Метод изучения влияния химически индуцированного угасание функции яичников на толерантность к физической нагрузке и кардиохирургии адаптации у мышей

Резюме

Два упражнения парадигмы были протестированы на недавно разработанной химически индуцированного модели менопаузы мыши, чтобы изучить влияние менопаузы на толерантность к физической нагрузке и сердечной адаптации осуществлять.

Аннотация

Риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) возрастает в период после менопаузы женщины, тем не менее, роль физических упражнений, в качестве превентивной меры для риска ССЗ в период после менопаузы женщины не были должным образом изучены. Соответственно, мы исследовали влияние добровольного клетку колеса упражнения и принудительного беговой дорожке упражнения на сердечной адаптации в период менопаузы мышей. Наиболее часто используемый индуцибельный модель для имитации менопаузы у женщин является овариэктомии (OVX) грызунов. Однако модель OVX имеет несколько несходства от менопаузы в организме человека. В этом исследовании, мы вводили 4-винилциклогексен диэпоксида (VCD) самкам мышей, что ускоряет яичников как альтернативную модель менопаузы для изучения влияния физических упражнений на менопаузы мышей. VCD избирательно ускоряет потерю первичных и примордиальных фолликулов, что приводит к эндокринным государства, тесно имитирует естественное развитие от предварительно в пери-пост-менопаузы в организме человека. Чтобы определить влияние физических упражнений на упражненияЕмкость и сердечной адаптации в VCD обработанных самок мышей, были использованы два метода. Во-первых, мы подвержены группу VCD-обработанных и необработанных мышей к добровольному клетке колеса. Во-вторых, мы использовали принудительный бегущей дорожке, чтобы определить переносимость физических нагрузок в отдельную группу VCD-обработанных и необработанных мышей измеренных как терпимость осуществлять интенсивность и выносливость.

Введение

Естественное начало менопаузы характеризуется истощением яичников примордиальных фолликулов через атрезии, в конечном итоге приводит к яичников старения. В Соединенных Штатах, более 30% жизни женской будут потрачены в постменопаузе. В ответ на снижение функции яичников, несколько физиологические и психологические последствия могут возникнуть, в том числе повышенной ожирения, сосудистой нестабильностью и настроения или нарушения сна. Из-за повышенного ожирения / ожирением по сравнению с пременопаузе коллегами ^1,2, у женщин в постменопаузе, особенно более восприимчивы к развитию метаболического синдрома и связанных сопутствующих заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) ^3. Кроме того, становится все более очевидным, что успешное сердечной реабилитации для пациентов с сердечно-сосудистых заболеваний включает в себя регулярные аэробные упражнения, и что физические упражнения снижают сердечно-сосудистую заболеваемость и смертность по этим предметам ^4,5. Тем не менее, как толерантность к физической нагрузке чаНГРЭС в ходе предварительного пост-менопаузы не были хорошо изучены. Что еще более важно, роль физических упражнений в качестве превентивной меры для риска ССЗ в период после менопаузы женщины остается удивительно изученной.

Наиболее часто используемый индуцибельный модель для имитации менопаузы у женщин является овариэктомии (OVX) грызунов. В последнее время профессиональная химическая 4-винилциклогексен диэпоксид (VCD) было показано, в частности, целью маленькие первичные и первичные фолликулов, ускоряя естественный процесс атрезии, в конечном счете, приводит к недостаточности яичников без очевидных токсичности, найденного в других тканях ^6. Цикл течки у VCD мышей, обработанных, которая аналогична человеческой менструального цикла, прекращается в течение 2-3 месяцев после завершения VCD инъекций, которые в свою очередь приводит к постепенному выводу эстрогенов, имитируя пригородных чтобы постменопаузе переход. Таким образом, фолликул-разрушающим, яичников-нетронутыми животных близко приближается естественный человекапрогрессирование через предварительно в пери-пост-менопаузы ^7-9. Кроме того, она обеспечивает нехирургических альтернатива модели OVX восстановительной хирургии осложнений, таких как инфекции. В этом исследовании мы использовали VCD-индуцированной менопаузы мышей для изучения влияния физических упражнений на сердечную адаптации в период менопаузы мышей.

Есть несколько случаев, которые позволяют предположить, связь между эстрогеном и клетка колеса упражнения у грызунов обоих полов ^10-13. Эстроген истощение хирургическим OVX уменьшается добровольным мероприятием активность у мышей и крыс ^14,15. Два способа осуществления были использованы в этом исследовании, чтобы проверить способность упражнений VCD-индуцированных менопаузы мышей. Кейдж колесо, идущее как правило, рассматривается как один из видов добровольного упражнения на животных моделях и осуществляется, по-видимому, в менее стрессовых условиях. Однако, клетка колесо, идущее не свидетельствует об относительной толерантности к физической нагрузке животных, что требует животных тестироватьсяЮ-В гораздо более высокий уровень. Принудительное бегущей дорожке, был использован для определения физической нагрузки, измеряемое как терпимость осуществлять интенсивность и выносливость. Кроме того, мы уже показали, что клетка колесо упражнение дает стимул для гипертрофии сердца, и это гипертрофическая рост секс-зависимых ^16. Таким образом, мы также измерили сердечный адаптацию к клетке колеса упражнение в VCD-индуцированных менопаузы мышей.

протокол

Все эксперименты, жилье и уход за животными проводили с использованием протоколов, прилипшие к руководящим принципам и утвержденные Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете Аризоны на, и в 2011 NIH принципов для ухода и использования лабораторных животных.

1. Лечение с 4-винилциклогексен диэпоксид

1. Протокол дозирования VCD: В химическом вытяжном шкафу, добавить 0,587 мл VCD в чистую колбу, довести до конечного объема 10 мл кунжутного масла, а затем взболтайте ее нежно, крышку и печать с парафильмом. Переносят раствор в пробирку дозирования, запечатать его с Parafilm, и хранить при 4 ° С в течение 7 дней. Убедитесь, что все реагенты являются стерильными.
   1. Использование кунжутное масло в качестве контроля транспортного средства, VCD растворяют в кунжутном масле. Магазин VCD (MW = 140,2 г / моль, плотность = 1,09 г / мл) при -20 ° С.
   2. Протокол впрыска VCD: В 2-месячного возраста, взвесить и управлять ежедневные внутрибрюшинные инъекции комнатной нравратура VCD в дозе 160 мг / кг в течение 20 последовательных дней. Введите контрольных мышей таким же образом с раствором транспортного средства, кунжутное масло, в объеме 2,5 мл / кг.
      Примечание: В период впрыска, попробуйте чередовать участки инъекции, чтобы уменьшить шансы на местной инфекции. Используйте следующее уравнение для вычисления объема, необходимого для инъекций: вес тела (г) х кг / 1000 GX 2.5 мл / кг = объем (мл) раствора для введения в результате чего около 50 мл / инъекции с использованием 27 г иглы. Из-за размера иглы местные анестетики не нужны.
   3. Мониторинг эстрального цикла: После того, как период впрыска завершена, мониторинг эстрального цикла ежедневно получения влагалищных мазков. Сдерживать мышей с помощью метода тыльной шкирку. Вставка пипетку с 0,2 мл стерильного физиологического раствора в влагалище на глубину 0,5 см. Растирают физиологический раствор (3x) и поместите 1 каплю на пустой слайд. Сразу же оцените образцы под микроскопом, используя стандартный свет MicroscОПЕ на 100X величины.
      Примечание:. Вагинальный цитология решимости обеспечить потерю велосипеде, и поэтому проверить яичников 2А иллюстрирует типичную влагалища цитологию через разные фазы эстрального цикла у мышей, а именно проэструса течки, metestrus, диэструса ^17-19. Во проэструса клетки включают ядросодержащие эпителиальные клетки (рис. 2, стрелки указывают ядерных клеток); во время течки, клетки преимущественно ороговевших клеток плоского эпителия; Metestrus характеризуется сочетанием типов клеток, с преобладанием лейкоцитов; Диэструса преобладают лейкоцитов. Регулировка фокальной плоскости могут потребоваться для визуализации клеток и ядер по всему образцу. Как показано на фиг.2В, типичный цикл течки мышиный 4-5 дней. Мыши считаются ациклические после 15 дней подряд в упорной диэструса. Непрерывный мониторинг эстрального циклов на протяжении всего исследования виод, чтобы подтвердить отсутствие эстрального циклов в VCD мышами.

2. Добровольное Кейдж колеса Упражнение

Инбредные C57BL / 6 и B6C3F1 самок мышей в возрасте 7 месяцев, подвергаются добровольной клетка колесном ходу. Дом животные индивидуально в клетке (47 см х 26 см х 14,5 см) с неизрасходованного доступа к клетке колесо в течение 28 дней.

1. Установка оборудования: Клетка колеса Прибор состоит из диаметра колеса 11,5 см с 5,0 см в ширину, работающих поверхность, оснащенный цифровой магнитной счетчика, который активируется при вращении колеса. Перед каждым колесном ходу проверки, калибровки клетку колесо в соответствии с директивами изготовителя. Измерить внутренний диаметр ходового колеса, вычисления периметра и ввести это значение в качестве цифрового счетчика размера колеса.
   1. Прикрепите компьютер части цифровой магнитной счетчика на кольцевом стенде с помощью ленты.
   2. Прикрепите порт компьютераионный цифрового магнитного счетчика на кольцевом стенде с помощью ленты.
   3. Установите свободный магнит цифровой магнитной счетчика к центральной панели на той же стороне, что и магнит кабелем к компьютеру, снова лентой достаточно, чтобы защитить магнит от жевательной повреждения. Магниты должны быть расположены так, что каждый вращение колеса записывается на компьютере без какого-либо вмешательства или сопротивления, чтобы завершить вращение колеса.
      Примечание: Клейкая лента успешно используется для крепления компонентов цифровой магнитной счетчика к ходового колеса. Обмотка должна быть достаточной, чтобы полностью покрыть магнит и предотвратить повреждение от жевания животным. Магнит должен быть расположен как можно ближе к колесу, не препятствуя его движение. Тем не менее, установка должна ежедневно проверяться для жевания повреждения и отремонтировать, если необходимо.
   4. Установите колесо в клетку, сдвинув колесо стоять через верхний проводки животного клетке. Закрепите колеса стенд тон клетку проводки с зажимы.
      Примечание: зажим должен быть на верхней части проводки, от животного. Поток компьютерную часть и лишний кабель через проводки клетки. Размещайте компьютер и лишний кабель вне досягаемости животного. Это может быть достигнуто путем размещения средних пластик весят блюдо в верхней части проводки клетке держать компьютер и лишний кабель.
2. Упражнение: Для данного помета, случайно назначить мышей или к сидячей управления или осуществлять режим. Дайте все животные воду и стандартный жесткий грызунов чау вволю.
   1. Вручную записывать ежедневные значения для расстояния РАН (км / день) и общее время, потраченное на работу (ч / день), заданной магнитной счетчика. Расстояние и время записи значения в пределах одного 1 часа времени каждый день для точных и последовательных значений по всей продолжительности 28-дневного периода упражнений. Ясно (ноль) магнитное счетчик после записи каждого дня для обеспечения точности показаний последующейING день.
   2. Подсчитать средние значения расстояния и скорости для каждой группы. Рассчитать частоту в зависимости от заданных значений расстояния и времени каждый день для каждой мыши. Данные могут отображаться как ежедневно или еженедельно в среднем для каждого измеряемого параметра.
3. Урожай ткани: В конце определенного периода тренировки, эвтаназии и осуществляется сидячий контрольных животных в течение 30 мин удаления от клеток путем смещени шейных позвонков при вдыхании анестезии. Взвесьте массы тела и быстро акцизные сердца, скелетных мышц и яичники.
   1. На момент сбора ткани, монтировать и окрасить собранные яичники с hemotoxylin и эозином (H &E; рис. 2С). Под микроскопом, рассчитывать и классифицировать фолликулы как изначальной, начального, среднего или антраля для каждого VCD обращению и контролировать животного ^20. Примордиальный фолликул содержит небольшое начальное яйцеклетки, один слой плоских или плоскоклеточного клеток гранулезы тесно отличие от яйцеклетки, и базальнуюпластинка. Первичный фолликул определяется наличием одного или нескольких кубических зернистых клетках, которые расположены в одном слое, окружающем ооцит. Вторичный фолликул содержит клетки гранулезы, которые образуют несколько слоев вокруг яйцеклетки, и Тека. Антральных фолликулов характеризуется полости антрума или "", содержащий жидкость.
   2. Чтобы вырезать сердце, сделать медиальной разрез на брюшной стороне и визуализировать сердце после открытия диафрагмы. Быстро вырезать сердце у основания и места в холодном забуференном фосфатом физиологическом растворе в достаточной степени вымывания остаточного желудочка крови. Обрежьте сердце избыточной ткани, взвесить сердце и оснастки заморозить в жидком азоте.
   3. Промыть все другие изолированных тканей с модифицированным ледяной фосфатным буфером физиологический раствор (PBS), и оснастки замораживание в изопентана охлаждают в жидком азоте.

3. Принудительное Беговая дорожка Упражнение

1. При использовании принудительного упражнения парадигмы то измерить толерантность к физической нагрузке, используйте беговую дорожку и настроить следующим образом:
   1. Поставьте поражения электрическим током сетки на базе беговой дорожки рампы. Эта ударная генерируется служит стимулом для физических упражнений. Интенсивность и частота электрических стимулов управляются вручную пользователями. Сетки могут быть включены или выключены для каждой полосы. Все сбора данных производится вручную.
   2. Периодически калибровки беговую дорожку в соответствии с директивами изготовителя.
      1. Убедитесь, что передняя панель переключения Беговая дорожка контроллер установлен в положение "STOP".
      2. Датчик Место скорость на беговой дорожке lane1 ремня и надежно закрепить гайкой в ​​положение, показанное ниже.
      3. Использование колеса на передней панели Беговая дорожка контроллер, регулировать скорость до 88,7 м / мин Затем установите частота электрического стимула до 2 Гц на Беговая дорожка контроллер передней панели.
      4. Нажмите кнопку "ОДОМЕТР Reset" для инициализации процедуры калибровки.
         Примечание: сидячий или nonexercise контрольные группы должны быть включены в экспериментальной конструкции. Сидячий группа возраст согласован с групповых упражнениях. Ранее нами было показано, что жилье оседлые мышей индивидуально в клетках одинакового размера к осуществляемой мышей не влияют на параметры, представляющие интерес по сравнению с оседлыми мышей, размещенных с братьями и сестрами. Таким образом, сидячие Мышей содержали с братьями и сестрами в одной комнате с осуществляемой мышей.
2. Акклиматизация: Акклиматизироваться мышей к беговой дорожке 3-7 дней до эксперимента ежедневно. Чтобы сделать это, место мышей в беговой дорожки ленточных неподвижных и ударных сеток прочь, но с поясом двигателя на (шума). Оставьте мышей нетронутыми, по крайней мере 15 мин.
3. Разминка: Разминка шаги, используемые в настоящем протоколе являются:
   1. Место каждого мышь на беговой дорожке. Отключение ударной сетку и увеличить скорость ленты до 4 м / мин в течение 15 мин.
   2. Включить ударную сетку и поддерживать скорость движения ленты в4 скорость ленты м / мин в течение дополнительных 10 мин.
4. Упражнение учебные схемы
   1. После разминки, держать ударные сетки на и увеличить скорость движения ленты до 5 м / мин в течение 15 мин.
   2. Увеличение скорости ленты до 15 м / мин в течение 15 мин.
   3. После обучения, передачи мышей обратно в их клетках.
      Примечание: В этом исследовании, осуществлять подготовку проводили ежедневно в течение 1 недели.
   4. Острая режим упражнений: острая режим упражнений предназначен для определения краткосрочных и долгосрочных последствий чрезвычайной физической нагрузке.
      1. После разминки, увеличить скорость движения ленты от 5 м / мин до 10, 15, 20, 25, и 30 м / мин в 10-минутные интервалы.
         Примечание: Завершить упражнение, если мыши не в состоянии продолжать работу или проявлять признаки истощения или бедствия. В нашем исследовании, большинство животных были остановлены на 25 м / мин, и ни одно животное не прошли 30 м / мин этапе.
      2. Проверьте каждую мышь три раза, что позволяет за 2-3 дня между каждым испытанием. Рассчитать средние значения по всей ExerСиз сессии для каждой мыши.
   5. Режим упражнений на выносливость: Протокол упражнения на выносливость предназначен для обучения мышей в течение длительного пребывания на беговой дорожке упражнения стимула. Этот тип протокола проверяет способность переносить долгосрочные эффекты умеренного физической нагрузке.
      1. Начните с скорости ленты, намеченным в ходе период разогрева, 4 м / мин.
      2. Постепенно увеличивайте скорость ленты на 1m/min до окончательного скоростью 20 м / мин достигается. Общая продолжительность типичного протокола исследования составляет 50 мин.
      3. После физических упражнений режима, передавать мышей обратно в их клетках.
         Примечание: Запуск мышей до изнеможения избежать. Если в любой момент во время эксперимента мыши показывает признаки истощения, отключить ударную сетку и позволить мышь, чтобы отдохнуть и восстановиться.

4. Данные и статистический анализ

1. Представить результаты как среднее ± SEM и использовать 2-полосная ANOVA (лечение группу и ехеrcise в качестве основных факторов), а затем Студент-Ньюмена Keuls постфактум теста или студента т тест, чтобы сравнить различия между средними значениями.
2. Определить процентное изменение массы сердца при физической нагрузке, сравнивая массу каждого животного, осуществляемой в средней сердечной массы оседлых группы. Разница в сердечной массы затем выражается как процентное изменение от оседлых животных для каждого соответствующего животного. р значения <0,05 считают статистически значимым.

Результаты

Типичный экспериментальный протокол, такой как используется в данном исследовании, показана на рисунке 1. После 20 последовательных дней лечения VCD, вагинального цитологического был использован для определения наличия или отсутствия цикличности в VCD впрыском мышей; также мониторинг транспортных средств с впрыском мышей. Этап цикла течки определяли по доли эпителиальных клеток, ороговевших эпителиальных клеток, лейкоцитов и в вагинальных мазках (рис. 2а). Наличие только ороговевших эпителиальных клеток указано мышь была в течке, и, следовательно, по-прежнему на велосипеде. Цикл течки у мышей обычно длится 4 дня, поэтому VCD вводят животные считались ациклические после 15 дней упорной диэструса, в котором вагинальный цитология выявленных большинство лейкоцитов (рис. 2A). Цикл течки у VCD мышей, обработанных стали нерегулярными, а затем перестала в течение 2-3 месяцев после начала VCD инъекций (рис. 2В) . VCD ткани яичников показали значительное атрофию, по сравнению с контрольной группой. В большом увеличении, мы видим полное истощение первичных и примордиальных фолликулов (рис. 2в).

Чтобы проверить эффект VCD-индуцированной яичников на физической работоспособности, мы случайным образом 7 месяцев VCD-и автомобилей, обработанных мышей (два штамма, C57BL / 6 и B6C3F1) либо сидячий или клетка колесные упражнения группы 4-6 недель после прекращение велосипеде (рис. 1). Ежедневные значения упражнения были записаны для времени и расстояния для каждого осуществляемого животного в течение всего 4-недельного периода упражнений. Еженедельные средние суточных значений баллотироваться на расстояние, время и скорость показаны на рисунке 3 для C57BL / 6 мышей, получавших транспортного средства или VCD. Мы не видели существенных различий в физической работоспособности, измеренных среднесуточная времени, расстояния и скорости на клетке колесе между VCD-и обработанных носителем групп в любом C57BL / 6 или B6C3F1 мышиштамм (рис. 4А). Рассчитанные колесные хода скорости постепенно увеличивается в течение 4-недельного периода действия, приведенным ранее ^16, но существенно не различались между экспериментальными группами. Эти исследования показывают, воздействие VCD-индуцированной яичников на добровольной клетка колеса упражнения превосходит по крайней мере 2 линий мышей.

После продолжительности протокола добровольного клетка колеса упражнений, морфометрии тела регистрировали и сердца быстро вырезали и взвешивали. Ранее мы показали, что добровольная клетка колесо упражнение вызывает увеличение массы сердца ^16. Здесь мы также показывают гипертрофию сердца в ответ на клетку колеса упражнения измеряется абсолютной массы сердца (HW) и HW нормированной на длины голени (TL) (табл. 1). Абсолютная масса сердца и отношение HW / TL были значительно больше в автомобиле-и VCD-обработанных мышей по сравнению с оседлыми коллегами. Тем не менее, не было measuРабле различия в гипертрофии сердца между контролем и VCD-индуцированной яичников мышей отказа следующего добровольного клетку колеса упражнения.

Далее, мы использовали непроизвольное (принудительное) беговой дорожке, чтобы определить переносимость физических нагрузок. Мы сначала подвергают мышей с протоколом высокой интенсивности, что не повышенным Средняя скорость ступенчатой ​​каждые 10 мин до изнеможения. В среднем, максимальная скорость транспортного средства мышей, обработанных составил 26,7 ± 0,95 м / мин и максимальная скорость VCD лечить мышей был 28 ± 1,4 м / мин до изнеможения. Мы использовали низкой интенсивности, работающий на 20 м / мин (около 80% от максимального) для анализа на выносливость. Как показано на рисунке 4В, никаких существенных различий в высоком или низком физической нагрузки интенсивность не было найдено между транспортным средством и VCD группе, получавшей, указывая, что VCD-индуцированной яичников не было никакого влияния на мыши толерантность к физической нагрузке.

В заключение, менопауза, индуцированный лечения VCD не имеет никакого влияния на либо добровольного или принудительного г unning мощность, а также сердечная адаптивный ответ, чтобы тренироваться.

Рисунок 1. VCD введение и экспериментальный протокол. Мышам вводили VCD (160 мг / кг) или кунжутное масло (контрольный носитель), начиная с 2-месячного возраста в течение 20 последовательных дней. После VCD или транспортных средств инъекций, контролировались эстральных циклов и цикличности определяли, как описано в разделе Методы. Потеря функции яичников произошло в течение 60-90 дней и было подтверждено на цитологию эпителия влагалища. В возрасте 7 месяцев, мыши подвергались воздействию добровольного клетку колеса упражнения в течение 4 недель или подвергнуты протокола упражнений беговой дорожке.

oad/51083/51083fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51083/51083fig2.jpg "/>
. Рисунок 2 VCD-индуцированной угасание функции яичников у мышей:. Цитологии из неокрашенных вагинального мазка из транспортного средства введенного мыши демонстрируя четыре стадии эстрального цикла: 1) proestrous, преимущественно состоящий из ядросодержащих эпителиальных клеток 2) Эструс, характеризуется ООН -зарождаться ороговевших клеток; 3) metestrus, состоящий из ядросодержащих эпителиальных клеток (стрелки), снимите дросодержащих ороговевших эпителиальных клеток (стрелки), и лейкоцитов; 4) диэструс, состоящий в основном из лейкоцитов; и В:. Средняя длина (дней) эстрального цикла автомобиля-и VCD впрыском групп. Один цикл измеряется с первого дня в течки в первый день следующего периода в период течки. Вагинальный цитология начал примерно в 6 недель после начала инъекций. В эстральных циклы VCD впрыском животных становятся нерегулярными, по сравнению с автомобиля с впрыском животногоне с, и после циклов 12 течки, цитология всего VCD вводили животным уже не указано велоспорт C:. H & E окрашивание ткани яичников в возрасте 8 месяцев. Поперечные сечения сделали при толщине 5 мкм для транспортного средства обращению (левая панель) и VCD-обработке (правая панель) мышей на 20X (верхняя панель) и 200X (нижняя панель) увеличении. Ткани яичников в 200-кратное увеличение показывает ряд фолликулов в автомобиль-сравнению с VCD обработанных мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Добровольное исполнение клетка колесо в автомобиле-или VCD обращению C57Bl/6J самок мышей. Левая панель: Средний расстояние пробега (км /день) для каждого 1-недельного периода над 4-недельного периода исследования Ближний панели:. Среднее время работы (час / день) для каждого 1-недельного периода над 4-недельного периода исследования Правая панель:. Средняя скорость движения (км / ч) для каждого 1 неделя период, в течение 4-недельного периода исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Добровольное клетка колесо и производительность беговой дорожке в автомобиле-и VCD-обработанных мышей. : (Верхняя панель) C57BL / 6 расстояния среднем пробег (км / день) и время, проведенное на колесе (ч. / день) для каждого 24 часов над 4-недельного периода исследования. (Нижняя панель) & #160; B6C3F1 среднее расстояние пробег (км / день) и время, проведенное на колесе (час / день) для каждого 24 часов над 4 недельного периода исследования B: C57BL / 6 беговой дорожке параметров.. Максимальное время (Верхняя панель) и максимальная скорость (Botoom панель) с использованием протоколов, описанные в разделе методов.

Обсуждение

Оба клетка колесо упражнения и беговой дорожке режимы тренировки были использованы в наших предыдущих исследованиях ^16,21,22. Все животные содержатся в специальных тренажерных залах, чтобы минимизировать экологические или человека нарушения. Любое нарушение животных биологического ритма может существенно повлиять животных физической работоспособности. Таким образом, вся по уходу за животными, мониторинга производительности и запись, и осуществлять схемы должно быть сделано в том же ежедневной периода времени. Следователи должны стремиться избегать дополнительную нагрузку к животным, демонстрируя меры предосторожности, такие как ограничение длительности воздействия стресса и покрытия клетки при необходимости.

Кейдж колесо упражнения

При подготовке клетка колесо аппарата, колесо должны быть легко доступны для мыши монтировать и выйти. Там должно минимально постельные принадлежности в нижней части клетки, чтобы предотвратить мышей от вложенности вокруг колеса и препятствует Freе колеса движение. Магнитный датчик был помещен на неподвижной части колеса и магнита, прикрепленного к свободного хода, чтобы считать каждый вращение колеса как мышь осуществлено. Устройство записи прикреплен к магнитному датчику должен быть размещен над проволочной крышки клетки, и все оголенные провода должны быть либо лентой или хранить в недоступном от мышей, так, чтобы обеспечить барьер против жевательной повреждения. Датчик магнит и магнитные также выявляется в соответствующие структуры, чтобы предотвратить как повреждения и нежелательного перемещения. Во время сбора ежедневной данных все записанные на пленку провода должны быть тесно проверку для гарантии провода остаются нетронутыми и должен быть retaped по мере необходимости. Так как это может потребовать несколько дней для мышей, чтобы акклиматизироваться к новым условиям и начать осуществление на регулярной основе, записи данных должны быть приспособлены к каждого отдельного животного. Хотя животные, как правило, проводят много час на колесе, большую часть хода происходит в ночное время. Таким образом, некоторые животные могут выявить HIGч деятельность производительность, даже если они появляются в спящем состоянии в дневное время. Кроме того, это не редкость, что некоторые животные будут проявлять ограниченный ход клетка колеса. Как правило, клетка колеса деятельность, которая составляет в среднем 1 км / день или меньше является результатом случайного клетке деятельности и не связаны с какой-либо значительной проточной стимула. Таким образом, животные, чьи работает параметры находятся на 1 км / день или 1 час / день или меньше, должны быть исключены в заключительных nonrunners анализа данных.

В зависимости от конкретных целей отдельного исследования и линий мышей, вовлеченных, длина осуществления могут быть изменены. Наш предыдущий исследование показало, что для обеих линий мышей, участвующих, средние колесные хода скорости и продолжительность упражнений на клетке колесо постепенно увеличивается с течением времени и плато на 4 недели.

Кейдж колесо, идущее является одним из видов добровольного упражнения на животных моделях, которые как правило, принимаются как выполняемые при менее напряженных условиях. UnlАйк на бегущей дорожке, в котором некоторые параметры могут быть заданы, все работающие в каждой клетке является добровольным и может влиять на экологические или поведенческие сигналы. Таким образом, сравнение между различными экспериментальных условиях, как правило, избегать, если не используются большие экспериментальные группы чисел. Другие потенциальные области исследований, которые могут извлечь выгоду из этого вида упражнений парадигмы исследования, которые включают поведенческие реакции с физиологическими последствиями, такими как когнитивной нейронауки. Для исследований с использованием добровольного клетку колесо парадигму, наиболее важные шаги клетка настроить и мониторинг осуществления деятельности.

Беговая дорожка упражнения

Шаги акклиматизации необходимо подготовить животных для протокола упражнений беговой дорожке. В зависимости от конкретной цели индивидуального исследования, продолжительность периода акклиматизации может варьироваться. В этом исследовании, в период одной недели был выбран, чтобы позволить животным acclimели на беговой дорожке аппарата и шум двигателя в клетке, согреть периоды являются важным шагом в упражнения тренировочный режим. Подобно человеческие аналоги, мыши должны быть разогрет прежде чем попасть в любых интенсивных схемы упражнений, чтобы избежать травм и потенциальных артефактов данных. В этом исследовании, мы начали ремень на минимальной скорости возможно (4 м / мин) с ударные сетки выключен в течение 15 мин. Все мыши, участвующие бросился бежать и выключать пояса. Ударные сетки были затем включены и скорость движения ленты поддерживали на уровне 4 м / мин. Чтобы избежать чрезмерной подчеркнув мышей мы устанавливаем электрическим током при мягким уровне (1 Гц). В течение нескольких дней, все мыши адаптированы к беговой дорожке пояса.

Продолжительность хода, а также ускорение также могут быть адаптированы к каждой экспериментальной конструкции. Рекомендуемая начальная скорость ускорение 1 м / мин. Беговая дорожка полосы мышей с признаками истощения должен быть выключен сразу. Обычно признаки истощения, проявляемые мисе на беговой дорожке являются:

1. Продолжительное воздействие ударной сетки для> 5-10 сек,
2. Потеря работает потенциала в результате ударной воздействия сетки> 5x в течение одного режим упражнений, и
3. Потеря работает потенциала в результате ударной воздействия сетки> 2 сек по крайней мере, 3x в течение одного режим упражнений.

Значения, приведенные выше, должны использоваться, прежде всего, в качестве руководящих принципов для конкретного эксперимента. Эти параметры должны быть определены для каждого протокола упражнений, как она колеблется от линии мышей, чтобы линии мышей, опыта к опыту, и следователя следователя.

В отличие клетка колеса упражнения, беговой дорожке исследования необходимо повторять несколько раз, чтобы устранить последствия экологических и биологических факторов на эксплуатационные качества. Это не редкость, чтобы увидеть колебания в управлении производительность между испытаний даже для того же животного. Так как каждый режим упражнений выставляет работает мышей к Streсс, соответствующий интервал отдыха между тестами необходимо. По нашему опыту, 2-3 дня перерывах между каждого теста было достаточно для мышей, чтобы восстановиться.

Как человеку беговой дорожке упражнения, скорость для упражнения на выносливость лучше всего определяется по ЧСС или насыщения крови кислородом, технически трудный подвиг с исследований на мышах. Наиболее важным шагом в беговой дорожке исследований является определение истощения, который обычно колеблется между отдельными мышей, и был установлен как 80% максимальной скорости. На собственном опыте запись результатов могут значительно отличаться между отдельными исследователями, так как критерии истощения в основном субъективный характер. Таким образом, последовательное применение одних и тех же критериев во время записи имеет решающее значение.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma	V-3630
11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface	Petsmart	model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport	model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments	model 1055SDRM