쥐의 운동 능력과 심장 적응에 화학적으로 유도 된 난소 실패의 영향을 연구하는 방법

요약

두 운동의 패러다임은 운동 능력과 운동 심장 적응에 폐경의 영향을 조사하기 위해 새로 개발 된 화학적으로 유도 된 폐경의 마우스 모델에서 테스트되었다.

초록

심혈관 질환의 위험 (CVD)은 폐경 후 여성의 증가, 그러나, 운동의 역할을, 폐경 후 여성의 CVD 위험에 대한 예방 조치로 충분히 연구되지 ​​않았습니다. 따라서, 우리는 자발적 케이지 륜 운동과 갱년기 생쥐의 심장 적응에 강제 디딜 방아 운동의 영향을 조사 하였다. 폐경기 여성에서 흉내 낸 대한 가장 일반적으로 사용되는 유도 모델 난소 (OVX) 설치류이다. 그러나, OVX 모델은 인간의 폐경에서 몇 상이점이있다. 이 연구에서는 폐경 생쥐에서 운동의 영향을 연구하는 다른 폐경 모델로 난소 실패를 가속화하는 암컷 생쥐에 4 - 비닐 시클로 헥센 디에 폭 사이드 (VCD)를 관리. VCD는 선택적으로 밀접에서 자연스러운 진행을 모방 내분비 상태의 결과로 기본 및 원시 난포의 손실을 가속 인간의 요정에 게시 폐경 전합니다. 운동에 대한 운동의 영향을 확인하려면용량 및 VCD 처리 된 암컷 생쥐의 심장 적응은 두 가지 방법이 사용되었다. 첫째, 우리는 자발적 케이지 휠에 VCD 처리 및 치료 생쥐의 그룹을 노출. 둘째, 우리는 강도와 지구력을 행사할 수있는 허용 오차로 측정 별도의 그룹 VCD 처리 및 치료 생쥐의 운동 능력을 결정하기 위해 강제로 러닝 머신 운동을 사용했다.

서문

폐경의 자연 발병은 결국 난소 노화의 결과로 폐쇄를 통해 난소의 원시 난포의 고갈이 특징입니다. 미국에서는 여성의 일생의 30 % 이상이 폐경을 소요됩니다. 난소 기능의 감소에 대응하여, 여러 가지 생리적, 심리적 결과는 증가 비만증, 혈관 불안정, 기분이나 수면 장애를 포함하여 발생할 수 있습니다. 때문에 폐경 대응 ^1,2에 비해 증가 된 비만 / 비만증으로, 폐경 후 여성의 심혈관 질환 (CVD) ³ 등의 대사 증후군과 관련된 동반 질환에 특히 더 취약합니다. 또한, CVD 환자에 대한 성공적인 심장 재활 정기적 인 유산소 운동을 포함하는 것이 점점 더 분명 해지고있다, 그 운동이 주제 ^4,5 심혈관 이환율과 사망률을 감소시킨다. 그러나, 어떻게 운동 능력의 차이전에 폐경 전환시 nges 잘 연구되지 ​​않았습니다. 더 중요한 것은, 폐경 후 여성의 CVD 위험에 대한 예방 조치로 운동의 역할은 매우 understudied 아르 남아있다.

폐경기 여성에서 흉내 낸 대한 가장 일반적으로 사용되는 유도 모델 난소 (OVX) 설치류이다. 최근, 산업 화학 물질 4 - 비닐 시클로 헥센 디에 폭 사이드 (VCD)는 구체적으로 궁극적으로 다른 조직 ^6에있는 명백한 독성 난소 실패의 결과로, 폐쇄의 자연적인 과정을 가속화함으로써 작은 차 및 원시 난포를 대상으로 표시되었습니다. 인간의 생리주기와 유사하다 VCD 처리 된 생쥐의 발정주기는,,, VCD 주사의 완료 후 2 ~ 3 개월 이내에 중단하는 요정에 폐경을 흉내 낸 에스트로겐의 점진적 철수의 회전 결과 전환. 따라서, 난포 고갈 난소 - 그대로 동​​물 밀접하게 자연의 인간에 근접를 통해 진행 사전에 요정에 폐경 전환 ^7-9. 더욱이, 이러한 감염과 같은 수술 합병증을 감소 OVX 모델 비수술 대안을 제공한다. 이 연구에서는 폐경 생쥐의 심장 적응에 대한 운동의 영향을 연구하기 위해 VCD 유도 폐경 마우스를 사용.

남녀의 설치류 ^10-13 에스트로겐과 케이지 휠 운동 사이의 연관을 제안 몇 가지 경우가있다. 수술 OVX에 의한 에스트로겐 결핍 생쥐와 쥐 ^{(14, 15)의} 자발적인 운동 활동을 감소시킨다. 운동의 두 가지 방법은 VCD 유도 갱년기 생쥐의 운동 능력을 테스트하기 위해이 연구에 사용 하였다. 케이지 휠 실행은 일반적으로 동물 모델에서 자발적인 운동의 한 유형으로 간주하고 덜 스트레스 조건에서, 아마도, 수행된다. 그러나 케이지 바퀴 달리기 exerci하는 동물을 필요로 동물의 상대적인 운동 능력, 보장하지 않습니다자체 훨씬 높은 수준. 강제 디딜 방아 운동은 강도와​​ 지구력을 행사할 수있는 허용 오차로 측정 운동 능력을 결정하는 데 사용되었다. 또한, 우리는 이전에 케이지 휠의 운동은 심장 비대에 대한 자극을 제공하는 것으로 나타났습니다이 비대 성장은 성별에 따라 ^16입니다. 따라서, 우리는 또한 VCD 유도 폐경 쥐 케이지 휠의 운동으로 심장 적응을 측정 하였다.

프로토콜

모든 실험, 주택, 동물에 대한 배려가 가이드 라인을 준수하고 애리조나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용 2011 년 NIH 가이드 라인 프로토콜을 사용하여 수행 하였다.

1. 4 - 비닐 시클로 헥센 디에 폭 사이드와 치료

1. VCD 투약 프로토콜 : 화학 흄 후드에서 깨끗한 플라스크에 VCD의 0.587 mL를 넣고 참기름 10 ㎖에 최종 볼륨을 일정하게하고 부드럽게 커버를 반전시켜 혼합 파라 필름으로 밀봉. , 투약 병에 솔루션을 전송 파라 필름으로 밀봉하고, 최대 7 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 모든 시약은 멸균해야합니다.
   1. VCD는 참기름에 용해 될 때 차량 제어으로 참기름을 사용한다. 저장 VCD (MW = 140.2 g / 몰, 밀도 = 1.09 g / ㎖) -20 ° C.
   2. VCD 주입 프로토콜 : 세 2 개월 째, 무게 룸 성질 매일 복강 주사를 관리20 일 연속 160 ㎎ / kg의 투여 량 ature의 VCD. 2.5 ㎖ / kg의 부피에서, 차량 용액, 참기름과 유사한 방식으로 대조군 마우스를 주입한다.
      참고 : 분사 기간 동안 로컬 감염의 가능성을 감소시키기 위해 주사 사이트를 번갈아하려고. 주입을 위해 필요한 부피를 계산하는 다음 수학 식을 사용하여 체중 (g) × kg / 1000 GX 2.5 ㎖ / kg = 27 G 바늘을 사용하여 약 50 ㎖ / 주사의 결과 주입 부피 (ml) 용액 중에서. 때문에 바늘의 크기에 국소 마취제가 필요하지 않습니다.
   3. 발정주기를 모니터링 : 분사 기간이 완료된 후, 얼룩 질을 획득하여 데일리 발정주기를 모니터링한다. 배부 목덜미 방법을 사용하여 마우스를 억제합니다. 0.5 cm의 깊이로 질구에 멸균 생리 식염수 0.2 ml의 스포이드를 삽입합니다. 식염수 (3 배)를 씹다와 빈 슬라이드에 1 방울을 배치합니다. 즉시 현미경 표준 빛 microsc를 사용하여 샘​​플을 평가100 배의 크기에 OPE.
      참고 :. 질 세포진 검사는 순환의 손실을 보장하고, 따라서 난소 실패의 유효성을 판단 그림 2A는 전형적인 질 생쥐의 발정주기의 다른 단계에서 세포 검사, 즉 발정 전기, 발정기, 발정 후기, ^17-19 발정을 보여줍니다. 발정 동안 세포는 핵 상피 세포 (그림 2A, 화살표가 핵 세포를 표시)를 포함; 발정기 동안, 세포는 주로 편평 상피 세포 각질화된다; 발정 후기는 백혈구의 우세와, 세포 유형의 혼합을 특징으로한다; 발정은 백혈구에 의해 지배된다. 초점 평면의 조절을 통하여 세포 샘플과 핵을 시각화 요구 될 수있다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 전형적인 뮤린 발정주기 4-5 일이다. 마우스는 지속적 발정에서 연속 15 일 후에 비 환식 간주됩니다. 지속적으로 당 연구의 기간에 걸쳐 발정주기를 모니터링IOD는 VCD 처리 생쥐의 발정주기의 부족을 확인합니다.

2. 자발적 케이지 륜 운동

근친 C57BL / 6 B6C3F1 암컷 생쥐, 세 7개월는 자발적 케이지 휠을 실행에 노출되어 있습니다. 이십팔일의 케이지 휠에 방해 액세스 할 수있는 케이지 (47cm X 26cm X 14.5 cm)에서 개별적으로 주택의 동물.

1. 장비 설치 : 케이지 휠 장치는 넓은 휠 회전에 의해 활성화되는 디지털 자기 카운터가 장착 표면을 실행하는 5.0 cm와 11.5 cm 직경의 바퀴로 구성되어 있습니다. 각 바퀴의 주행 테스트하기 전에, 제조업체의 지침에 따라 케이지 휠을 보정합니다. , 주행 바퀴의 내경을 측정 주위를 계산하고 휠 사이즈 등의 디지털 카운터로이 값을 입력한다.
   1. 테이프를 사용하여 휠 스탠드에 디지털 자기 카운터의 컴퓨터 부분을 연결합니다.
   2. 컴퓨터 포트에 연결테이프를 사용하여 휠 스탠드에 디지털 자기 카운터 이온.
   3. 마그넷 다시 손상을 씹는 자석을 보호하기에 충분히 테이핑, 컴퓨터에 케이블 링과 동일한면에 중앙 바에 디지털 카운터 자기의 자유 자석을 부착. 바퀴의 각 회전 바퀴 회전을 완료하기 위해 어떤 간섭이나 저항없이 컴퓨터에 의해 기록 될 수 있도록 자석이 위치해야합니다.
      참고 : 덕트 테이프 주행 륜에 디지털 카운터의 자기 요소를 연결하는 데 성공적으로 사용되어왔다. 테이핑 완전히 마그넷 커버 및 동물에서 씹는로부터 손상을 방지하기에 충분해야한다. 자석은 그것의 움직임을 방해하지 않고 휠에 가능한 한 가깝게 위치 될 것이다. 그러나, 설치가 손상을 씹는 동안 매일 모니터링하고 필요에 따라 수리해야한다.
   4. 바퀴가 동물 케이지의 상단 배선을 통해 서 밀어 케이지에 바퀴를 장착합니다. t에 휠 스탠드를 고정바인더 클립으로 그는 케이지 배선.
      참고 : 클립 멀리 동물로부터, 배선의 위에 있어야한다. 케이지의 배선을 통해 컴퓨터 부와 여분의 케이블을 공급. 동물의 손이 닿지 않는 컴퓨터와 여분의 케이블을 놓습니다. 이 중형 플라스틱 컴퓨터와 케이블을 과량 보유하는 케이지의 배선 위에 접시의 무게를 배치함으로써 달성 될 수있다.
2. 운동 : 주어진 쓰레기의 경우, 무작위로 앉아있는 컨트롤이나 운동 처방 중 하나에 마우스를 할당합니다. 모든 동물에게 물과 표준 하드 설치류 우 임의로주세요.
   1. 수동으로 자기 카운터에 의해 주어진 거리 RAN (km / 일) 및 실행 소요 된 총 시간 (시간 / 일), 매일 값을 기록한다. 같은 1 시간의 시간 프레임 내에서 기록의 거리 및 시간 값 운동 기간 28 일간의 기간에 걸쳐 정확하고 일관된 값을 매일. 클리어 (제로) 자기 카운터 후 정확한 판독에게 다음을 보장하기 위해 매일의 기록하루를 보내고.
   2. 각 그룹에 대한 거리 및 속도의 평균값을 계산한다. 각 마우스에 매일 거리와 시간의 주어진 값을 기반으로 속도를 계산합니다. 데이터는 각각의 측정 된 매개 변수로서 매일 또는 매주 평균 표시 될 수있다.
3. 조직 수확 : 특정 행사 기간의 끝에서, 흡입 마취하에 자궁 전위에 의해 케이지에서 제거 30 분 이내에 행사 및 정주 제어 동물 안락사. 신체 질량 빠르게 소비세 마음, 골격 근육 및 난소의 무게를 측정.
   1. 조직 수확시, 마운트 hemotoxylin과 에오신 (H &E; 그림 2C)로 수집 된 난소를 얼룩. 배율에서 계산하고 각 VCD 처리 및 제어 동물 ^(20)에 대한 원시, 1 차, 2 차, 또는 3 난포로 모공을 분류합니다. 원시 난포는 작은 일차 난자 밀접 난자 대향 평면화하거나 편평 과립 세포의 단일 층, 및 기초를 포함얇은. 일차 난포는 난자를 둘러싸는 단일 층 내에 배치 된 하나 이상의 입방 과립 막 세포의 존재에 의해 정의된다. 차 난포는 여러 난자의 주위에 층과 진국을 형성 과립 세포가 포함되어 있습니다. 난포 여포는 유체를 함유하는 공동 또는 "전 정부"특징이다.
   2. 마음을 절제하기 위해, 복부 측면에 중간 절개를하고 조리개를 개방 한 후 마음을 시각화. 빠르게 감기 인산염 완충 생리 식염수로 충분히 씻어 아웃 잔류 심실의 혈액에있는베이스와 장소에서 마음을 절제. 과도한 조직의 마음을 잘라 온 마음을 무게와 스냅 동결 액체 질소를.
   3. 이소 펜탄에 수정 된 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 다른 모든 절제 조직을 씻어 스냅인 동결은 액체 질소에 냉각.

3. 강제 디딜 방아 운동

1. 강제 운동 패러다임의 T를 사용하는 경우오 운동 능력을 측정, 디​​딜 방아를 사용하고 다음과 같이 설정합니다 :
   1. 디딜 방아 램프의 기지에 전기 충격 그리드를 배치합니다. 생성이 충격 운동에 대한 자극 역할을합니다. 전기 자극의 강도와 주파수는 사용자가 수동으로 제어됩니다. 그리드는 사용하거나 각 레인에 대해 개별적으로 해제 할 수 있습니다. 모든 데이터 수집은 수동으로 이루어집니다.
   2. 정기적으로, 제조업체의 지침에 따라 디딜 방아를 보정합니다.
      1. 러닝 머신 컨트롤러 전면 패널 토글는 "STOP"으로 설정되어 있는지 확인합니다.
      2. 제자리 속도의 러닝 머신 벨트 lane1에 센서는 아래의 위치에 나사 너트로 고정합니다.
      3. 러닝 머신 컨트롤러의 전면 패널에있는 다이얼을 사용하여, 88.7 m / 분으로 속도를 조정 후, 러닝 머신 컨트롤러 전면 패널에 2 Hz로 전기 자극의 주파수를 설정합니다.
      4. 보정 절차를 초기화하는 "거리계의 RESET"버튼을 누릅니다.
         참고 : 정주 또는 nonexercise 제어 그룹이 실험 설계에 포함되어야합니다. 앉아있는 그룹은 운동 그룹에 일치하는 시대입니다. 우리는 이전에 형제와 함께 보관 앉아있는 쥐에 비해 운동 마우스에 동일한 크기의 새장에 개별적으로 앉아 마우스를 사용하여 원하는 매개 변수에 영향을주지 않았다 주택을 보여 주었다. 따라서, 앉아있는 마우스는 행사 마우스와 같은 객실에있는 형제 자매를 유지했다.
2. 적응도 : 3-7 일 전에 매일 실험에 러닝 머신에 마우스를 히다. 이렇게하려면, off, 그러나 (노이즈)에 벨트 모터 벨트 움직이지 충격 그리드와 디딜 방아의 장소 마우스. 적어도 15 분 동안 방해받지 마우스를 둡니다.
3. 워밍업 다음과 같이이 프로토콜에 사용되는 단계를 따뜻하게 :
   1. 디딜 방아에 각 마우스를 놓습니다. 충격 그리드를 해제하고 15 분 동안 4m / 분에 벨트의 속도를 높일 수 있습니다.
   2. 충격 그리드를 활성화하고시 벨트의 속도를 유지추가로 10 분 동안 4m / 분의 벨트 속도.
4. 운동 훈련식이 요법
   1. 따뜻한 다음에 충격 그리드를 유지하고 15 분 동안 5m / 분에 벨트의 속도를 높일 수 있습니다.
   2. 추가로 15 분 동안 15m / 분에 벨트 속도를 높입니다.
   3. 훈련 후, 다시 자신의 새장에 마우스를 전송합니다.
      주 : 본 연구에서는 운동 훈련이 1 주 동안 매일 실시 하였다.
   4. 급성 운동 처방 : 급성 운동 처방은 극심한 운동 부하의 단기 및 장기 효과를 결정하기 위하여 설계된다.
      1. 워밍업 후, 10, 15, 20, 25에 5m / 분의 벨트 속도를 증가하고, 30m / 분을 10 분 간격으로.
         참고 : 마우스는 피로 나 고통의 실행 또는 표시 표지판을 계속 할 수없는 경우 운동을 종료합니다. 우리의 연구에서, 대부분의 동물은 25m / 분에서 중지, 어떤 동물은 30m / 분 단계를 통과하지 않았습니다.
      2. 각 시험 사이 2-3일 수 있도록 각 마우스를 세 번 테스트합니다. 모든 EXER에 걸쳐 평균값을 계산각 마우스 CISE 세션.
   5. 지구력 운동 처방 : 지구력 운동 프로토콜이 디딜 방아 운동 자극에 노출 확장을 위해 마우스를 양성하기 위해 설계되었습니다. 프로토콜이 유형의 적당한 운동 부하의 장기적인 효과를 견딜 수있는 능력을 테스트한다.
      1. 워밍업 기간, 4m / 분 동안 설명 벨트 속도로 시작합니다.
      2. 서서히 20m의 최종 속도까지 1m/min 의해 벨트 속도를 증가 / 분에 도달한다. 일반적인 연구 프로토콜의 총 비행 시간은 50 분입니다.
      3. 운동 처방 후, 다시 자신의 새장에 마우스를 전송합니다.
         참고 : 피로에 마우스를 실행하면 피할 수 있습니다. 마우스가 피로의 흔적을 보여줍니다 실험 중 어느 지점에있을 경우, 충격 그리드를 비활성화하고 마우스가 휴식하고 복구 할 수 있습니다.

4. 데이터 및 통계 분석

1. 로 현재 결과는 ± SEM을 의미하고 2 일원 분산 분석 (치료 그룹과 EXE를 사용주요 요인으로 rcise)는 학생 - 뉴먼 Keuls 사후 테스트 또는 평균 값 사이의 차이를 비교하는 학생의 t 시험 하였다.
2. 앉아있는 그룹의 평균 심장 질량 각 행사 동물의 질량을 비교하여 운동과 심장 질량 %의 변화를 확인합니다. 심장 질량의 차이는 다음 각각의 동물에 대한 앉아있는 동물의 변화율 (%)로 표시됩니다. <0.05의 P 값은 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다.

결과

이러한 본 연구에서 사용 된 것과 같은 일반적인 실험 프로토콜은,도 1에 도시되어있다. VCD 처리의 20 일 연속 다음, 질 세포학은 VCD가 주입 된 마우스에서 존재 또는 주기성의 유무를 결정하는 데 사용되었다; 차량 주입 쥐도 감시했다. 발정주기 스테이지 질 도말에서 상피 세포, 각질화 상피 세포, 백혈구의 비율 (도 2a)에 의해 결정되었다. 단 각질화 상피 세포의 존재는 마우스 발정 들어간 지시, 따라서 여전히 순환시켰다. 생쥐의 발정주기는 일반적으로 그러므로 VCD 동물이 비 환식 질 세포진 검사는 백혈구의 과반수 (그림 2A)를 공개하는 지속 발정, 15 일 이후에 고려되었다 주입 4 일을 지속. VCD 처리 된 생쥐의 발정주기가 불규칙한 된 다음 VCD 주사를 시작한다 (그림 2B) 후 2 ~ 3 개월 이내에 정지 . VCD 난소 조직 대조군에 비해 상당한 위축을 보였다. 고배율에서, 우리는 기본 및 원시 난포 (그림 2C)의 완전한 고갈을 참조하십시오.

운동 성능에 VCD에 의한 난소 실패의 효과를 테스트하기 위해, 우리는 무작위로 한 7 개월 된 VCD 및 차량 처리 된 마우스 (두 개의 변종, C57BL / 6 B6C3F1)이 앉아 또는 케이지 휠 운동 그룹 4-6주 다음 중 하나를 순환 정지 (그림 1). 매일 운동 값은 4 주 훈련 기간 동안 각 행사 동물을위한 시간과 거리를 남겼습니다. 거리, 시간, 속도에 대한 매일 실행 값의 주간 평균은 차량 또는 VCD로 처리 C57BL / 6 마우스는 그림 3에 나타낸다. 우리는 C57BL / 6 B6C3F1 마우스 하나의 VCD 및 차량 투여군 사이의 케이지 휠에 일일 평균 시간, 거리, 속도에 의해 측정 된 운동 성능에 큰 차이를 보지 않았다변형 (그림 4A). 계산 된 휠 실행 속도는 점차 이전 ^16과 같이 4 주간의 실행 기간 동안 증가하였으나, 실험 그룹 사이에 유의 한 차이가 없었다. 이러한 연구는 자발적 케이지 바퀴 운동에 VCD에 의한 난소 실패의 영향은 최소 2 마우스 종자를 초월 나타냅니다.

자발적 케이지 휠 운동 프로토콜의 지속 시간에 따라, 몸의 morphometrics 기록하고, 마음은 급속하게 절제 무게를했다. 우리는 이전에 자발적 케이지 휠의 운동은 심장 질량 ^16의 증가를 유도하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 절대 마음 중량 (HW)에 의해 측정 및 HW는 경골 길이 (TL) (표 1) 정상화 케이지 바퀴 운동에 대한 응답으로 심장 비대를 보여줍니다. 좌상 대조 물에 비해 절대 심장 질량 및 HW / TL 비율은 차량 및 VCD - 처리 된 생쥐에서 현저하게 높았다. 그러나, 압력 측정은 없었다자발적 케이지 휠 운동 다음 제어 및 VCD에 의한 난소 실패 마우스 사이 심장 비대에 rable 차이.

다음으로, 우리는 디딜 방아 운동 능력을 결정하기 위해 실행 불수의 (강제)를 사용했다. 우리가 먼저 고갈 될 때까지의 평균 속도를 단계적으로 매 10 분 증가 강도 높은 프로토콜에 쥐를 노출. 평균적으로, 차량 취급 한 마우스의 최대 속도는 26.7 ± 0.95 m / 분, VCD 취급 한 마우스의 최대 속도가 소진하기 전에 최소 28 ± 1.4 m /이었다. 우리는 내구 용량을 검정 20로 m / 분 (최대 약 80 %)를 실행하는 낮은 강도를 사용했습니다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 높은 또는 낮은 강도의 운동 능력에 유의 한 차이는 VCD 유도 난소 실패 마우스 운동 능력에 영향이 없다고 나타내는, 차량 및 VCD 처리 군 사이에서 발견되지 않았다.

결론적으로, VCD 치료에 의해 유도 된 폐경은 자발적 또는 강제 어느 연구에 영향을주지 않습니다 unning 용량뿐만 아니라 운동하는 심장 적응 응답.

그림 1. VCD - 관리 및 실험 프로토콜입니다. 마우스는 VCD 20 일 연속, 2 개월에서 시작하여 (160 ㎎ / ㎏) 또는 참기름 (차량 제어) 투여 하였다. VCD 또는 차량 주사 후, 발정주기를 모니터링하고, 방법 절에 설명 된대로 cyclicities가 결정되었다. 난소 기능의 손실 60 ~ 90 일 이내에 발생과 질 세포 검사에 의해 확인되었다. 세 7 개월, 마우스는 4 주 동안 자발적 케이지 휠 운동에 노출 된 또는 디딜 방아 운동 프로토콜을 실시.

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. 마우스 그림 2 VCD에 의한 난소 실패 :. 발정주기의 네 단계를 설명하는 차량 주입 마우스에서 흠없는 질도 말 세포 검사 : 1) proestrous, 유엔 특징으로 주로 핵 상피 세포로 구성된 2) 발정, 각질화 세포 - 핵; 핵 상피 세포 (화살표), 유엔 핵 각질화 상피 세포 (화살표), 그리고 백혈구로 구성된 3) 발정 후기,; 백혈구 주로 구성된 4) 발정; 및 B :. 차량 및 VCD 주입 그룹의 발정주기의 평균 길이 (일). 한 사이클은 발정기에있는 다음 기간의 첫 날에 발정의 첫 번째 날부터 측정됩니다. 질 세포진 검사는 주사의 발병 다음과 같은 약 육주 시작했다. VCD가 주입 된 동물의 발정주기는 차량 주입 된 동물과 비교하여, 불규칙하게. 세 8 개월 난소 조직의 H & E 염색 : S, 12 발정주기 후, 모든 VCD의 세포 검사는 자전거 C 표시 더 이상 동물을 주입하지 않습니다. 차량 처리 (왼쪽 패널) 및 20X에서 VCD 처리 (오른쪽 패널) 마우스 (상단 패널)와 200X (아래 패널) 확대를위한 5 ㎛의 두께로 수행 단면. 200X 배율에서 난소 조직이 차량에 비해 VCD 처리 마우스에있는 모낭의 수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 차량 또는 VCD 처리 C57BL/6J 암컷 생쥐의 자발적인 케이지 휠의 성능을 제공합니다. 왼쪽 패널 : 평균 주행 거리 (km /일) 4 주 연구 기간 동안 매 1 주 기간에 대한 중간 패널 :.. 평균 주행 시간 (시간 / 일) 4 주간의 연구 기간을 마우스 오른쪽 패널에 매 1 주 기간 : 평균 주행 속도 (km / hr)까지의 모든에 대한 4 주 연구 기간 동안 일주일 기간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 자발적 케이지 휠과 차량 및 VCD 처리 된 마우스에서 러닝 머신 성능을 제공합니다. A : (상단 패널) C57BL / 6 평균 주행 거리 (km / 일)와 4 주 연구 기간 동안 매 24 시간 동안 휠 (시간 / 일)에 소요되는 시간. (아래 패널) & #160; B6C3F1 평균 주행 거리 (km / 일) 및 사주 연구 기간 B에 매 24 시간 동안 바퀴 (시간 / 일)에 소요되는 시간 : C57BL / 6 디딜 방아 실행 매개 변수.. 최대 시간의 방법 섹션에서 자세히 설명 프로토콜을 사용하여 (상단 패널)와 최대 속도 (Botoom 패널).

토론

케이지 휠 운동과 디딜 방아 운동 요법을 실행하는 모두는 우리의 이전 연구 ^16,21,22에 사용되었습니다. 모든 동물은 환경이나 인간의 교란을 최소화하기 위해 전용 운동 실에 보관됩니다. 동물의 교란 운동 성능 '생물학적 리듬은 크게 동물에 영향을 줄 수 있습니다'를. 따라서, 전체 동물 관리, 성능 모니터링 및 녹화, 운동 요법 같은 매일 시간 내에 수행해야합니다. 연구자들은 스트레스 노출의 지속 시간을 제한하고 적절한 때 새장을 포함하는 등의 예방 조치를 전시하여 동물에 여분의 스트레스를 방지하기 위해 노력해야한다.

케이지 휠 운동

케이지 휠 장치를 준비 할 때 마우스를 탑재하고 종료하는, 바퀴는 쉽게 액세스 할 수 있어야합니다. 이해야 휠 주위에 중첩 및 FRE을 방해에서 마우스를 방지하기 위해 새장 바닥에서 최소한의 침구전자 휠의 움직임. 마우스 운동으로 휠의 회전 각을 계산하도록 자기 센서는 휠의 정지 부와 전륜 고정 마그넷에 넣었다. 자기 센서에 부착 된 기록 장치는 케이지의 와이어 리드 위에 위치되어야하고, 노출 된 전선이 손상 물지 대한 장벽을 제공하기 위하여, 마우스에서 녹화 또는 손이 닿지 않는 장소에 보관해야하거나 필요하다. 자석과 자기 센서도 손상 및 원치 않는 움직임을 모두 방지 할 수있는 적절한 구조를 녹화 하였다. 매일 데이터를 수집하는 동안, 모든 테이프 전선이 밀접하게 선이 그대로 유지하고 필요에 따라 retaped해야 보장하기 위해 확인해야합니다. 마우스가 새로운 환경에 순응하고 정기적으로 운동을 시작하는 것이 여러 가지 일이 필요할 수 있기 때문에, 데이터 기록은 각각의 동물에 맞게 조정해야합니다. 동물이 바퀴에 많은 시간을 소비하는 경향이 있지만, 실행의 대부분은 밤에 발생합니다. 따라서 일부 동물은 HIG를 보여줄 수 있습니다H 성능 활동들이 낮 동안 휴지 표시도. 또한, 어떤 동물이 제한 케이지 휠 실행을 나타낼 것이다 드문 일이 아니다. 일반적으로, 보통 1 KM / 일 이하로 금액 케이지 휠 활동은 임의의 케이지 활동의 결과와 의미있는 실행 자극과 관련이없는. 따라서, 그 실행 매개 변수 1km / 하루 1 시간 / 일 이하입니다 동물은 최종 데이터 분석 nonrunners에서 제외되어야한다.

개별 연구와 관련된 생쥐 균주의 특정 목적에 따라 운동의 길이는 변형 될 수있다. 우리의 이전 연구는 관련된 두 마우스 종자를 들어, 평균 휠 실행 속도와 케이지 휠 운동의 지속 시간은 시간이지나면서 점차 증가 4 주에 plateaued 것으로 나타났다.

케이지 휠 실행은 일반적으로 스트레스가 적은 조건에서 수행되는 것으로 촬영 동물 모델에서 자발적인 운동의 일종이다. UNL특정 매개 변수를 미리 설정 할 수있는 이케 디딜 방아 운동은 모든 테스트 케이지에서 실행 자발적 쉽게 환경 또는 행동 단서에 의해 영향을 받는다. 큰 실험 그룹 번호를 사용하는 경우 외에는, 다른 실험 설정 사이의 비교는 일반적으로 피할 수있다. 운동의 패러다임이 유형의 혜택을 누릴 수 있습니다 연구의 다른 잠재적 인 분야는인지 신경 과학 등의 생리 학적 결과와 행동 반응을 통합하는 연구이다. 자발적 케이지 휠 패러다임을 활용하여 연구의 경우, 가장 중요한 단계는 케이지 설정하고 운동 활동을 모니터링합니다.

디딜 방아 운동

순응 단계는 디딜 방아 운동 프로토콜에 대한 동물을 준비 할 필요가 있습니다. 개별 연구의 특정 목적에 따라, 순응 기간의 지속 기간은 다양 할 수있다. 이 연구에서, 1 주일 기간 동물 acclim 있도록 선택되었다워밍업 기간은 운동 훈련식이 요법의 중요한 단계이며, 디딜 방아 장치 케이지 모터 소음을 먹었다. 인간의 대응과 유사하게, 마우스는 부상과 잠재적 인 데이터 아티팩트를 방지하기 위해 어떤 집중적 인 운동 요법에 들어가기 전에 예열해야합니다. 충격 그리드는 15 분 동안 해제와 함께이 연구에서, 우리는 가능한 한 최저 속도 (4 M / 분)에 벨트를 시작했다. 관련된 모든 마우스에 벨트 떨어져 실행하기 시작했다. 충격 그리드는 설정하고, 벨트의 속도 / 분 4m로 유지. 과도한 스트레스 쥐를 방지하기 위해, 우리는 가벼운 수준 (1 Hz에서)에 전기 충격을 설정합니다. 몇 일 이내에, 모든 마우스는 러닝 머신 벨트에 적응.

런닝의 재생뿐만 아니라 가속 또한 각 실험 설계에 맞추어 질 수있다. 추천 시작 가속도 / 분 1m입니다. 피로의 흔적을 보여주는 마우스의 디딜 방아 차선 즉시 해제해야합니다. MI에 의해 전시 고갈의 일반적 징후다음과 디딜 방아에 CE는 다음과 같습니다

1. > 5 ~ 10 초 동안 충격 격자에 지속적으로 노출,
2. 하나의 운동 처방시 충격 그리드 노출> 배의 결과로 용량을 실행, 그리고 손실
3. 충격 그리드 노출의 결과로 능력을 실행하는 손실 하나의 운동 처방시> 2 초 이상 배.

위에 나열된 값은 주로 특정 실험에 대한 지침으로서 사용될 수있다. 이러한 매개 변수는 마우스 변형에서 조사에 마우스 변형, 실험 실험 및 조사에의 변화에​​ 따라 모든 운동 프로토콜에 대해 결정해야합니다.

케이지 휠 운동과는 달리, 트레드밀 연구 성과 실행에 대한 환경 및 생물학적 요인의 영향을 제거하기 위해 여러 번 반복해야한다. 심지어 같은 동물에 대한 시험과 주행 성능 변동을 볼 드문 일이 아니다. 각각의 운동 처방은 Stre에에 마우스를 실행 노출 때문에SS, 테스트 사이에 적절한 휴식 간격이 필요합니다. 우리의 경험에서, 각 시험 사이의 기간을 쉬고 2-3 일은 마우스는 복구에 충분했다.

인간의 디딜 방아 운동과 같은 지구력 운동의 속도는 최고 심박수 또는 혈액 산소 포화도, 마우스 연구와 기술적으로 어려운 위업에 의해 결정된다. 디딜 방아 연구의 가장 중요한 단계는 일반적으로 개별 생쥐 사이에서 변화 고갈, 결정하고, 80 %의 최대 속도로 설정했다. 피로에 대한 기준은 대부분 주관적이기 때문에 우리의 자신의 경험에서 결과의 기록은 크게 개별 연구자 사이에 다를 수 있습니다. 따라서, 촬영하는 동안 동일한 기준의 일관된 적용은 매우 중요합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma	V-3630
11.5 cm Diameter wheel with a 5.0 cm wide running surface	Petsmart	model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport	model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments	model 1055SDRM