Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2

Résumé

Immunofluorescence indirecte (IFI) les essais ont traditionnellement été utilisés pour la détection des anticorps antinucléaires (ANA) dans le sérum humain. La présence de ces anticorps peut aider au diagnostic de maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (ADRD). Ce protocole montre comment effectuer efficacement la technique IIF pour détecter avec précision ces auto-anticorps.

Résumé

L'American College of Rheumatology énoncé de position sur les tests ANA prévoit l'utilisation de l'IIF que la méthode de l'étalon-or pour le dépistage ANA ^1. Bien IIF est un excellent test de dépistage dans des mains expertes, les difficultés techniques de traitement et de lecture IIF glisse - comme la intensif de traitement du travail de diapositives, une lecture manuelle, la nécessité d'une expérience, les technologues formés et l'utilisation de la salle sombre - rendre la méthode IIF difficile de faire entrer dans le flux de travail de laboratoires automatisés, modernes.

La première étape cruciale vers la haute qualité dépistage ANA est le traitement de diapositive attention. Cette procédure est laborieuse et nécessite une bonne compréhension du processus, ainsi que l'attention aux détails et l'expérience.

Glisser lecture est effectuée par microscopie à fluorescence dans des pièces sombres, et se fait par des techniciens qualifiés qui sont familiers avec les différents modèles, dans le cadre du cycle cellulaireet la morphologie de l'interphase et les cellules en division. À condition que l'IIF est le premier outil de dépistage de la ligne pour l'ADRD, comprendre les étapes à exécuter correctement cette technique est critique.

Récemment, des systèmes d'imagerie numérique ont été développés pour la lecture automatique des diapositives IIF. Ces systèmes, tels que le NOVA Voir microscope à fluorescence automatisé, sont conçus pour faciliter le travail IIF routine. NOVA Voir acquiert et stocke les images numériques de haute résolution des puits, séparant ainsi l'acquisition d'images à partir de l'interprétation; images sont visualisées sur une interprétation d'un des écrans d'ordinateur à haute résolution. Il stocke les images pour référence future et prend en charge l'interprétation de l'opérateur en fournissant des données d'intensité de lumière fluorescentes sur les images. Il classe également au préalable les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. En résumé, il élimine le besoin de chambre noire, et automatise et rationalise le readi IIFng / flux de travail d'interprétation. Surtout, il augmente la cohérence entre les lecteurs et les lectures. De plus, avec l'utilisation de diapositives à code-barres, les erreurs de transcription sont éliminés en fournissant la traçabilité des échantillons et l'identification positive du patient. Il en résulte l'intégrité des données du patient et de sécurité accrue.

L'objectif global de cette vidéo est de démontrer la procédure IIF, y compris le traitement de diapositives, l'identification de modèles IIF communes, et l'introduction de nouvelles avancées pour simplifier et harmoniser cette technique.

Introduction

L'anticorps antinucléaires terme (ANA) décrit une variété d'auto-anticorps qui réagissent avec les constituants des noyaux de cellules dont l'ADN, des protéines et ribonucléoprotéines ^{1, 2.} La cellule HEp-2, une matrice de protéine native avec des centaines d'antigènes, fournit un substrat idéal pour la détection ^d'une ANA. La détection de l'ANA dans le sérum humain est un outil de dépistage important pour les maladies du tissu conjonctif, et IIF est la méthode de référence pour tester ANA ^1. Récemment, IIF sur cellules HEp-2 a été remplacé dans certains laboratoires avec des dosages immunologiques spécifiques de l'antigène et méthodes multiplex. En raison de préoccupations au sujet des résultats faussement négatifs et le manque de transparence pour les cliniciens, l'American College of Rheumatology a formé un groupe de travail qui a conclu que l'aide IIF cellules HEp-2 devrait être le «gold standard» pour le dépistage ANA ^1.

En raison de la nature subjective de criblage ANA, la qualité des cellules HEp-2 est enintégrante de rapports précis et sûr des résultats. La présence d'un nombre élevé de cellules en mitose, la morphologie cellulaire optimale, la confluence suffisante, et l'expression des antigènes en question sont particulièrement importants. Reconnaissance de formes IIF sert comme un outil important pour aider au diagnostic du patient. Comprendre l'importance de divers modèles permet aux cliniciens et le personnel de laboratoire pour effectuer les essais de suivi approprié pour confirmer le diagnostic. Par exemple, le motif ANA homogène peut se produire en présence d'anticorps anti-ADN double brin chromatine ou, et peut être associé à un lupus érythémateux disséminé (SLE) ^3. De l'autre côté, il a été récemment décrit que la configuration dite fine et dense mouchetée (DFS) qui est couramment observée jusqu'à 12% des échantillons de routine, a surtout été associée à des anticorps anti-DFS70. Ces auto-anticorps, une fois trouvé dans l'isolement (sans autre ANA spécifique de la maladie) ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques ^{4-9. Tests de confirmation de ce fait pour les anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l'anxiété du patient.}

Étant donné que l'IIF est la première méthode de dépistage de la ligne pour détecter des auto-anticorps, il est primordial que l'utilisateur comprenne comment le choix des réactifs et des substrats de tissus peut influer sur les résultats. Depuis la technique IIF est intrinsèquement subjective, il est important que les réactifs utilisés fournissent les résultats de la plus haute qualité.

Cet objectif de ce protocole vidéo est de familiariser l'utilisateur avec les bonnes mesures nécessaires pour exécuter la méthode IIF, les modèles communs associés à ANA, et d'introduire de nouvelles avancées qui peuvent rationaliser le flux de travail de laboratoire et de normaliser les résultats.

Protocole

1. Exemple de sélection et de préparation du support

1. Éliminer les réactifs de l'emballage et de permettre à chaque article à venir à la température ambiante. Préparer les réactifs et diluer le sérum du patient en fonction de la pièce rapportée de direction. Remarque: diapositives NOVA Lite sont un code à barres et peuvent être facilement intégrés dans les systèmes automatisés en collaboration avec le Laboratoire Système d'information LIS. Cette procédure illustre le traitement manuel de diapositives; laboratoires à haut débit, cependant, peuvent opter pour un équipement automatisé de traitement de diapositive.

2. Ajout des contrôles et des échantillons

1. Distribuer une goutte de contrôle positif et une goutte de contrôle négatif dans les puits de glissement appropriées. Introduire à la pipette 20 à 25 pl de sérum dilué patient dans les puits restants. Traiter une diapositive à la fois.
2. Placer la lame (s) dans un récipient de coloration avec une serviette en papier humide sur le fond. Couvrir le récipient et laisser incuber le coulisseau (s) pendant 30 min. Note: Les conditions humides seraempêcher le substrat de sécher. Séchage des puits pourrait entraîner une coloration un artefact. Au cours de cette période d'incubation, les anticorps anti-nucléaires dans le sérum du patient se lient aux antigènes des cellules qui sont fixés sur chaque puits.
3. Après la période d'incubation, rincer le sérum en utilisant un léger courant de tampon de lavage. Afin d'éviter d'endommager le substrat et empêcher cross-over entre les puits d'échantillons, la glissière angle légèrement pour éviter de diriger le jet directement sur les puits. Secouez tampon de lavage en excès et placer la lame dans une jarre Coplin contenant du tampon de lavage pendant environ 5 min.

3. Ajout de conjugué fluorescent

1. Un par un, supprimer les diapositives de la mémoire tampon de lavage et tapotez doucement pour enlever le tampon de lavage en excès. Appliquer 1 goutte de conjugué fluorescent (FITC marqué anti-IgG humaine) sur chaque puits. Incuber les lames pendant 30 min dans le conteneur humidifié, et assurez-vous de remplacer la colorationcouvercle du récipient. Remarque: Pour les tests ANA, l'utilisation d'un conjugué spécifique d'IgG Fc est recommandée. Le conjugué est sensible à la lumière, et le couvercle protège les diapositives de l'exposition à la lumière en plus de maintenir l'environnement humide. Au cours de cette période d'incubation, le conjugué se lie à des anticorps anti-nucléaires du patient qui se sont liés aux antigènes cellulaires. Ce conjugué de liaison se traduit par la présence de la fluorescence dans les puits.
2. Rincer et laver la lame comme décrit ci-dessus.
3. Placer une lamelle couvre-objet sur une serviette en papier et appliquer un milieu de montage dans une ligne continue sur le bord inférieur de la lamelle.
4. Retirez chaque diapositive du tampon de lavage et appuyez sur la diapositive doucement pour enlever le tampon de lavage en excès. Appuyez sur le bord inférieur de la lame vers le bord de la lamelle.
5. Abaisser doucement le glisser sur la lamelle couvre-objet de telle manière que le milieu de montage sur la lamelle couvre-objet s'écoule vers le bord supérieur de la lame sans formation de bulles d'air. Note: Coverslipping, y compris en utilisant la quantité optimale de milieu de montage, est une technique qui demande de la pratique de la perfection.

4. Identification des résultats positifs et négatifs

Interprétation Manuel

1. Voir glisse avec un microscope à fluorescence, situé dans une pièce sombre. Effectuer un balayage de l'ensemble du bien avec un objectif 20X ou 25X pour évaluer la distribution de cellules et l'uniformité de la fluorescence
2. Basculer vers un objectif 40X pour rendre l'interprétation finale concernant la positivité et le motif.
3. Regardez les contrôles positifs et négatifs. positivité de grade en utilisant une échelle de notation de la réactivité de 1 + à 4 +. Remarque: Le contrôle négatif peut ne pas apparaître complètement sombre, mais souvent afficher fluorescence non spécifique faible niveau. Le contrôle positif afficher pomme lumineux fluorescence verte dans le noyau (figure 1).

Interprétation automatisée

Remarque: En additià l'interprétation manuelle, la charge et Numérisation de diapositives par NOVA Voir Microscope à fluorescence automatisé ou tout autre instrument d'imagerie numérique automatisé; pas de chambre noire est nécessaire. Après avoir créé un projet en sélectionnant le type de diapositive échéant, l'instrument acquiert et stocke des images numériques haute résolution de cellules dans chaque puits. En outre, NOVA Voir mesure l'intensité de la lumière fluorescente, et catégorise les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. Images sont visualisées par l'opérateur sur un écran d'ordinateur à haute résolution, permettant l'interprétation finale, la révision et la confirmation de NOVA Voir résultat. Les rapports peuvent être générés sur les résultats confirmés. Microscopie numérique doit être utilisé en conjonction avec un technicien de laboratoire expérimenté car il est destiné à faciliter l'interprétation des résultats.

Résultats

Lors de l'évaluation des résultats de coloration cellulaire pour HEp-2, cinq grands modèles nucléaires sont les plus fréquemment rapportés: homogène, moucheté, centromère, nucléolaire et points nucléaires. Ces modèles sont le résultat de la liaison d'auto-anticorps spécifiques de constituants du noyau. Bien que les tests ANA est spécifique aux structures nucléaires, cytoplasmiques modèles associés à des auto-anticorps contre les structures cytoplasmiques peuvent également être observés. Dans certains cas, plusieurs auto-anticorps peuvent être présents dans un échantillon, et l'image peuvent apparaître comme un modèle mixte.

Il existe d'autres, moins fréquemment observé, et souvent des modèles spécifiques du cycle cellulaire qui peuvent être détectés par la méthode IIF; plus récemment, un soi-disant modèle finement mouchetée dense de signification clinique spéciale a été décrite dans certains sérums positif ANA.

Motif homogène

Pour identifier un modèle homogène, analyser le bien et identifier mitotique ou séparationcellules. La chromatine condensée des cellules en mitose (figure 2, orange flèche) présente solide, fluorescence uniforme, qui est souvent plus prononcée que dans la cellule de repos nuclei.In la structure homogène, les cellules au repos exposition uniforme, fluorescence diffuse de l'ensemble du noyau (Figure 2, flèche blanche). Ce motif caractéristique est souvent le résultat d'anticorps anti-ADN double brin ^10.

Motif tacheté

Dans le motif moucheté grossier, les cellules mitotiques ne présentent pas de coloration des régions chromosomiques condensés (Figure 3, orange flèche). Les cellules au repos présentent une fluorescence granulaire dans l'ensemble du noyau. La moucheture nucléaire peut être définie comme grossier ou fin. Le motif de taches grossier est souvent le résultat d'anti-Sm et anti-RNP ^11.

Dans le modèle finement mouchetée, les cellules au repos montrent taches amende ou diffus à travers les noyaux, généralement en uniforme distribution (figure 4, flèche blanche). Le motif finement mouchetée est souvent le résultat de l'anti-anti-SSB SSAand ^12.

Dense Motif Fin tacheté

Il est maintenant reconnu que l'amende motif tacheté dense (DFS) est commun dans les tests de routine, et autant que 12% des échantillons sont positifs pour les auto-anticorps anti-DFS70. Cependant, ces auto-anticorps, quand trouvés dans l'isolement, ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques ^{4 -6.} Ces anticorps sont répandues dans les individus et les patients porteurs de maladies non liées à l'ADRD ⁶ sains. Les tests de confirmation des anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l'anxiété du patient.

Depuis le modèle DFS est difficile d'identifier et ANA positivité peut causer de l'anxiété pour les patients et les médecins, il est fortement recommandé d'effectuer un test de confirmation après identification Fying un motif suggestif d'anticorps anti-DFS70 de clarifier la signification clinique de l'ANA positivty ^5,6.

Dans ce modèle, les cellules en mitose (figure 5, flèche orange) montrent une coloration mouchetée positif de la chromatine en métaphase, tout en se reposant noyaux cellulaires (figure 5, flèche blanche) présentent des fines mouchetures uniformément réparties dans tout le noyau.

Motif centromère

Pour identifier le modèle de centromère, analyser les puits et identifier mitotique ou cellules en division. Dans les cellules en mitose (figure 6, flèche orange), ces mouchetures discrètes deviennent étroitement associés à ce qui est souvent décrit comme une "barre de métaphase". Dans le modèle de centromère, les cellules au repos (figure 6, flèche blanche) montrent environ 40-60 mouchetures discrètes réparties dans les noyaux. Le motif de centromère est le résultat d'anti-CENP A, B, C des anticorps ^13.

étape "> Motif Nucleolar

Certains motifs nucléolaires sont associées à une coloration cytoplasmique diffuse dans les cellules en mitose (figure 7, orange flèche) et de la région chromosomique négative, tandis que d'autres modèles nucleolear présentent une coloration positive de la région chromosomique. L'aspect nucléolaire est associé à la coloration homogène ou tacheté des nucléoles (figure 7, flèche blanche), avec fontaine faible ou coloration homogène du nucléoplasme. Ces motifs sont associés à anti-ARN polymérase III, anti-fibrillarine, anti-Th/To et anti-PM/Scl anticorps ^14,15.

Motif de point nucléaire

Le motif de points nucléaire est associée à des cellules négatives métaphase de la mitose (figure 8, flèche orange) et avec quelques mouchetures discrètes dans les noyaux des cellules de repos (figure 8, flèche blanche). Ce motif caractéristique est souvent le résultat d'auto-anticorps p80 colin sp-100, PML, ou. Ces anticorps sont aussi sociated avec la cirrhose biliaire primitive et l'hépatite auto-immune ^16.

. Figure 1 témoin négatif (à gauche): Les cellules affichent un faible niveau de fluorescence non spécifique, mais pas de coloration nucléaire spécifique contrôle positif (à droite):. Cellules affichent pomme fluorescence nucléaire vert.

Figure 2. Modèle homogène. Des cellules mitotiques (de orangearrow) montrent fluorescence solide. Les cellules au repos montrent même, coloration diffuse (whitearrow).

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Figure 3. Grossier mouchetée modèle. Cellules mitotiques (de flèche orange) montrent une coloration négative. Les cellules au repos montrent une tache tacheté distincte (flèche blanche).

Figure 4. Motif Beaux mouchetée. Des cellules mitotiques (flèche orange) montrent une coloration négative. Les cellules au repos montrent une fluorescence finement mouchetée distincte (flèche blanche).

Figure 5. Dense motif fin moucheté. Des cellules mitotiques (flèche orange) montrent une coloration solide granulaire fine. Les cellules au repos montrent une très fine, tache mouchetée diffuse (whitearrow).

Figure 6. Modèle centromère. Des cellules mitotiques (de) orangearrow spectacle uniforme, mouchetures discrètes. Les cellules au repos (whitearrow) montre 40-60 mouchetures discrètes par noyau de la cellule.

Figure 7. Modèle Nucleolar. Des cellules mitotiques (de orangearrow) apparaissent comme des grappes de coloration granulaire. Repos cellule nucleishows fluorescence dans les nucléoles (whitearrow).

Figure 8. Motif de points nucléaire. Des cellules mitotiques (de orangearrow) semble négative. Les cellules au repos montrent un peu discrmouchetures ete dans le noyau (whitearrow). De plus, le modèle de point Nucelar peuvent coexister avec une coloration cytoplasmique associée à des auto-anticorps contre les antigènes mitochondriaux (flèche rouge).

Discussion

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.

To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.

In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.

Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019