반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영

요약

간접 면역 형광 (IIF) 분석은 전통적으로 인간 혈청에 항핵 항체 (ANA)의 검출에 사용되어왔다. 이 항체의 존재는 전신자가 면역 류마티스 질환 (SARD)의 진단에 도움을 줄 수있다. 이 프로토콜은 효율적으로 정확하게 이러한자가 항체를 검출하기 위해 IIF 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다.

초록

ANA 테스트에 류머티스 위치 문의 미국 대학은 ANA ¹ 선별을위한 황금 표준 방법으로 IIF의 사용을 규정하고있다. IIF는 전문가의 손에 우수한 선별 검사이지만, 처리 및 IIF를 열람하는 기술적 인 어려움은 슬라이드 - 같은 노동 집약적 인 슬라이드 처리, 수동 독서 경험에 대한 필요성, 훈련 기술자 및 어두운 방에서의 사용으로 - IIF 방법을 현대, 자동화 실험실의 워크 플로우에 맞게하기 어렵다.

고품질 ANA 검사 향한 첫 번째와 중요한 단계는주의 슬라이드 처리합니다. 이 절차는 노동 집약적이며, 전체 프로세스의 이해뿐만 아니라, 세부 사항 및 경험에주의가 필요합니다.

슬라이드 판독 어두운 방에서 형광 현미경에 의해 수행되고, 세포주기의 문맥에서, 다양한 패턴에 익숙한 숙련 된 기술자에 의해 수행및 계면과 나누어 세포의 형태. IIF가 제대로이 기술을 수행하는 단계를 이해, SARD의 첫 번째 라인 검사 도구입니다 제공하는 것은 매우 중요합니다.

최근, 디지털 영상 시스템은 IIF 슬라이드의 자동 판독을 위해 개발되었다. 이러한 NOVA보기 자동 형광 현미경으로 이러한 시스템은, 일상 IIF 워크 플로우를 간소화하도록 설계되었습니다. NOVA보기함으로써 해석에서 이미지 수집을 분리, 우물의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장; 이미지는 고해상도의 컴퓨터 모니터에 해석을 볼 수 있습니다. 그것은 나중에 참조 할 수 있도록 이미지를 저장하고 이미지에 형광 강도 데이터를 제공하여 운전자의 해석을 지원합니다. 또한 예비 양수 또는 음수로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 요약하면, 그것은 암실에 대한 필요성을 제거하고, 자동화하고 IIF의 준비 상태를 간소화NG / 해석 워크 플로우. 가장 중요한 것은 독자와 수치 사이의 일관성을 증가시킨다. 또한, 바코드 슬라이드의 사용과, 전송 오류는 샘플 추적하고 긍정적 인 환자 식별을 제공하여 제거된다. 이 증가 된 환자 데이터의 무결성과 안전을 초래한다.

이 동영상의 전체적인 목적은 슬라이드 처리, 일반적인 IIF 패턴의 식별, 및이 기술을 단순화하고 조화 새로운 발전의 도입을 포함 IIF 절차를 보여주는 것이다.

서문

용어 항핵 항체 (ANA)는 DNA, 단백질과 리보 ^{1, 2} 등의 세포 핵의 성분과 반응하여자가 항체의 다양성을 설명합니다. HEP-2 세포, 항원의 수백 네이티브 단백질 배열, ANA ^1의 검출을위한 이상적인 기판을 제공한다. 인간 혈청에서 ANA의 검출은 결합 조직 질환에 대한 중요한 검사 도구이며, IIF는 ANA ^{1 테스트를위한} 참조 방법이다. 최근 HEP-2 세포에 IIF는 항원 특이적인 면역 및 다중 방법에 약간의 실험실에서 대체되었습니다. 때문에 위음성 결과에 대한 우려와 임상에 대한 투명성의 부족, 류머티스의 미국 대학은 HEP-2 세포를 사용하여 IIF는 ANA ¹ 심사에 대해 "금 표준"해야한다는 결론을 내렸다 태스크 포스를 형성했다.

때문에 ANA 검사의 주관적인 성격, 간염-2 세포의 품질에결과의 정확하고 자신이보고에 tegral. 유사 분열 세포의 높은 숫자의 존재는, 최적의 세포 형태, 충분한 컨 플루, 관련 항원의 발현이 특히 중요하다. IIF 패턴 인식은 환자의 진단에 도움이되는 중요한 도구 역할을합니다. 다양한 패턴의 의미를 이해하는 것은 임상 및 실험실 직원이 진단을 확인하기위한 적절한 후속 테스트를 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 균질 ANA 패턴 항 dsDNA 또는 염색질 항체의 존재 하에서 발생할 수 있고, 전신 홍반 루푸스 (SLE) ^3과 연관 될 수있다. 다른 측면에서, 최근 일반적으로 일상적인 시료의 최대 12 %에서 볼 수있는 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은, 주로 안티 DFS70 항체와 연관되어 있는지 설명하고있다. 이러한자가 항체는 (다른 질병 특정 ANA없이) 분리에있는 경우는 전신자가 면역 류마티스 질환과 연관되지 않은 <> 4-9 한모금. 안티 DFS70 항체에 대한 이에 확증 시험, 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다.

IIF는자가 항체를 검출하는 제 선 스크리닝 방법임을 감안할 때, 그것은 사용자가 시약 및 티슈 기질의 선택이 결과에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것이 중요하다. IIF 기술은 본질적으로 주관적이기 때문에, 사용되는 시약이 최고 품질의 결과를 제공하는 것이 중요하다.

이 비디오 프로토콜이 목표는 IIF 법, ANA와 연관된 공통 패턴을 수행하기 위해 필요한 정확한 단계를 사용자에게 익숙하고, 실험실 작업 흐름을 간소화하고 결과를 표준화 할 수있는 새로운 발전을 도입하는 것이다.

프로토콜

1. 준비 및 기판 선택에게 샘플

1. 포장에서 시약을 제거하고 각 항목이 실내 온도에 올 수 있습니다. 시약을 준비하고 방향 삽입에 따라 환자의 혈청을 희석. 참고 : NOVA 라이트 슬라이드가 바코드이고 쉽게 실험실 정보 시스템 LIS 함께 자동화 시스템에 통합 될 수있다. 이 절차는 수동 슬라이드 처리를 도시한다; 높은 처리량 실험실은, 그러나, 자동 슬라이드 처리 장비를 선택할 수 있습니다.

컨트롤 및 샘플의 2. 추가

1. 양성 대조군 및 적절한 슬라이드 우물에 음성 대조군의 1 방울 1 방울을 분사합니다. 나머지 우물에 희석 한 환자의 혈청 피펫 20-25 μL. 한 번에 하나의 슬라이드를 처리합니다.
2. 바닥에 젖은 종이 타월로 얼룩 컨테이너에서 슬라이드를 놓습니다. 용기를 덮고 30 분간 슬라이드 (들)을 부화. 참고 : 습한 조건 의지마르지 기판을 방지합니다. 우물의 건조는 인공적인 염색 될 수 있습니다. 이 배양 기간 동안, 환자의 혈청에서 항 핵 항체를 각 웰에 고정 된 세포의 항원에 바인딩합니다.
3. 잠복기 후, 세척 버퍼의 부드러운 스트림을 사용하여 혈청을 씻어 낸다. 기판의 손상을 방지 우물 사이의 샘플의 크로스 오버, 각 슬라이드를 방지하기 위해 약간 우물에 직접 스트림을 연출 방지 할 수 있습니다. 초과 세척 버퍼를 누르고 약 5 분 동안 세척 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다.

형광 복합체의 3. 추가

1. 하나 하나는, 세척 완충액에서 슬라이드를 제거하고 부드럽게 과잉 세척 완충액을 제거하기 위해 탭. 각 웰에 (FITC 항 - 인간 IgG 표시) 형광 공액 1 방울을 적용합니다. 가습 용기에 30 분 동안 슬라이드를 품어하고, 염색을 교체해야합니다용기 뚜껑. 참고 : ANA의 테스트를 위해, IgG의 구단 특정 공역의 사용을 권장합니다. 공액 민감한 가볍고, 커버는 습한 환경을 유지 이외에 빛에 대한 노출로부터 슬라이드를 보호 할 것이다. 이 배양 기간 동안 복합체는 세포 항원에 바인딩 한 환자의 항 - 핵 항체에 결합 할 것이다. 이 복합체는 웰에서 형광의 존재 하에서 결과 바인딩.
2. 린스 전술 한 바와 같이 슬라이드를 씻으십시오.
3. 종이 타월에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립의 아래쪽 가장자리에 연속 라인에 설치 매체를 적용 할 수 있습니다.
4. 세척 버퍼에서 각 슬라이드를 제거하고 여분의 세척 버퍼를 제거하기 위해 부드럽게 슬라이드를 누릅니다. 커버 슬립의 가장자리에 슬라이드의 하단을 터치합니다.
5. 부드럽게 커버 슬립에 장착 매체는 기포 형성없이 슬라이드의 상단에 유입되는 방식으로 커버 슬립 상에 슬라이드를 낮추기. 참고 : 공동, 설치 매체의 최적 량을 사용하여 포함 verslipping은 완벽하게 연습이 필요하는 기술입니다.

긍정 및 부정적인 결과 4. 확인

수동 해석

1. 보기 어두운 방에있는 형광 현미경으로 슬라이드. 세포의 분포와 형광의 균일 성을 평가하기 위해 20X 또는 25X 목적으로 전체 잘 스캔을 수행
2. 양성과 패턴에 대한 최종 해석을 만들기 위해 40X 목표로 전환합니다.
3. 긍정적이고 부정적인 컨트롤 봐. 1 + 4 +에서 반응성의 등급을 매기는 척도를 사용하여 학년 양성. 참고 : 음성 대조군은 완전히 어둡게 표시되지 않을 수도 있습니다,하지만 종종 낮은 수준의 특이 형광을 표시합니다. 양성 대조군은 핵에 밝은 사과 녹색 형광 (그림 1)이 표시됩니다.

자동화 된 해석

참고 : 책상 외에도에서수동 해석, 부하 및 NOVA보기 자동 형광 현미경 또는 기타 자동화 된 디지털 영상 기기로 스캔 슬라이드에 대한; 더 암실이 필요하지 않습니다. 해당 슬라이드 유형을 선택하여 프로젝트를 생성 한 후, 기기는 물론 각 세포의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장합니다. 또한, NOVA보기 형광 강도를 측정하고, 양 또는 음으로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 이미지는 NOVA보기 결과의 최종 해석, 수정 및 확인 가능, 고해상도 컴퓨터 모니터에 운영자가 볼 수 있습니다. 보고서는 확인 결과를 생성 할 수있다. 이 결과의 해석에 도움을 것입니다 디지털 현미경 경험 실험실 기술자와 함께 사용되어야한다.

결과

HEP-2 세포의 염색 결과를 평가할 때, 다섯 가지 주요 핵 패턴은 가장 일반적으로보고 있습니다 : 균질, 얼룩덜룩 한, 센트로, nucleolar, 핵 점. 이러한 패턴은자가 항체는 핵의 특정 성분에 대한 결합의 결과이다. ANA 테스트는 핵 구조에 따라 다릅니다 만, 세포질 구조에 대한자가 항체와 관련된 세포질 패턴도 관찰 할 수있다. 일부의 경우, 몇개의 항체가 샘플에 존재할 수도 있고, 이미지가 혼합 된 패턴으로 나타날 수있다.

좀더 자주 관찰하고 IIF 방법에 의해 검출 될 수 종종 세포주기의 특정 패턴이있다; 가장 최근에, 특별한 임상 적 의의 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬가 약간 ANA 양성 혈청에 설명되어 있습니다.

균일 한 패턴

균일 한 패턴을 확인하려면, 잘 스캔 및 유사 분열 또는 분할을 식별세포. 유사 분열 세포의 응축 된 염색질 (그림 2, 주황색 화살표는) 종종 균일 한 패턴, 휴식 세포 전시 유니폼, 전체 핵의 확산 형광 (그림 nuclei.In 휴식 세포에 비해 더 뚜렷하다 고체, 균일 한 형광을 나타내는 2, 흰색 화살표). 이 특성 패턴은 종종 항 dsDNA 항체 ^(10)의 결과입니다.

얼룩덜룩 한 패턴

거친 반점 패턴, 유사 분열 세포가 응축 된 염색체 영역에는 염색 (그림 3, 주황색 화살표)를 표시하지 않습니다. 휴식 세포 핵 전체에 걸쳐 입상 형광을 나타낸다. 핵 반점 거친 또는 벌금으로 정의 할 수 있습니다. 조악한 반점 패턴은 종종 안티 SM 및 안티 RNP ^(11)의 결과이다.

미세 얼룩덜룩 한 패턴에서 휴식 세포는 일반적으로 균일 한 D에, 핵을 통해 벌금이나 확산 반점을 보여istribution (그림 4, 흰색 화살표). 미세 얼룩덜룩 한 패턴은 종종 반대로 SSAand 방지 SSB ^(12)의 결과입니다.

조밀 한 미세 얼룩 무늬

그것은 지금 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은 일상적인 테스트에서 일반적인 것으로 인식하고, 샘플의 많은 12 %에 방지 DFS70자가 항체에 대한 양성한다. 그러나, 격리에있는이자가 항체는 전신자가 면역 류마티스 질환 ^{4 -6와} 연관되지 않습니다. 이 항체는 건강한 개인과 SARD ^6과 관련이없는 질병 베어링 환자에서 유행이다. 안티 DFS70 항체에 대한 확실한 테스트는 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다.

DFS 패턴을 확인하고 ANA 양성 환자와 의사 모두에게 불안을 일으킬 수 어렵 기 때문에, 그것은 매우 identi 후 확인 시험을 수행하는 것이 좋습니다 ANA의 임상 적 의의를 명확히하기 위해 항-DFS70 항체 암시 패턴을 붙였을 것은 ^5,6 positivty.

세포 핵 (그림 5, 흰색 화살표) 핵에 걸쳐 전시 균일하게 분포 된 미세 얼룩을 쉬고이 패턴에서, 유사 분열 세포 (그림 5, 주황색 화살표), 중기 염색질의 긍정적 인 얼룩덜룩 한 얼룩을 보여줍니다.

센트로 패턴

, 센트로 패턴을 식별하는 우물을 검사하고 유사 분열 또는 분할 세포를 식별합니다. 유사 분열 세포 (그림 6, 주황색 화살표)에서 이산 얼룩 밀접 종종 "중기 바"로 설명하는 것에 관련된다. 센트로 패턴에서 휴식 세포 (그림 6, 흰색 화살표)은 핵에 걸쳐 분산 약 40 ~ 60 이산 얼룩을 보여줍니다. 센트로 패턴 안티 CENP의 결과, B는 C ¹³ 항체.

단계 "> Nucleolar 패턴

다른 nucleolear 패턴이 염색체 지역의 긍정적 인 염색을 표시하는 동안 일부 nucleolar 패턴, 유사 분열 세포의 확산 세포질 염색 (그림 7, 오렌지 화살표)과 음의 염색체 영역과 연결되어 있습니다. nucleolar 패턴은 약한 얼룩덜룩 또는 핵질의 균일 한 염색과 함께, 핵소체의 동종 또는 얼룩덜룩 염색 (그림 7, 흰색 화살표)와 연결되어 있습니다. 이러한 패턴이 반대로 RNA 중합 효소 III와 관련된, 안티 fibrillarin, anti-Th/To 및 anti-PM/Scl는 ^{(14, 15)을} 항체.

핵 도트 패턴

핵 도트 패턴은 음의 중기 유사 분열 세포 (그림 8, 주황색 화살표)로 및 휴식 세포 핵에있는 몇몇 개별 얼룩 (그림 8, 흰색 화살표)와 연결되어 있습니다. 이 특성 패턴은 종종 SP-100, PML, 또는 P80 콜린자가 항체의 결과입니다. 이 항체는 같다 원발성 담즙 성 간경변과자가 면역 간염 ⁽¹⁶⁾ sociated.

. 그림 1 음성 대조군 (왼쪽) : 세포가 아닌 특정 형광 낮은 수준,하지만 특정 핵 염색을 표시 긍정적 인 제어 (오른쪽). 세포는 애플 그린 핵 형광을 표시합니다.

그림 2. 동종 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow는) 우수 형광을 보여줍니다. 휴식 세포도, 확산 염색 (whitearrow)를 보여줍니다.

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그림 3. 거친 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 음의 얼룩을 보여줍니다. 휴식 세포는 별개의 얼룩덜룩 한 얼룩 (흰색 화살표)를 보여줍니다.

그림 4. 미세 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 음의 얼룩을 보여줍니다. 휴식 세포는 별개의 미세한 반점이 얼룩 (흰색 화살표)를 보여줍니다.

그림 5. 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 미세 과립 고체 염색을 보여줍니다. 휴식 세포 (whitearrow) 아주 좋은, 확산 얼룩덜룩 한 얼룩을 보여줍니다.

그림 6. Centromere에 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow) 쇼 유니폼, 별도의 얼룩 무늬가있다. 세포 (whitearrow)을 휴식하는 세포 핵 당 40 ~ 60 이산 얼룩을 보여줍니다.

그림 7. Nucleolar 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow는) 세부 염색의 큰 클러스터를 나타납니다. 핵소체의 휴식 세포 nucleishows 형광 (whitearrow).

그림 8. 원자력 도트 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow)는 부정적인 나타납니다. 휴식 세포가 거의 없음을 보여 discr핵 (whitearrow)의 ETE 얼룩은. 또한, nucelar 도트 패턴은 미토콘드리아 항원 (빨간색 화살표)에 대한자가 항체와 관련된 세포질 염색과 공존 할 수 있습니다.

토론

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.

To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.

In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.

Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019