roulant a été utilisé pour déterminer la capacité d'exercice, mesurée comme une tolérance à l'exercice d'intensité et d'endurance. En outre, nous avons déjà montré que l'exercice de la roue de la cage fournit un stimulus pour l'hypertrophie cardiaque et cette croissance hypertrophique est dépendant du sexe ^16. Par conséquent, nous avons également mesuré l'adaptation cardiaque à l'exercice de la roue de la cage à souris ménopause VCD-induites.

Protocole

Toutes les expériences, le logement et les soins aux animaux a été réalisée en utilisant des protocoles qui ont adhéré aux lignes directrices et approuvés par la institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité à l'Université de l'Arizona, et à 2011 directives du NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Une. Le traitement avec le 4-vinylcyclohexène diépoxyde

1. VCD protocole de dosage: Dans une hotte chimique, ajouter 0,587 ml de VCD à un flacon propre et amener le volume final de 10 ml avec de l'huile de sésame, puis mélanger en retournant doucement, couvrir et sceller avec du Parafilm. Transférer la solution dans un flacon de dosage, le sceller avec du Parafilm et stocker à 4 ° C pendant jusqu'à 7 jours. Assurez-vous que tous les réactifs sont stériles.
   1. Utiliser l'huile de sésame comme la commande d'un véhicule VCD est dissous dans l'huile de sésame. VCD de magasin (MW = 140,2 g / mol, densité = 1,09 g / ml) à -20 ° C.
   2. VCD protocole d'injection: A 2 mois, peser et d'administrer des injections intrapéritonéales quotidiennes de tempéature VCD à la dose de 160 mg / kg pendant 20 jours consécutifs. Injecter des souris témoins d'une manière similaire avec la solution de véhicule, l'huile de sésame, à un volume de 2,5 ml / kg.
      Remarque: Au cours de la période d'injection, essayez d'alterner les sites d'injection pour réduire les risques d'infection locale. Utilisez l'équation suivante pour calculer le volume nécessaire pour l'injection: Poids corporel (g) x kg / 1000 gx 2,5 ml / kg = volume (ml) de la solution à injecter résultant dans environ 50 ml / injection à l'aide d'une aiguille 27 G. En raison de la taille de l'aiguille des anesthésiques locaux ne sont pas nécessaires.
   3. Surveillance du cycle oestral: Après la période d'injection est terminée, contrôler les cycles oestraux quotidiennement par l'obtention de frottis vaginaux. Retenir des souris en utilisant la méthode de la nuque dos. Insérer une pipette de 0,2 ml de solution saline stérile dans l'orifice vaginal d'une profondeur de 0,5 cm. Triturer saline (3x) et placer une goutte sur une diapositive vierge. Évaluer immédiatement les échantillons au microscope en utilisant un microsc lumière standardope à 100X ampleur.
      Remarque:. Cytologie vaginale est déterminé à veiller à la perte du cycle et donc valider insuffisance ovarienne figure 2A illustre la cytologie vaginale typique à travers les différentes phases du cycle oestral chez la souris, à savoir proestrus, oestrus, metestrus, dioestrus ^17-19. Pendant proestrus, les cellules comprennent des cellules épithéliales nucléées (figure 2A, les flèches indiquent les cellules nucléées); pendant l'oestrus, les cellules sont principalement cornée cellules épithéliales squameuses; Metestrus se caractérise par un mélange de types de cellules, avec une prédominance de leucocytes; Diestrus est dominé par les leucocytes. Ajustement du plan focal peut être nécessaire pour visualiser les noyaux des cellules et dans tout l'échantillon. Comme illustré sur la figure 2B, un cycle d'oestrus murine typique est de 4-5 jours. Les souris sont considérées acyclique après 15 jours consécutifs dans diestrus persistante. Surveiller en permanence les cycles d'oestrus pendant toute la durée de l'étude parIOD pour confirmer l'absence de cycles d'oestrus chez les souris traitées VCD.

2. Volontaire exercice Cage roues

Consanguines C57BL / 6 et des souris B6C3F1 femelles, âgés de 7 mois, sont exposés à des volontaires roue cage fonctionnement. animaux de la maison individuellement dans une cage (47 cm x 26 cm x 14,5 cm) avec un accès sans entraves à une roue de la cage pendant 28 jours.

1. configuration de l'équipement: L'appareil de roue de la cage se compose d'une roue d'un diamètre de 11,5 cm avec 5.0 cm de large surface équipé d'un compteur magnétique numérique qui est activé par la rotation de la roue en cours d'exécution. Avant chaque essai roue de roulement, calibrer la roue de la cage selon les directives du fabricant. Mesurer le diamètre intérieur de la roue de roulement, calculer la circonférence et entrer cette valeur dans le compteur numérique de la taille de la roue.
   1. Fixez la partie informatique du compteur magnétique numérique à la position de la roue à l'aide du ruban adhésif.
   2. Fixez le port de l'ordinateurion du compteur magnétique numérique à la position de la roue à l'aide du ruban adhésif.
   3. Attacher l'aimant libre du compteur magnétique numérique à la barre centrale du même côté que l'aimant câblé à l'ordinateur, à nouveau ruban adhésif suffisamment pour protéger l'aimant de chewing dommages. Les aimants doivent être positionnés de telle sorte que chaque rotation de la roue est enregistrée par l'ordinateur sans aucune interférence ou la résistance à compléter la rotation de la roue.
      Note: Le ruban adhésif a été utilisé avec succès pour fixer les composants du compteur magnétique numérique à la roue de roulement. Taping doit être suffisante pour couvrir complètement l'aimant et prévenir les dommages causés par l'animal à mâcher. L'aimant doit être placé aussi près que possible de la roue sans entraver son mouvement. Toutefois, l'installation doit être contrôlée quotidiennement pour mâcher et réparé si nécessaire.
   4. Monter la roue de la cage en faisant glisser la roue support à travers le câblage haut de la cage de l'animal. Fixer le socle de la roue à til câblage de cage avec des clips de liant.
      Remarque: La pince doit être sur le dessus du câblage, à une distance à partir de l'animal. Nourrir la partie de l'ordinateur et un câble supplémentaire à travers le câblage de la cage. Installez l'ordinateur et l'excédent de câble hors de la portée de l'animal. Ceci peut être réalisé en plaçant une matière plastique de taille moyenne pèse plat sur le dessus du câblage de la cage pour maintenir l'ordinateur et l'excédent de câble.
2. Exercice: Pour une portée donnée, assigner au hasard les souris soit le contrôle sédentaire ou régime d'exercice. Donner à tous les animaux de l'eau et ad libitum rongeur dur de nourriture standard.
   1. Enregistrer manuellement les valeurs quotidiennes de la RAN à distance (km / jour) et le temps total passé à exécuter (h / jour), proposée par le compteur magnétique. Distance et le temps d'enregistrement des valeurs dans le même laps de temps de 1 heure chaque jour pour des valeurs précises et cohérentes tout au long de la durée de 28 jours de la période d'exercice. Effacer (zéro) le compteur magnétique après l'enregistrement de chaque jour pour assurer des lectures précises le suivition jours.
   2. Calculer les valeurs moyennes de la distance et de la vitesse pour chaque groupe. Calcul de la vitesse sur la base des valeurs données de distance et de temps chaque jour pour chaque souris. Les données peuvent être affichées en tant que moyennes hebdomadaires quotidienne ou pour chaque paramètre mesuré.
3. récolte de tissus: A la fin de la période d'exercice spécifique, euthanasier exercé et les animaux témoins sédentaires dans les 30 minutes de la sortie de cages par dislocation cervicale sous anesthésie par inhalation. Peser la masse corporelle et les coeurs rapidement accise, le muscle squelettique, et les ovaires.
   1. Au moment de la récolte de tissus, monter et colorer les ovaires prélevés avec l'hématoxyline et de l'éosine (H & E, figure 2C). Au microscope, compter et classer les follicules comme primordial, primaire, secondaire, ou de l'antre pour chaque animal VCD-traités et témoins ^20. Un follicule primordial contient une petite ovocyte primaire, une seule couche de cellules de la granulosa aplaties ou squameuses étroitement opposées à l'ovocyte, et une baselimbe. Un follicule primaire est définie par la présence d'une ou plusieurs cellules de la granulosa cubiques qui sont disposées en une seule couche qui entoure l'ovocyte. Un follicule secondaire contient des cellules de la granulosa qui forment plusieurs couches autour de l'ovocyte, et une thèque. Un follicule antral est caractérisée par une cavité ou "sinus" contenant un fluide.
   2. Pour exciser le coeur, faire une incision médiane sur la face ventrale et de visualiser le cœur après l'ouverture du diaphragme. Rapidement exciser le coeur à la base et le lieu dans le froid tampon phosphate salin à suffisamment de wash-out résiduel sang ventriculaire. Coupez le coeur de l'excès de tissu, de peser de tout son cœur et enclenchez-gel dans de l'azote liquide.
   3. Lavez tous les autres tissus excisés avec une solution modifiée glacée tampon phosphate salin (PBS), et enclenchez-gel dans l'isopentane refroidi dans de l'azote liquide.

3. Exercice sur tapis roulant forcé

1. Lorsque l'on emploie un exercice forcé paradigme to mesurer la capacité d'exercice, utilisez un tapis roulant et mis en place comme suit:
   1. Placer une grille de choc électrique à la base de la rampe de tapis roulant. Ce choc générée sert de stimulus pour l'exercice. L'intensité et la fréquence des stimuli électriques sont commandés manuellement par les utilisateurs. Les grilles peuvent être activées ou désactivées individuellement pour chaque voie. Tout collecte de données se fait manuellement.
   2. Périodiquement, étalonner le tapis roulant selon les directives du fabricant.
      1. Assurez-vous que la manette de la face avant tapis roulant contrôleur est réglé sur "STOP".
      2. capteur de vitesse de place sur le tapis roulant lane1 de ceinture et fixer solidement avec la vis écrou dans la position indiquée ci-dessous.
      3. Utilisation de la molette sur la face avant du contrôleur tapis roulant, régler la vitesse de 88,7 m / min Ensuite, définissez la fréquence de stimulation électrique à 2 Hz sur le panneau avant du contrôleur tapis roulant.
      4. Appuyez sur le bouton "ODOMETER RESET" pour initialiser la procédure d'étalonnage.
         Remarque: Les groupes de contrôle sédentaires ou nonexercise doivent être inclus dans le protocole expérimental. Le groupe sédentaire est appariés pour l'âge à l'exercice de groupe. Nous avons précédemment montré que le logement, les souris sédentaires individuellement dans des cages de taille égale à la souris exercées n'ont pas d'impact sur les paramètres d'intérêt par rapport à des souris sédentaires hébergés avec les frères et sœurs. Par conséquent, les souris sédentaires ont été maintenus avec les frères et sœurs dans la même chambre que les souris exercées.
2. Acclimatation: acclimater souris sur le tapis roulant 3-7 jours avant l'expérience quotidienne. Pour ce faire, placez la souris sur le tapis roulant avec les ceintures grilles immobiles et choc éteint, mais avec le moteur de ceinture (bruit). Laissez souris non perturbées pendant au moins 15 min.
3. Warm up: Warm up étapes employé dans le présent protocole sont les suivants:
   1. Placez chaque souris sur le tapis roulant. Désactiver la grille de choc et d'augmenter la vitesse de la courroie à 4 m / min pendant 15 min.
   2. Activer la grille de choc et de maintenir la vitesse de la bande à4 m / min vitesse de la bande pour encore 10 min.
4. schémas de formation d'exercice
   1. Après échauffement, garder grilles de choc sur et augmenter la vitesse de la bande de 5 m / min pendant 15 min.
   2. Augmenter la vitesse de la bande de 15 m / min pendant 15 min de plus.
   3. Après la formation, le transfert des souris à leurs cages.
      Remarque: Dans cette étude, la formation d'exercice a été effectué quotidiennement pendant 1 semaine.
   4. Régime d'exercice aiguë: Un régime d'exercice aigu est conçu pour déterminer les effets à court et à long terme du stress d'exercice extrême.
      1. A la suite d'échauffement, d'augmenter la vitesse de la courroie de 5 m / min à 10, 15, 20, 25, et 30 m / min à 10 min d'intervalle.
         Remarque: Terminez l'exercice si les souris sont incapables de continuer à fonctionner ou de montrer des signes d'épuisement ou de détresse. Dans notre étude, la plupart des animaux ont été arrêtés à 25 m / min, et aucun animal passés de 30 m / min stade.
      2. Testez chaque souris à trois reprises, permettant 2-3 jours entre chaque test. Calculer les valeurs moyennes dans tous les exercicesséances du SCIE pour chaque souris.
   5. régime d'exercice pour l'endurance: Un protocole d'exercice d'endurance est conçu pour former des souris pour une exposition prolongée à l'exercice sur tapis roulant stimulus. Ce type de protocole teste la capacité à tolérer les effets à long terme du stress d'exercice modéré.
      1. Commencez par la vitesse de la bande décrite au cours de la période d'échauffement, 4 m / min.
      2. Augmenter progressivement la vitesse de la courroie en 1m/min jusqu'à une vitesse finale de 20 m / min soit atteinte. La durée totale d'un protocole d'étude typique est de 50 min.
      3. Après l'exercice régime, transférer souris à leurs cages.
         Remarque: L'exécution des souris à l'épuisement est évitée. Si à n'importe quel moment pendant l'expérience d'une souris montre des signes d'épuisement, désactiver la grille de choc et permettre la souris pour se reposer et récupérer.

4. Les données et l'analyse statistique

1. Présenter les résultats sous forme de moyenne ± SEM et utilisent 2 ANOVA (groupe de traitement et exercice comme facteurs principaux) suivie d'un test de Student-Newman Keuls post hoc ou le test t de Student pour comparer les différences entre les valeurs moyennes.
2. Déterminer le changement de pour cent de la masse cardiaque à l'exercice en comparant la masse de chaque animal exercé à la masse cardiaque moyenne du groupe sédentaire. La différence de masse cardiaque est alors exprimé comme un changement de pour cent des animaux sédentaires pour chaque animal respectif. Les valeurs de p de <0,05 sont considérées comme statistiquement significatives.

Résultats

Un protocole expérimental typique, tel que celui utilisé dans cette étude, est illustré sur la figure 1. À la suite de 20 jours consécutifs de traitement de VCD, la cytologie vaginale a été utilisé pour déterminer la présence ou l'absence de cyclicité chez les souris VCD-injecté; les souris injectées avec le véhicule ont également été surveillés. La phase du cycle oestral a été déterminée par la proportion de cellules épithéliales, les cellules épithéliales et les leucocytes, cornées dans le frottis vaginal (figure 2A). La présence de cellules épithéliales ne cornée indiqué la souris était en chaleurs, et donc encore le cyclisme. Le cycle oestral chez les souris dure généralement 4 jours, donc injecté VCD animaux ont été considérés comme acyclique après 15 jours de dioestrus persistante, dans lequel la cytologie vaginale a révélé une majorité de leucocytes (Figure 2A). Le cycle oestral de souris VCD traité est devenue irrégulière, puis a cessé dans les 2-3 mois après le début des injections de VCD (figure 2B) . VCD tissu ovarien a montré une atrophie significative, par rapport aux témoins. À fort grossissement, on voit un épuisement complet des follicules primaires et primordiales (figure 2C).

Pour tester l'effet de l'insuffisance ovarienne induite VCD sur la performance de l'exercice, nous avons randomisé de 7 mois VCD et les souris traitées avec le véhicule (deux souches, C57BL / 6 et B6C3F1) soit des groupes d'exercice roues sédentaires ou cage 4-6 semaines après la cessation de cyclisme (Figure 1). Valeurs d'exercices quotidiens ont été enregistrés pour le temps et la distance pour chaque animal exercé tout au long de la période d'exercice de 4 semaines. Des valeurs moyennes hebdomadaires de course journalières pour la distance, la vitesse et le temps sont représentées sur la figure 3 pour les souris C57BL / 6 traitées avec le véhicule ou VCD. Nous n'avons pas vu de différences significatives dans la performance physique mesurée par le temps moyen quotidien, la distance et la vitesse sur la roue de la cage entre-VCD et les groupes traités avec le véhicule en soit C57BL / 6 ou B6C3F1 sourissouche (figure 4A). Les vitesses de passage de roue en cours d'exécution calculés progressivement augmenté au cours de la période de fonctionnement de 4 semaines comme indiqué précédemment ^16, mais n'étaient pas significativement différents entre les groupes expérimentaux. Ces études indiquent l'impact de l'insuffisance ovarienne VCD induite sur l'exercice volontaire de la roue de la cage dépasse au moins 2 souches de souris.

Suite à la durée du protocole d'exercice de la roue de la cage volontaire, morphométriques du corps ont été enregistrés et les coeurs ont été rapidement excisées et pesées. Nous avons précédemment montré que l'exercice de la roue de la cage volontaire induit une augmentation de la masse cardiaque ^16. Ici, nous montrons également l'hypertrophie cardiaque en réponse à l'exercice de la roue de la cage mesurée en poids de coeur absolu (HW) et HW normalisée à la longueur du tibia (TL) (tableau 1). La masse de coeur absolu et rapport HW / TL étaient significativement plus élevés dans-véhicule et souris VCD traités par rapport à leurs homologues sédentaires. Cependant, il n'y avait pas mesudifférences mesurables dans l'hypertrophie cardiaque entre le contrôle et la souris de l'insuffisance ovarienne induite VCD suivants volontaire exercice de la roue de la cage.

Ensuite, nous avons utilisé involontaire (forcé) en cours d'exécution tapis roulant afin de déterminer la capacité d'exercice. Nous avons d'abord soumis des souris à un protocole de haute intensité que l'augmentation progressive de la vitesse moyenne toutes les 10 minutes jusqu'à l'épuisement. En moyenne, la vitesse maximale de souris traité avec le véhicule était de 26,7 ± 0,95 m / min et la vitesse maximale de souris VCD traitée était de 28 ± 1,4 m / min avant l'épuisement. Nous avons utilisé de moindre intensité fonctionnant à 20 m / min (environ 80% du maximum) pour doser la capacité d'endurance. Comme le montre la figure 4B, aucune différence significative de capacité élevée ou faible intensité de l'exercice a été trouvée entre le véhicule et le groupe traité VCD, indiquant que l'insuffisance ovarienne induite VCD-eu aucun effet sur ​​la capacité d'effort de la souris.

En conclusion, la ménopause induite par le traitement de VCD n'a aucun effet sur r soit volontaire ou forcée capacité unning, ainsi que la réponse adaptative cardiaque à l'exercice.

Figure 1. VCD-administration et le protocole expérimental. Souris ont été administrés par VCD (160 mg / kg) ou de l'huile de sésame (véhicule témoin) à partir de 2 mois, pendant 20 jours consécutifs. Après VCD ou véhicules injections, cycle œstral ont été surveillés et cyclicités ont été déterminées comme décrit dans la section Méthodes. Perte de la fonction ovarienne s'est produite en 60-90 jours et a été confirmée par la cytologie vaginale. A 7 mois d'âge, les souris ont été exposées à l'exercice volontaire de la roue de la cage pendant 4 semaines, ou soumis au protocole d'effort sur tapis roulant.

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. Figure 2 insuffisance ovarienne induite VCD chez la souris A:. Cytologie d'un frottis vaginal non coloré d'un véhicule souris injectée en évidence les quatre étapes du cycle oestral: 1) proestrus, principalement constitué de cellules épithéliales nucléées 2) oestrus, caractérisé par l'ONU -nucléé cellules cornées; 3) metestrus, constitué de cellules nucléées épithéliales (flèches), les cellules épithéliales cornées non nucléées (flèches), et des leucocytes; 4) diestrus, composé principalement de leucocytes; et B:. Durée moyenne (en jours) du cycle œstral de véhicule et groupes de VCD à injection. Un cycle est mesurée à partir du premier jour de l'oestrus dans le premier jour de la prochaine période de l'oestrus. Cytologie vaginale a commencé environ 6 semaines après le début des injections. Les cycles d'oestrus des animaux VCD injection deviennent irrégulières, par rapport à l'animal de véhicule à injections, et après des cycles de 12 oestrus, la cytologie de tous VCD injecté animaux plus indiqué cyclisme C:. coloration H & E de tissu ovarien à 8 mois d'âge. Sections faites à une épaisseur de 5 um pour véhicule traités (à gauche) et VCD traité (panneau de droite) souris à 20X (en haut) et 200X (panneau inférieur) grossissement. Tissu ovarien à 200X montre un certain nombre de follicules en véhicule par rapport à des souris VCD traité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Des performances de la roue de la cage volontaire dans des souris femelles C57BL/6J VCD traité véhicule ou. Panneau de gauche: la distance moyenne de course (km /jour) pour chaque période de 1 semaine au cours de la période d'étude de 4 semaines panneau moyen:. temps de fonctionnement moyen (h / jour) pour chaque période de 1 semaine au cours de la période d'étude de 4 semaines panneau de droite:. vitesse de course moyenne (km / h) pour chaque 1 période d'une semaine au cours de la période d'étude de 4 semaines. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Roue cage volontaire et la performance du tapis dans le véhicule et souris VCD traité. A: (panneau supérieur) C57BL / 6 fonctionnement moyenne Distance (km / jour) et le temps passé sur la roue (heures / jour) pour chaque 24 heures au cours de la période d'étude de 4 semaines. (Panneau inférieur) et #160, la distance moyenne B6C3F1 de course (km / jour) et le temps passé sur la roue (h / jour) pour chaque 24 heures au cours de la période 4 semaines d'étude B: C57BL / 6 paramètres de tapis roulant.. Temps maximum (panneau supérieur) et la vitesse maximale (Groupe Botoom) utilisant les protocoles décrits dans la section des méthodes.

Discussion

La fois l'exercice de la roue de la cage et tapis roulant régimes d'exercice ont été utilisés dans nos études précédentes ^16,21,22. Tous les animaux sont maintenus dans des salles de sport dédiés à minimiser les perturbations environnementales ou humaines. Toute perturbation des animaux de rythme biologique peut affecter de manière significative les animaux de la performance de l'exercice. Par conséquent, l'ensemble de soins des animaux, suivi de la performance et de l'enregistrement, et les régimes d'exercice doit être réalisé dans le même laps de temps tous les jours. Les enquêteurs devraient s'efforcer d'éviter un stress supplémentaire pour les animaux en exposant des précautions telles que la limitation de la durée d'exposition au stress et couvrant les cages, le cas échéant.

exercice de la roue de la cage

Lors de la préparation de l'appareil de la roue de la cage, la roue doit être facilement accessible pour la souris pour monter et sortir. Il devrait y avoir un minimum de litière au fond de la cage pour empêcher les souris de nicher autour de la roue et d'entraver fréquencemouvement e de roue. Le capteur magnétique a été placé sur la partie fixe de la roue et l'aimant solidaire de la roue libre, de manière à compter chaque rotation de la roue en tant que la souris exercé. Dispositif d'enregistrement attaché à la sonde magnétique doit être placé au-dessus du couvercle métallique de la cage, et tous les fils exposés doivent être soit collé ou maintenu hors de portée à partir des souris, de manière à fournir une barrière contre les dommages à mâcher. Les capteurs magnétiques et magnétiques ont également été enregistrées pour les structures appropriées pour prévenir les dommages et les mouvements indésirables. Lors de la collecte quotidienne de données, tous les fils scellés doivent être étroitement contrôlés pour assurer les fils restent intacts et devraient être retaped que nécessaire. Comme il peut nécessiter plusieurs jours pour les souris de s'acclimater à leur nouvel environnement et commencent l'exercice régulièrement, l'enregistrement des données doit être adaptée à chaque animal. Bien que les animaux ont tendance à passer beaucoup h sur la roue, la plupart de la course se produit la nuit. Par conséquent, certains animaux peuvent révéler higl'activité de la performance de h même si elles semblent dormants pendant la journée. En outre, il n'est pas rare que certains animaux vont présenter limitée roue cage fonctionnement. En règle générale, l'activité de la roue de la cage qui équivaut à une moyenne de 1 km / jour ou moins est le résultat de l'activité de cage aléatoire et n'est associé à aucun stimulus de fonctionnement important. Par conséquent, les animaux dont les paramètres de fonctionnement sont à 1 km / jour ou 1 h / jour ou moins doivent être exclues dans les dernières nonrunners d'analyse de données.

Selon les besoins spécifiques d'une étude individuelle et souches de souris concernés, la durée de l'exercice peut être modifié. Notre étude précédente a montré que pour les deux souches de souris en cause, les vitesses des roues-course moyenne et la durée de l'exercice sur la roue de la cage progressivement augmenté au fil du temps et atteint un plateau de 4 semaines.

roue de la cage course est un type d'exercice volontaire dans des modèles animaux, qui est généralement considérée comme étant effectuée dans des conditions moins stressantes. Indike tapis roulant exercice dans lequel certains paramètres peuvent être présélectionnées, le tout exécuté dans la cage de test est volontaire et facilement affecté par des signaux environnementaux ou comportementaux. Par conséquent, les comparaisons entre les différents paramètres expérimentaux sont généralement évités moins grand nombre de groupes expérimentaux sont utilisés. D'autres domaines potentiels de la recherche qui peuvent bénéficier de ce type d'exercice paradigme des études qui intègrent les réponses comportementales avec des conséquences physiologiques tels que la neuroscience cognitive. Pour les études utilisant le paradigme de la roue de la cage volontaire, les étapes les plus critiques sont la cage en place et le suivi des activités de l'exercice.

Exercice sur tapis roulant

étapes d'acclimatation sont nécessaires pour préparer les animaux pour le protocole d'effort sur tapis roulant. En fonction de l'objectif spécifique de l'étude individuelle, la durée de la période d'acclimatation peut varier. Dans cette étude, une période d'une semaine a été choisie pour permettre aux animaux de acclimmangé à l'appareil de tapis roulant et le bruit du moteur dans la cage, réchauffer périodes sont une étape importante du régime de la formation de l'exercice. Similaires à leurs homologues humains, la souris doit être réchauffé avant d'entrer dans des schémas d'exercice intensif pour éviter les blessures et les objets de données potentielles. Dans cette étude, nous avons commencé la bande à la vitesse la plus faible possible (4 m / min) avec les grilles de choc éteints pendant 15 min. Toutes les souris concernées ont commencé à courir sur et en dehors de la ceinture. Les grilles de choc ont ensuite été mis en marche et la vitesse de la courroie maintenue à 4 m / min. Pour éviter de trop insister sur les souris, nous avons mis le choc électrique à un niveau léger (1 Hz). En quelques jours, toutes les souris adaptées à la courroie de tapis de course.

La durée de fonctionnement ainsi que l'accélération peuvent également être adaptées à chaque modèle expérimental. Un taux d'accélération initiale recommandée est de 1 m / min. Les voies de tapis roulant de souris présentant des signes d'épuisement doivent être éteints immédiatement. Typiquement des signes d'épuisement exposés par kmCE sur le tapis roulant sont les suivants:

1. L'exposition continue à la grille de choc pour> 5-10 sec,
2. Perte de courir capacité résultant en état de choc grille exposition> 5x pendant un seul régime d'exercice, et
3. Perte de courir capacité résultant en état de choc exposition de grille> 2 sec au moins 3x au cours d'une seule régime d'exercice.

Les valeurs indiquées ci-dessus doivent être utilisés principalement comme des lignes directrices pour une expérience spécifique. Ces paramètres doivent être déterminés pour chaque protocole d'exercice car il varie de la souche de souris à souche de souris, une expérience à l', et un enquêteur à.

Contrairement à l'exercice de la roue de la cage, des études de tapis roulant doit être répété plusieurs fois pour éliminer les effets des facteurs environnementaux et biologiques sur l'exécution de la performance. Il n'est pas rare de voir des fluctuations dans la gestion de la performance entre les tests pour un même animal. Comme chaque régime d'exercice expose l'exécution des souris à un streart, un intervalle de repos approprié entre les tests est nécessaire. Dans notre expérience, 2-3 jours période de repos entre chaque test était suffisant pour les souris pour récupérer.

Comme tapis roulant humaine exercice, la vitesse de l'exercice d'endurance est mieux déterminée par la fréquence cardiaque ou de la saturation en oxygène du sang, un exploit techniquement difficile avec des études de souris. L'étape la plus critique des études de tapis roulant est la détermination de l'épuisement, qui varie généralement entre souris individuelles, et a été défini comme 80% de la vitesse maximale. Dans notre propre expérience de l'enregistrement des résultats peut significativement différente entre les chercheurs individuels, étant donné que les critères de l'épuisement sont principalement subjective. Ainsi, l'application uniforme des mêmes critères lors de l'enregistrement est essentiel.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma	V-3630
11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface	Petsmart	model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport	model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments	model 1055SDRM