Un metodo per studiare l'impatto delle chimicamente indotta da insufficienza ovarica sulla capacità di esercizio e adattamento cardiaca nei topi

Riepilogo

Due paradigmi di esercizio sono stati testati su un indotto chimicamente modello murino della menopausa di recente sviluppato per esaminare l'impatto della menopausa sulla capacità di esercizio e l'adattamento cardiaco per esercitare.

Abstract

Il rischio di malattia cardiovascolare (CVD) aumenta nelle donne in post-menopausa, tuttavia, il ruolo dell'esercizio fisico, come misura preventiva per il rischio di malattie cardiovascolari nelle donne in post-menopausa non è stato adeguatamente studiato. Di conseguenza, abbiamo studiato l'impatto di esercizio gabbia ruota volontario ed esercizio treadmill costretto sull'adattamento cardiaca nei topi menopausa. Il modello inducibile più comunemente usato per mimare la menopausa nelle donne è la ovariectomizzate (OVX) roditore. Tuttavia, il modello OVX ha alcune differenze da menopausa negli esseri umani. In questo studio, abbiamo somministrato 4 vinylcyclohexene diepoxide (VCD) per femmine di topo, che accelera insufficienza ovarica come modello menopausa alternativo per studiare l'impatto di esercizio fisico nei topi menopausa. VCD accelera selettivamente la perdita di follicoli primari e primordiali con un conseguente stato endocrino che imita molto attentamente la progressione naturale dal pre-peri-post-menopausa negli esseri umani. Per determinare l'impatto di esercizio su eserciziocapacità e adattamento cardiaca nei topi femmina VCD-trattati, sono stati utilizzati due metodi. In primo luogo, abbiamo esposto un gruppo di topi VCD-trattati e non trattati per una ruota gabbia volontaria. In secondo luogo, abbiamo utilizzato esercizio treadmill costretti a determinare la capacità di esercizio in un topo VCD-trattati e non trattati gruppi separati misurata come una tolleranza di esercitare l'intensità e la resistenza.

Introduzione

L'insorgenza della menopausa naturale è caratterizzato dalla deplezione dei follicoli ovarici primordiali attraverso atresia, infine, con conseguente senescenza ovarica. Negli Stati Uniti, oltre il 30% della vita delle donne sarà speso in post-menopausa. In risposta a una diminuzione della funzione ovarica, possono verificarsi diverse conseguenze fisiologiche e psicologiche, tra cui una maggiore adiposità, instabilità vascolare, e l'umore o disturbi del sonno. A causa di un aumento dell'obesità / adiposità rispetto alle controparti in premenopausa ^1,2, le donne in post-menopausa sono particolarmente più sensibili alla sindrome metabolica e comorbidità associate, comprese le malattie cardiovascolari (CVD) ^3. Inoltre, è sempre più evidente che la riabilitazione cardiaca successo per i pazienti con CVD include regolare esercizio aerobico, e che l'esercizio fisico riduce morbilità e mortalità cardiovascolare in questi soggetti ^4,5. Eppure, come la capacità di esercizio chaNGES durante la transizione pre al post-menopausa non è stato ben studiato. Ancora più importante, il ruolo dell'esercizio fisico come misura preventiva per il rischio di malattie cardiovascolari nelle donne in post-menopausa rimane notevolmente understudied.

Il modello inducibile più comunemente usato per mimare la menopausa nelle donne è la ovariectomizzate (OVX) roditore. Recentemente, la chimica 4 vinylcyclohexene diepoxide lavoro (VCD) ha mostrato di indirizzare specificamente piccoli follicoli ovarici primari e primordiali accelerando il naturale processo di atresia, infine con conseguente insufficienza ovarica con tossicità evidente trovato in altri tessuti ^6. Il ciclo estrale dei topi VCD-trattati, che è analogo a un ciclo mestruale umano, cessa entro 2-3 mesi dopo il completamento delle iniezioni VCD, che a sua volta si traduce in un graduale ritiro di estrogeni, imitando il peri-post-menopausa transizione. Così, un follicolo-impoveriscono, animali ovaio intatta avvicina molto umano naturaleprogressione attraverso la pre-peri-transizione post-menopausa ^7-9. Inoltre, fornisce un chirurgico alternativa al modello OVX ridurre complicanze da intervento chirurgico, come infezioni. In questo studio, abbiamo impiegato topi menopausa VCD-indotto a studiare l'impatto dell'esercizio sulla adattamento cardiaca nei topi menopausa.

Ci sono diversi casi che suggeriscono l'associazione tra estrogeni e l'esercizio ruota gabbia roditori di entrambi i sessi ^10-13. Deplezione degli estrogeni da OVX chirurgico riduce l'attività esercizio volontario in topi e ratti ^14,15. Due metodi di esercizio sono stati usati in questo studio per testare la capacità di esercizio di topi menopausa VCD-indotti. Ruota Cage funzionamento è generalmente considerato come un tipo di esercizio volontario in modelli animali ed eseguito, presumibilmente, in condizioni meno stressanti. Tuttavia, ruota gabbia esecuzione non è indicativa della capacità di esercizio relativa di animali, che richiede animali Supresé molto più alti livelli. Esercizio al treadmill Costretto stata utilizzata per determinare la capacità di esercizio, misurata come una tolleranza di esercitare l'intensità e la resistenza. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che l'esercizio ruota gabbia fornisce uno stimolo per l'ipertrofia cardiaca e questa crescita ipertrofica è sesso-dipendente ^16. Pertanto, abbiamo anche misurato adattamento cardiaco per l'esercizio ruota gabbia in topi menopausa VCD-indotte.

Protocollo

Tutti gli esperimenti, abitazioni, e la cura per gli animali è stata eseguita utilizzando protocolli che hanno aderito alle linee guida ed approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso la University of Arizona, e al 2011 le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Il trattamento con 4-Vinylcyclohexene Diepoxide

1. VCD protocollo di dosaggio: In una cappa, aggiungere 0,587 ml di VCD in un pallone pulito, portare il volume finale di 10 ml con olio di sesamo, e poi mescolare capovolgendo delicatamente, coprire e sigillare con Parafilm. Trasferire la soluzione in un flacone di dosaggio, sigillare con parafilm e conservare a 4 ° C per 7 giorni. Assicurarsi che tutti i reagenti sono sterili.
   1. Usare olio di sesamo come il controllo del veicolo come VCD viene disciolto in olio di sesamo. Conservare VCD (PM = 140.2 g / mol, densità = 1,09 g / ml) a -20 ° C.
   2. Protocollo di iniezione VCD: A 2 mesi di età, peso e amministrare quotidiane iniezioni intraperitoneali di stanza calmaature VCD alla dose di 160 mg / kg per 20 giorni consecutivi. Iniettare topi di controllo in modo simile con la soluzione veicolo, olio di sesamo, ad un volume di 2,5 ml / kg.
      Nota: Durante il periodo di iniezione, cercate di alternare i siti di iniezione per ridurre le possibilità di infezione locale. Utilizzare la seguente equazione per calcolare il volume necessario per l'iniezione: Peso corporeo (g) x kg / 1,000 gx 2,5 ml / kg = volume (ml) di soluzione da iniettare risultante in circa 50 ml / iniezione utilizzando un ago G 27. A causa delle dimensioni dell'ago non sono necessari anestetici locali.
   3. Controllo del ciclo estrale: Dopo il periodo di iniezione è completa, monitorare i cicli di estro quotidiano ottenendo strisci vaginali. Trattenere i topi utilizzando il metodo collottola dorso. Inserire un contagocce con 0,2 ml di soluzione fisiologica sterile nell'orifizio vaginale ad una profondità di 0,5 cm. Triturare salina (3x) e inserire 1 goccia su una diapositiva vuota. Subito valutare i campioni al microscopio usando un Microsc luce normaleope a 100X grandezza.
      Nota:. Citologia vaginale è determinato ad assicurare la perdita di ciclismo e quindi convalidare insufficienza ovarica Figura 2A illustra la citologia vaginale tipica tra le diverse fasi del ciclo estrale nei topi, cioè proestrus, estro, metestrus, diestrus ^17-19. Durante proestrus, le cellule sono cellule epiteliali nucleate (Figura 2A, frecce indicano le cellule nucleate); durante l'estro, le cellule sono prevalentemente cornified cellule epiteliali squamose; Metestrus è caratterizzato da una combinazione di tipi di cellule, con una predominanza di leucociti; Diestrus è dominato da leucociti. Regolazione del piano focale può essere richiesto di visualizzare le cellule e nuclei in tutto il campione. Come illustrato nella Figura 2B, un tipico ciclo di estro murino è di 4-5 giorni. I topi sono considerati aciclico dopo 15 giorni consecutivi in ​​diestrus persistente. Monitorare costantemente i cicli di estro per tutta la durata dello studio period per confermare la mancanza di cicli di estro in VCD topi trattati.

2. Esercizio Volontario Cage ruote

Inbred C57BL / 6 e B6C3F1 topi di sesso femminile, età compresa tra 7 mesi, sono esposti alla corsa della ruota gabbia volontaria. Animali Casa singolarmente in una gabbia (47 centimetri x 26 centimetri x 14,5 centimetri) con accesso incondizionato ad una ruota gabbia per 28 giorni.

1. Installazione dell'attrezzatura: L'apparecchio ruota gabbia è costituita da una ruota di diametro 11,5 centimetri con 5,0 centimetri largo esecuzione di superficie dotato di un contatore magnetico digitale che viene attivato dalla rotazione della ruota. Prima di ogni prova ruota portante, calibrare la ruota gabbia secondo le linee guida del produttore. Misurare il diametro interno della ruota portante, calcolare la circonferenza e immettere questo valore nel contatore digitale come dimensione della ruota.
   1. Fissare la porzione di computer del contatore magnetico digitale al supporto ruota con del nastro.
   2. Collegare la porta del computerione del contatore magnetico digitale al supporto ruota con del nastro.
   3. Attaccare il magnete libero del contatore magnetico digitale alla barra centrale sullo stesso lato come il magnete cablato al computer, nuovamente nastratura sufficiente per proteggere il magnete da masticare danni. I magneti devono essere posizionati in modo che ogni rotazione della ruota viene registrata dal computer senza interferenze o resistenza per completare la rotazione della ruota.
      Nota: nastro adesivo è stato usato con successo per fissare i componenti del contatore magnetico digitale alla ruota portante. Nastratura dovrebbe essere sufficiente a coprire completamente il magnete e prevenire danni da masticare dall'animale. Il magnete deve essere posizionato il più vicino possibile alla ruota senza ostacolare il suo movimento. Tuttavia, l'installazione deve essere monitorata giornalmente per masticare danni e riparare se necessario.
   4. Montare la ruota alla gabbia facendo scorrere la ruota basamento attraverso il cablaggio superiore della gabbia animale. Fissare il supporto della ruota di tegli cablaggio gabbia con clip legante.
      Nota: La clip dovrebbe essere sulla parte superiore del cablaggio, distanti l'animale. Alimentare la porzione di computer e il cavo in eccesso attraverso il cablaggio della gabbia. Collocare il computer e il cavo in eccesso fuori dalla portata dell'animale. Ciò può essere realizzato mettendo una plastica di medie dimensioni Pesare in cima al cablaggio della gabbia di tenere il computer e cavo in eccesso.
2. Esercizio: Per un dato cucciolata, assegnare casualmente i topi sia al controllo sedentario o regime di esercizio. Dare tutti gli animali di acqua e di serie dura roditore chow ad libitum.
   1. Registrare manualmente i valori giornalieri per il ran distanza (km / giorno) e il tempo totale trascorso in esecuzione (ore / giorno), proposta dal contatore magnetico. Valori di distanza e tempo di record nello stesso arco di tempo di 1 ora al giorno per i valori precisi e coerenti per tutta la durata 28 giorni del periodo di esercizio. Clear (zero) il contatore magnetico dopo la registrazione ogni giorno per garantire letture precise seguitoing giorno.
   2. Determinare i valori medi di distanza e velocità per ogni gruppo. Calcolare la velocità in base ai dati valori di distanza e il tempo ogni giorno per ciascun topo. I dati possono essere visualizzati come giornaliero o medie settimanali per ogni parametro misurato.
3. Raccolta dei tessuti: Al termine del periodo di esercizio specifico, eutanasia esercitato e animali di controllo sedentari in 30 minuti di allontanamento dalle gabbie per dislocazione cervicale in anestesia inalato. Pesare massa corporea e il cuore rapidamente accise, muscolo scheletrico, e le ovaie.
   1. Al momento della raccolta dei tessuti, montare e macchiare le ovaie raccolti con hemotoxylin ed eosina (H &E; Figura 2C). Sotto ingrandimento, contare e classificare i follicoli come primordiale, primaria, secondaria, o antral per ogni VCD-trattati e controllo degli animali ^20. Un follicolo primordiale contiene una piccola ovocita primario, un singolo strato di cellule della granulosa appiattite o squamose strettamente contrari alla ovocita, e un basalelamina. Un follicolo primario è definito dalla presenza di una o più cellule della granulosa cubica che sono disposti in un unico strato che circonda l'ovocita. Un follicolo secondario contiene cellule della granulosa che formano strati multipli di tutto l'ovocita, e una teca. Un follicolo antrale è caratterizzata da una cavità o "antro" contenente fluido.
   2. Per asportare il cuore, praticare un'incisione mediale sul lato ventrale e visualizzare cuore dopo l'apertura del diaframma. Rapidamente asportare il cuore alla base e posto in tampone fosfato freddo di wash-out sufficientemente sangue ventricolare residuo. Tagliare il cuore del tessuto in eccesso, pesare tutto il cuore e lo snap-congelare in azoto liquido.
   3. Lavare tutti gli altri tessuti asportati con una soluzione modificata ghiacciata tampone fosfato salino (PBS), ea scatto congelamento in isopentano raffreddato in azoto liquido.

3. Esercizio Treadmill forzata

1. Quando si impiega un forzato esercizio paradigma to misurare la capacità di esercizio, utilizzare un tapis roulant e impostare come segue:
   1. Posizionare una griglia scossa elettrica alla base della rampa tapis roulant. Questo shock generato serve da stimolo per l'esercizio. L'intensità e la frequenza degli stimoli elettrici vengono azionati manualmente dagli utenti. Le griglie possono essere attivate o disattivate singolarmente per ogni corsia. Tutto raccolta dei dati è effettuata manualmente.
   2. Periodicamente, calibrare il tapis roulant in base alle linee guida del produttore.
      1. Assicurarsi che il tapis roulant regolatore di commutazione del pannello frontale è impostato su "STOP".
      2. Sensore di velocità posto sulla pedana mobile lane1 cintura e sicuro fissarlo con dado in posizione mostrata qui sotto.
      3. Utilizzando la manopola sul pannello frontale Treadmill Controller, regolare la velocità di 88,7 m / min Quindi, impostare la frequenza dello stimolo elettrico a 2 Hz sulla pedana mobile di controllo del pannello frontale.
      4. Premere il pulsante "ODOMETER RESET" per inizializzare la procedura di calibrazione.
         Nota: i gruppi di controllo sedentari o nonexercise devono essere inclusi nel disegno sperimentale. Il gruppo di sedentari è l'età abbinato al gruppo di esercizio. Abbiamo precedentemente dimostrato che la casa i topi sedentari singolarmente in gabbie di dimensioni uguali ai topi esercitati non influiscono sui parametri di interesse rispetto ai topi sedentari alloggiati con i fratelli. Pertanto, i topi sedentari sono stati tenuti con i fratelli nella stessa stanza, come i topi esercitate.
2. Acclimatazione: Acclimatare topi al treadmill 3-7 giorni prima dell'esperimento giornaliero. Per fare questo, posto topi in tapis roulant con la cinghia griglie immobile e urti off, ma con il motore cintura (rumore). Lasciare topi indisturbati per almeno 15 minuti.
3. Warm up: Warm up gradini fini del presente protocollo sono i seguenti:
   1. Collocare ogni mouse sul tapis roulant. Disattivare la griglia shock e aumentare la velocità del nastro a 4 m / min per 15 min.
   2. Attivare la griglia shock e mantenere la velocità del nastro a4 m / min velocità del nastro per altri 10 min.
4. Regimi di allenamento Esercizio
   1. A seguito di warm up, tenere le griglie d'urto su e aumentare la velocità del nastro a 5 m / min per 15 min.
   2. Aumentare la velocità del nastro di 15 m / min per altri 15 min.
   3. Dopo la formazione, il trasferimento topi alle loro gabbie.
      Nota: In questo studio, l'esercizio fisico è stata eseguita al giorno per 1 settimana.
   4. Regime di esercizio acuta: un esercizio di regime acuta è stato progettato per determinare gli effetti a breve e lungo termine da sforzo estremo.
      1. A seguito di riscaldamento, aumentare la velocità del nastro da 5 m / min a 10, 15, 20, 25, e 30 m / min con intervalli di 10 min.
         Nota: Terminare esercizio se i topi sono in grado di continuare l'esecuzione o mostrare segni di stanchezza o di angoscia. Nel nostro studio, la maggior parte degli animali sono stati fermati a 25 m / min, e nessun animale superato il 30 m / min stadio.
      2. Verificare ogni mouse per tre volte, permettendo di 2-3 giorni tra ciascuna prova. Calcolare i valori medi in tutti esercisessioni precise per ogni mouse.
   5. Regime di esercizio per la resistenza: un protocollo di esercizio di resistenza è finalizzato alla formazione di topi per una prolungata esposizione all'esercizio stimolo tapis roulant. Questo tipo di protocollo di prova la capacità di tollerare gli effetti a lungo termine dello stress moderato esercizio fisico.
      1. Iniziare con la velocità del nastro delineato durante il periodo di riscaldamento, 4 m / min.
      2. Aumentare gradualmente la velocità cinghia 1m/min finché una velocità finale di 20 m / min si raggiunge. Durata totale di un protocollo tipico di studio è di 50 min.
      3. Dopo regime di esercizio, trasferire i topi alle loro gabbie.
         Nota: l'esecuzione topi ad esaurimento è evitata. Se in qualsiasi momento durante l'esperimento di un mouse mostra segni di stanchezza, disattivare la griglia shock e lasciare il mouse per riposare e recuperare.

4. Dati e analisi statistica

1. Presentare i risultati come media ± SEM e utilizzare 2-way ANOVA (gruppo di trattamento e exercise come principali fattori), seguito da un test di Student-Newman Keuls post hoc o t test di Student per confrontare le differenze tra i valori medi.
2. Determinare la variazione percentuale della massa cardiaca, con l'esercizio confrontando la massa di ciascun animale esercitata alla massa cardiaca media del gruppo sedentario. La differenza di massa cardiaca viene quindi espresso in variazione percentuale di animali sedentari per ogni rispettivo animale. valori di p <0,05 sono considerati statisticamente significativi.

Risultati

Un tipico protocollo sperimentale, come quello utilizzato in questo studio, è illustrato in Figura 1. A seguito di 20 giorni consecutivi di trattamento VCD, citologia vaginale stata utilizzata per determinare la presenza o l'assenza di ciclicità nei topi VCD-iniettato; topi veicoli-iniettata sono stati monitorati. La fase del ciclo di estro è stata determinata dalla proporzione di cellule epiteliali, cellule epiteliali cornified, e leucociti nello striscio vaginale (Figura 2A). La presenza di cellule epiteliali solo cornified indicato il topo era in estro, e quindi era ancora in bicicletta. Il ciclo estrale nei topi genere dura 4 giorni, quindi VCD iniettato animali erano considerati aciclico dopo 15 giorni di diestrus persistente, in cui citologia vaginale rivelato maggioranza dei leucociti (Figura 2A). Il ciclo estrale di topi trattati VCD divenne irregolare, e poi terminata entro 2-3 mesi dall'inizio delle iniezioni VCD (Figura 2B) . VCD tessuto ovarico mostrato atrofia significativa, rispetto ai controlli. Ad alto ingrandimento, vediamo un completo esaurimento dei follicoli primari e primordiali (Figura 2C).

Per testare l'effetto della insufficienza ovarica VCD indotta sulle prestazioni esercizio, randomizzato 7 mesi-VCD e topi trattati con veicolo (due ceppi, C57BL / 6 e B6C3F1) a uno ruota gruppi di esercizio sedentari o gabbia 4-6 settimane seguenti l' cessazione del ciclismo (Figura 1). Valori di allenamento giornalieri sono stati registrati per il tempo e la distanza per ogni animale esercitato per tutto il periodo di esercizio 4 settimane. Medie settimanali dei valori di funzionamento giornalieri per distanza, tempo e velocità sono mostrati in Figura 3 per C57BL / 6 topi trattati con veicolo o VCD. Non abbiamo visto differenze significative in termini di prestazioni di esercizio misurata dal tempo medio giornaliero, la distanza e la velocità sulla ruota gabbia tra VCD-e gruppi di veicoli trattati in entrambi C57BL / 6 o il mouse B6C3F1deformazione (Figura 4A). Le velocità ruote esecuzione calcolati progressivamente aumentato nel corso del periodo di funzionamento di 4 settimane come precedentemente indicato ^16, ma non erano significativamente differenti tra i due gruppi sperimentali. Questi studi indicano che l'incidenza di insufficienza ovarica VCD-indotta esercizio ruota gabbia volontaria trascende almeno 2 ceppi di topi.

Seguendo la durata del protocollo di esercizio ruota gabbia volontario, morfometria corpo furono registrati ed i cuori stavano rapidamente escissi e pesati. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'esercizio ruota gabbia volontaria induce un aumento della massa cardiaca ^16. Qui vi mostriamo anche l'ipertrofia cardiaca in risposta all'esercizio ruota gabbia misurata dal peso del cuore assoluto (HW) e HW normalizzata alla lunghezza tibiale (TL) (Tabella 1). La massa del cuore assoluto e il rapporto HW / TL erano significativamente maggiori nei veicoli-VCD e topi trattati rispetto alle controparti sedentarie. Tuttavia, non c'erano misudifferenze Râblé di ipertrofia cardiaca tra controllo e topi insufficienza ovarica VCD indotta da esercizio seguente ruota gabbia volontariato.

Successivamente, abbiamo usato involontaria (forzata) treadmill in esecuzione per determinare la capacità di esercizio. Per prima sottoposti topi per un protocollo ad alta intensità che aumentata gradualmente velocità media ogni 10 minuti fino ad esaurimento. In media, la velocità massima del veicolo topi trattati era 26,7 ± 0,95 m / min e la velocità massima di VCD topi trattati era 28 ± 1,4 m / min prima di esaurimento. Abbiamo usato più bassa intensità in esecuzione a 20 m / min (circa l'80% del massimale) per eseguire il test per la capacità di resistenza. Come mostrato in Figura 4B, è stata trovata alcuna differenza significativa nella capacità di alta o bassa intensità di esercizio tra veicolo e VCD gruppo trattato, indicando che insufficienza ovarica VCD indotta avuto alcun effetto sulla capacità di esercizio del mouse.

In conclusione, menopausa indotta dal trattamento VCD non ha effetto su r volontario o forzato capacità unning, così come la risposta adattativa cardiaca di esercitare.

Figura 1. VCD-amministrazione e protocollo sperimentale. Topi sono stati somministrati VCD (160 mg / kg) o olio di sesamo (controllo del veicolo) a partire da 2 mesi di età per 20 giorni consecutivi. A seguito di iniezioni VCD o di veicoli, cicli di estro sono monitorati e cyclicities sono stati determinati come descritto nella sezione Metodi. La perdita della funzione ovarica si è verificato entro 60-90 giorni ed è stata confermata dalla citologia vaginale. A 7 mesi di età, i topi sono stati esposti a esercizio ruota gabbia volontario per 4 settimane o sottoposti al protocollo di esercizio al treadmill.

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. Figura 2 insufficienza ovarica VCD-indotta nei topi A:. Citologia di uno striscio vaginale senza macchia da un veicolo topo iniettato dimostrare le quattro fasi del ciclo estrale: 1) proestrous, prevalentemente costituito da cellule epiteliali nucleate 2) estro, caratterizzata da ONU -nucleate cellule corneo; 3) metestrus, costituito da cellule nucleate epiteliali (frecce), un-nucleati cellule epiteliali cornified (frecce), e leucociti; 4) diestrus, composto principalmente da leucociti; e B:. Durata media (giorni) del ciclo estrale del veicolo e dei gruppi VCD-iniettato. Un ciclo è misurata dal primo giorno in estro al primo giorno del periodo successivo in estro. Citologia vaginale iniziato circa 6 settimane dopo l'inizio delle iniezioni. I cicli di estro animali VCD-iniettato diventano irregolari, rispetto al veicolo iniettato animales, e dopo cicli 12 estro, citologia di tutto VCD iniettato animali non è più indicato ciclismo C:. H & E colorazione del tessuto ovarico a 8 mesi di età. Le sezioni trasversali fatto a spessore 5 micron per veicoli trattati (pannello di sinistra) e VCD-trattati (pannello di destra) topi a 20X (pannello superiore) e 200X (pannello inferiore) ingrandimento. Tessuto ovarico con ingrandimento 200X mostra un certo numero di follicoli in veicolo rispetto ai topi trattati con VCD. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Prestazioni ruota gabbia volontario in VCD trattati C57BL/6J topi femmina-veicolo o. Pannello di sinistra: Distanza media di funzionamento (km /giorno) per ogni periodo di 1 settimana durante il periodo di studio di quattro settimane Pannello Medio:. tempo di esecuzione medio (ore / giorno) per ogni periodo di 1 settimana durante il periodo di studio di quattro settimane pannello di destra:. velocità media di marcia (km / h) per ogni 1 periodo di settimana durante il periodo di studio di quattro settimane. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Ruota gabbia di volontariato e prestazione del tapis roulant di un veicolo, VCD topi trattati. A: (pannello superiore) C57BL / 6 corsa di media (km / giorno) e il tempo trascorso sulla ruota (ore / giorno) per ogni 24 ore durante il periodo di studio di quattro settimane. (Pannello inferiore) & #160; B6C3F1 media distanza percorsa (km / giorno) e il tempo trascorso sulla ruota (ore / giorno) per ogni 24 ore nel 4 settimane periodo di studio B: C57BL / 6 parametri tapis roulant in esecuzione.. Tempo massimo (pannello superiore) e la velocità massima (Botoom Panel) utilizzando protocolli descritti nella sezione metodi.

Discussione

Entrambi esercizio ruota gabbia e tapis roulant in esecuzione regimi di esercizio sono stati utilizzati in nostri studi precedenti ^16,21,22. Tutti gli animali sono tenuti in palestre dedicate per minimizzare disturbi ambientali o umani. Qualsiasi disturbo degli animali ritmo biologico può influenzare significativamente animali prestazione fisica. Pertanto, l'intera cura degli animali, il monitoraggio e la registrazione delle prestazioni, e regimi di esercizio dovrebbe essere fatto entro lo stesso lasso di tempo ogni giorno. Gli investigatori dovrebbero sforzarsi di evitare ulteriore stress agli animali esibendo precauzioni come limitare la durata dell'esposizione stress e coprono le gabbie al momento opportuno.

Esercizio ruota Cage

Nel preparare l'apparato ruota gabbia, la ruota deve essere facilmente accessibile per il mouse di montare e uscire. Ci dovrebbero biancheria minima nella parte inferiore della gabbia per evitare che i topi di nidificazione intorno alla ruota e ostacolando fremovimento e ruota. Il sensore magnetico è posizionato sulla parte fissa della ruota e il magnete fissato alla ruota libera, in modo da contare ogni rotazione della ruota come il mouse esercitato. Il dispositivo di registrazione collegato al sensore magnetico deve essere posizionato sopra il coperchio filo della gabbia, e tutti i cavi esposti devono essere sia registrato o tenuti lontani dai topi, in modo da fornire una barriera contro masticare danni. I sensori magnetici e magnetici sono stati nastrate per le strutture adeguate per evitare danni e movimenti indesiderati. Durante la raccolta dati giornalieri, tutti i fili nastrate devono essere strettamente controllati per assicurare i fili rimangono intatti e dovrebbero essere retaped come necessario. Dal momento che può richiedere diversi giorni per topi per acclimatarsi al nuovo ambiente e cominciano a esercitare regolarmente, la registrazione dei dati deve essere su misura per ogni singolo animale. Sebbene animali tendono a spendere molti hr sulla ruota, la maggior parte della corsa si verifica durante la notte. Pertanto, alcuni animali possono rivelare high attività di prestazioni anche se appaiono in sospeso durante il giorno. Inoltre, non è raro che alcuni animali esibiranno limitata corsa ruota gabbia. In genere, l'attività ruota gabbia che equivale a una media 1 km / giorno o meno è il risultato di un'attività gabbia casuale e non associato ad alcuna significativa stimolo in esecuzione. Pertanto, gli animali i cui parametri di funzionamento sono a 1 km / giorno o 1 ora / giorno o meno dovrebbero essere escluse nei nonrunners analisi dei dati finali.

A seconda delle specifiche finalità di uno studio individuale e ceppi di topi coinvolti, la durata di esercizio può essere modificato. Il nostro studio precedente ha mostrato che per entrambi i ceppi di topi coinvolti, le velocità medie ruote esecuzione e la durata dell'esercizio fisico sulla ruota gabbia progressivamente aumentato nel tempo e un plateau di 4 settimane.

Ruota Cage corsa è un tipo di esercizio volontario in modelli animali, che viene generalmente considerato come svolto in condizioni meno stressanti. Unlike esercizio al treadmill in cui alcuni parametri possono essere preimpostati, il tutto in esecuzione nella gabbia test è volontaria e facilmente influenzato da stimoli ambientali o comportamentali. Pertanto, i confronti tra diverse impostazioni sperimentali sono generalmente evitati a meno di utilizzare un gran numero gruppi sperimentali. Altri potenziali aree di ricerca che possono beneficiare di questo tipo di esercizio paradigma sono studi che incorporano le risposte comportamentali con conseguenze fisiologiche come le neuroscienze cognitive. Per gli studi che utilizzano il paradigma ruota gabbia volontaria, i passaggi più critici sono impostare la gabbia e il monitoraggio delle attività di esercizio.

Esercizio al treadmill

Passaggi acclimatazione sono necessari per preparare gli animali per il protocollo di esercizio al treadmill. A seconda dello scopo specifico dello studio individuale, la durata del periodo di acclimatazione può variare. In questo studio, un periodo di una settimana è stato scelto per consentire agli animali di acclimmangiato all'apparato tapis roulant e il rumore del motore nella gabbia, riscaldare i periodi sono un passo importante del regime di allenamento. Simile a controparti umane, i topi deve essere riscaldato prima di entrare in qualsiasi regimi di esercizio ad alta intensità per evitare lesioni e possibili artefatti dati. In questo studio, abbiamo iniziato il nastro alla velocità più bassa (4 m / min) con le griglie urto spente per 15 min. Tutti i topi in questione ha iniziato a correre e fuori la cintura. Le griglie urto stati poi accesa e la velocità del nastro mantenuti a 4 m / min. Per evitare l'eccessiva sottolineando i topi, abbiamo impostato la scossa elettrica ad un livello lieve (1 Hz). Nel giro di pochi giorni, tutti i topi adattati alla cintura tapis roulant.

La durata di funzionamento nonché l'accelerazione possono inoltre essere calibrate per ciascun disegno sperimentale. A partire accelerazione raccomandata è di 1 m / min. Le corsie tapis roulant di topi che presentano segni di stanchezza devono essere spenti immediatamente. Tipicamente segni di esaurimento esposti da mice sul tapis roulant sono i seguenti:

1. L'esposizione continua alla griglia shock per> 5-10 sec,
2. La perdita della capacità di correre con conseguente griglia di esposizione di shock> 5x durante un unico regime di esercizio, e
3. La perdita della capacità di correre con conseguente esposizione della griglia di shock> 2 sec almeno 3 volte durante un singolo regime di esercizio.

I valori sopra elencati devono essere utilizzati principalmente come linee guida per uno specifico esperimento. Devono essere determinati per ogni protocollo di esercizio in quanto varia da ceppo del mouse per ceppo di topi, esperimento di sperimentare, e ricercatore a ricercatore Questi parametri.

A differenza di esercizio ruota gabbia, studi tapis roulant devono essere ripetuti più volte per eliminare gli effetti di fattori ambientali e biologici su esecuzione delle prestazioni. Non è raro vedere fluttuazioni prestazione di marcia tra le prove anche per lo stesso animale. Dal momento che ogni regime di esercizio espone esecuzione topi per un Stress, un intervallo di riposo adeguato tra i test è necessario. Nella nostra esperienza, i 2-3 giorni di riposo tra ogni prova era sufficiente per i topi di recuperare.

Come esercizio treadmill umano, la velocità di esercizio di resistenza è meglio determinata dalla frequenza cardiaca o la saturazione di ossigeno nel sangue, un'impresa tecnicamente difficile con gli studi del mouse. La fase più critica di studi tapis roulant è la determinazione di esaurimento, che varia di solito tra i singoli topi, ed è stato fissato al 80% della velocità massima. Nella nostra esperienza la registrazione dei risultati possono differire in modo significativo tra i singoli ricercatori, dal momento che i criteri per la stanchezza sono per lo più soggettiva. Pertanto, l'applicazione coerente degli stessi criteri durante la registrazione è critica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)	Sigma, cat# V-3630
11.5-cm-diameter wheel with a 5.0-cm-wide running surface	Petsmart,model 6208
Digital magnetic counter	Sigma Sport,model BC 600
Treadmill exercise	Columbus Instruments , model 1055SDRM