Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

Resumo

Imunofluorescência indireta (IFI) ensaios têm sido tradicionalmente utilizados para a detecção de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ajudar no diagnóstico de doenças reumáticas sistémicas auto-imunes (SARD). Este protocolo demonstra como executar efetivamente a técnica IIF para detectar com precisão essas auto-anticorpos.

Resumo

O Colégio Americano de Reumatologia declaração de posição sobre o teste ANA prevê o uso de IIF como o método padrão-ouro para ANA triagem ^1. Embora IIF é um teste de rastreio excelente nas mãos de especialistas, as dificuldades técnicas de processamento e leitura IIF desliza - como o processamento intensivo trabalho de slides, leitura manual, a necessidade de experiente, tecnólogos formados eo uso de quarto escuro - tornar o método IIF difíceis de encaixar no fluxo de trabalho de, laboratórios automatizados modernos.

O primeiro e fundamental passo para a alta qualidade de triagem ANA é o processamento de slides cuidado. Este procedimento é trabalhoso e requer uma compreensão completa do processo, bem como a atenção aos detalhes e experiência.

A leitura das lâminas é realizada por meio de microscopia de fluorescência em salas escuras, e é feito por técnicos treinados, que estão familiarizados com os vários padrões, no contexto do ciclo celulare a morfologia de interfase e células em divisão. Desde que IIF é a primeira ferramenta de triagem linha para SARD, compreender as etapas para executar corretamente essa técnica é fundamental.

Recentemente, sistemas de imagem digitais têm sido desenvolvidos para a leitura automática das lâminas de IFI. Estes sistemas, como o NOVA Ver Automated microscópio fluorescente, são projetados para simplificar o fluxo de trabalho IIF rotina. NOVA Ver adquire e armazena imagens digitais de alta resolução dos poços, separando assim a aquisição de imagem a partir de interpretação; imagens são visualizadas uma interpretadas em monitores de computador de alta resolução. Ele armazena as imagens para referência futura e apóia a interpretação do operador, fornecendo dados de intensidade de luz fluorescente nas imagens. Também categoriza preliminarmente resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões para as amostras positivas. Em resumo, o que elimina a necessidade de câmara escura, e automatiza e simplifica o readi IIFng / interpretação do fluxo de trabalho. Mais importante, ele aumenta a consistência entre leitores e leituras. Além disso, com o uso de lâminas com código de barras, os erros de transcrição, são eliminados pelo fornecimento de rastreabilidade da amostra e identificação positiva do paciente. Isto resulta num aumento da integridade e da segurança dos dados do paciente.

O objetivo geral deste vídeo é demonstrar o procedimento IIF, incluindo processamento de slide, identificação de padrões comuns IIF, ea introdução de novos avanços para simplificar e harmonizar esta técnica.

Introdução

O termo anticorpos antinucleares (ANA) descreve uma variedade de auto-anticorpos que reagem com os componentes de núcleos de células, incluindo DNA, proteínas e ribonucleoproteínas ^{1, 2.} A células HEp-2, um array de proteínas nativas com centenas de antigénios, fornece um substrato ideal para a detecção de ANA ^1. A detecção de ANA no soro humano é uma importante ferramenta de triagem para doenças do tecido conjuntivo, e IIF é o método de referência para o teste ANA ^1. Recentemente, IFI em células HEp-2 tem sido substituído, em alguns laboratórios com imunoensaios específicos para o antigénio e os métodos de multiplex. Devido a preocupações com resultados falsos negativos ea falta de transparência para os médicos, o Colégio Americano de Reumatologia formado um Grupo de Trabalho que concluiu que IFI utilizando células HEp-2 deve ser o "padrão ouro" para a ANA triagem ^1.

Devido à natureza subjetiva de triagem ANA, a qualidade das células HEp-2 éTegral de relatórios precisos e confiante dos resultados. A presença de um elevado número de células mitóticas, a morfologia óptima de células, confluência suficiente, e a expressão de antigénios relevantes são particularmente importantes. Reconhecimento de padrões IIF serve como uma importante ferramenta para auxiliar no diagnóstico do paciente. Compreender o significado de vários padrões permite que os médicos e pessoal de laboratório para realizar o teste apropriado de acompanhamento para confirmar o diagnóstico. Por exemplo, homogénea padrão ANA pode ocorrer na presença de anti-dsADN ou anticorpos de cromatina, e podem estar associados com lúpus eritematoso sistémico (LES) ^3. Do outro lado, foi recentemente descrito que o assim chamado padrão pontilhado fino denso (DFS) que é frequentemente observado em até 12% de amostras de rotina, tem sido principalmente associada com anticorpos anti-DFS70. Esses auto-anticorpos, quando encontrado em isolamento (sem outra doença específica ANA) não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas ^{4-9. Assim, o teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis ​​economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente.}

Dado que IIF é a primeira metodologia de triagem linha para detectar auto-anticorpos, é fundamental que o usuário entenda como a selecção de reagentes e substratos de tecido podem afetar os resultados. Uma vez que a técnica de IFI é inerentemente subjectiva, é importante que os reagentes utilizados fornecer os resultados da mais alta qualidade.

Este objetivo deste protocolo de vídeo é familiarizar o usuário com os passos corretos necessários para executar o método IIF, os padrões comuns associados com a ANA, e introduzir novos avanços que podem agilizar o fluxo de trabalho de laboratório e padronizar resultados.

Protocolo

1. Preparação de amostras e Substrato Seleção

1. Remover reagentes de embalagem e permitir que cada item para voltar à temperatura ambiente. Preparar os reagentes e diluir o soro do paciente de acordo com a direcção de inserção. Nota: NOVA Lite slides estão com código de barras e pode ser facilmente integrado em sistemas automatizados em conjunto com o Sistema de Informação do Laboratório LIS. Este procedimento ilustra o processamento de slides manual; laboratórios de alto rendimento, no entanto, pode optar por equipamentos automatizados de processamento de slide.

2. Adição de controles e amostras

1. Dispensar uma gota de controlo positivo, e 1 gota de controlo negativo para os poços de deslizamento apropriados. Pipeta de 20-25 ul de soro de um paciente diluída aos poços restantes. Processe um slide de cada vez.
2. Colocar a lâmina (s) em um recipiente de coloração com uma toalha de papel húmido no fundo. Cobrir o recipiente e incubar a lâmina (s), durante 30 min. Nota: As condições de umidade vaievitar que o substrato de secar. A secagem dos poços pode resultar em fluorescência artificial. Durante este período de incubação, os anticorpos anti-nucleares em soro do paciente, ligam-se a antigénios das células que estão fixos em cada poço.
3. Após o período de incubação, enxaguar o soro utilizando uma corrente suave de tampão de lavagem. A fim de evitar danos no substrato e evitar cross-over de amostras entre os poços, o ângulo de deslize ligeiramente para evitar a dirigir o fluxo directamente nos poços. Toque fora tampão de lavagem em excesso e coloque o slide em uma jarra de Coplin contendo tampão de lavagem por cerca de 5 min.

3. Adição de Fluorescente Conjugado

1. Um por um, remova os slides da tampão de lavagem e bata suavemente para remover o excesso de tampão de lavagem. Aplicar uma gota de conjugado fluorescente (FITC IgG anti-humano) em cada poço. Incubar as lâminas por 30 min no recipiente umidificado, e não se esqueça de substituir a coloraçãotampa do recipiente. Nota: Para o teste ANA, é recomendado o uso de um conjugado específico IgG Fc. O conjugado é sensível à luz, e a tampa irá proteger as lâminas da exposição à luz, além de manter o ambiente humidificado. Durante este período de incubação, o conjugado irá ligar-se a anticorpos anti-nucleares do paciente que se ligaram aos antigénios celulares. Resultados da ligação deste conjugado na presença de fluorescência nas cavidades.
2. Lavar e lavar a lâmina, como descrito acima.
3. Coloque uma lamela sobre uma toalha de papel e aplicar o meio de montagem numa linha contínua para a extremidade inferior da lamela.
4. Retire cada slide da tampão de lavagem e bata suavemente a lâmina para remover o excesso de tampão de lavagem. Tocar a borda inferior da lâmina para a extremidade da lamela.
5. Cuidadosamente, baixe a lamela na lâmina, de tal forma que o meio de montagem na lamela flui para a extremidade superior da lâmina, sem a formação de bolhas de ar. Nota: Coverslipping, inclusive usando a quantidade ideal de meio de montagem, é uma técnica que requer prática para aperfeiçoar.

4. Identificação de resultados positivos e negativos

Interpretação manual

1. Ver slides com um microscópio de fluorescência, localizada em um quarto escuro. Realizar a verificação da totalidade do poço com uma objectiva 20X ou 25X para avaliar a distribuição de células e uniformidade de fluorescência
2. Mudar para uma objetiva de 40X para fazer a interpretação final sobre positividade e padrão.
3. Olhe para os controles positivos e negativos. Grau positividade usando uma escala de classificação de reatividade de 1 + a 4 +. Nota: O controle negativo não pode aparecer completamente escuro, mas muitas vezes irá exibir baixo nível de fluorescência inespecífica. O controle positivo irá exibir fluorescência verde maçã brilhante no núcleo (Figura 1).

Interpretação automatizada

Nota: Em comum, alémsobre a interpretação manual, carga e digitalizar slides pela Nova Visão Automated microscópio de fluorescência ou outro instrumento automatizado de imagem digital; nenhuma câmara escura é necessária. Depois de criar um projeto, selecionando o tipo de slide for o caso, o instrumento adquire e armazena imagens digitais de alta resolução de células em cada poço. Além disso, a NOVA Ver mede a intensidade da luz fluorescente, e classifica os resultados como positivos ou negativos, e proporciona o reconhecimento de padrões de amostras positivas. As imagens são visualizadas pelo operador em um monitor de computador de alta resolução, permitindo a interpretação final, revisão e confirmação da NOVA Ver resultado. Os relatórios podem ser gerados em resultados confirmados. Microscopia digital deve ser usado em conjunção com um técnico de laboratório experiente, pois destina-se a ajudar na interpretação dos resultados.

Resultados

Ao avaliar os resultados da coloração de células de HEp-2, cinco padrões nucleares são mais comumente relatados: homogênea, salpicadas centrômero, nucleolar e pontos nucleares. Estes padrões são o resultado da ligação de auto-anticorpos para componentes específicos do núcleo. Embora o teste de ANA é específico para estruturas nucleares, padrões citoplasmáticos associados à auto-anticorpos contra estruturas citoplasmáticas também podem ser observadas. Em alguns casos, vários auto-anticorpos podem estar presentes em uma amostra, e a imagem pode aparecer como um padrão misto.

Há outros, menos freqüentemente observada, e muitas vezes padrões específicos do ciclo celular que podem ser detectados pelo método IIF; mais recentemente, um chamado padrão pontilhado fino denso, com significância clínica especial tem sido descrita em algum soros positivos ANA.

Homogêneo Padrão

Para identificar um padrão homogêneo, a varredura do bem e identificar mitótico ou divisóriacélulas. A cromatina condensada das células mitóticas (Figura 2, laranja seta) exibe fluorescência sólida, uniforme, o que é muitas vezes mais pronunciado do que na célula de repouso nuclei.In o padrão homogéneo, a células em repouso uniforme exposição, fluorescência difusa de todo o núcleo (Fig. 2, seta branca). Este padrão característico é muitas vezes o resultado de anticorpos anti-dsDNA ^10.

Padrão pontilhado

No padrão salpicado grosseira, as células mitóticas não mostram coloração das regiões cromossómicas condensados ​​(Figura 3, laranja seta). As células em repouso exibem fluorescência granulado em todo o núcleo. O salpicar nuclear pode ser definida como grosso ou fino. O padrão salpicar Grosso é muitas vezes o resultado de anti-Sm e anti-RNP ^11.

No padrão pontilhado fino, as células em repouso mostrar salpicar multa ou difuso ao longo dos núcleos, geralmente em uniforme dISTRIBUIÇÃO (Figura 4, seta branca). O padrão pontilhado fino é muitas vezes o resultado de anti-SSAand anti-SSB ^12.

Densa Padrão Belas Speckled

Sabe-se agora que o padrão pontilhado fino denso (DFS) é comum nos testes de rotina, e tanto quanto 12% de amostras positivas para autoanticorpos são anti-DFS70. No entanto, esses auto-anticorpos, quando encontrados isoladamente, não estão associados com doenças reumáticas autoimunes sistêmicas ^{4 -6.} Estes anticorpos são prevalentes em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com doenças não relacionadas com SARD ⁶ de rolamento. O teste confirmatório para detecção de anticorpos anti-DFS70 pode ajudar a reduzir os testes de reflexo desnecessário, oferecer consideráveis ​​economias de custos e aliviar a ansiedade do paciente.

Como o padrão DFS é difícil identificar e ANA positividade pode causar ansiedade para pacientes e médicos, é altamente recomendável realizar um teste confirmatório após identificação car um padrão sugestivo de anticorpos anti-DFS70 para esclarecer o significado clínico da ANA positivty ^5,6.

Neste padrão, as células mitóticas (Figura 5, laranja de setas) apresenta coloração salpicada positivo da cromatina metáfase, enquanto descansa os núcleos das células (Figura 5, seta branca) apresentam manchas finas uniformemente distribuídas por todo o núcleo.

Centromere Padrão

Para identificar o padrão de centrômero, navegue pelos poços e identificar mitótico ou células em divisão. Em células mitóticas (Figura 6, seta laranja), essas manchas tornam-se intimamente associado discretos no que é muitas vezes descrito como um "bar metaphase". No padrão centrómero, descansando células (Figura 6, seta branca) mostram aproximadamente 40-60 manchas discretas distribuídas por todo o núcleo. O padrão de centrómero é o resultado de anti-CENP A, B, C de anticorpos ^13.

passo "> Nucleolar Padrão

Alguns padrões de nucléolos estão associados com a coloração citoplasmática difusa em células mitóticas (Figura 7, laranja seta) e região cromossómica negativo, enquanto que outros padrões nucleolear exibir coloração positiva da região cromossómica. O padrão nucleolar está associado com a coloração homogénea ou salpicado dos nucléolos (Figura 7, seta branca), juntamente com salpicado fraco ou coloração homogénea do nucleoplasma. Estes padrões estão associados a anti-RNA polimerase III, anti-fibrilarina, anti-Th/To e anti-PM/Scl anticorpos ^14,15.

Dot Nuclear Padrão

O padrão de ponto nuclear está associada com as células mitóticas metafase negativos (Figura 8, laranja de seta) e com poucas manchas discretas nos núcleos de células de repouso (Figura 8, seta branca). Este padrão característico é muitas vezes o resultado de sp-100, PML, ou auto-anticorpos p80 Colin. Estes anticorpos são tão associada com cirrose biliar primária e hepatite auto-imune ^16.

. Figura 1 controle negativo (esquerda): células apresentam baixo nível de fluorescência não específica, mas nenhuma marcação nuclear específica de controle positivo (direita):. Células apresentam fluorescência nuclear maçã verde.

Padrão Figura 2. Homogênea. Células mitóticas (orangearrow) mostram fluorescência sólida. Células em repouso mostrar mesmo, coloração difusa (whitearrow).

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Figura 3. Grosso salpicado padrão. Células mitóticas (seta laranja) mostram coloração negativa. Células em repouso mostram uma mancha salpicado distinta (seta branca).

Figura 4. Padrão pontilhado fino. Células mitóticas (seta cor de laranja) mostram coloração negativa. Células em repouso mostram uma coloração pontilhado fino distinta (seta branca).

Figura 5. Padrão pontilhado fino denso. Células mitóticas (seta cor de laranja) mostram uma coloração sólida granular bem. Células em repouso mostram uma muito fina, salpicado mancha difusa (whitearrow).

Padrão Figura 6. Centromere. Células mitóticas (orangearrow) mostram uniforme, manchas discretas. Descansando células (whitearrow) mostra 40-60 manchas discretas por núcleo celular.

Padrão Figura 7. Nucleolar. Células mitóticas (orangearrow) aparecem como grandes aglomerados de coloração granular. Descansando célula nucleishows fluorescência no nucléolo (whitearrow).

Padrão Figura 8. Ponto Nuclear. Células mitóticas (orangearrow) aparecem negativo. Células em repouso mostrar alguns DISCRmanchas ete no núcleo (whitearrow). Além disso, o padrão de pontos nucelar pode coexistir com coloração citoplasmática associada com auto-anticorpos contra antígenos mitocondriais (seta vermelha).

Discussão

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.

To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.

In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.

Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019