Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

Résumé

Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des "tags" moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines.

Résumé

La voie ubiquitine-protéasome de dégradation des protéines a émergé comme l'un des mécanismes les plus importants pour la régulation d'un large éventail de fonctions cellulaires dans pratiquement tous les organismes eucaryotes. Plus précisément, dans les plantes, le système de protéasome ubiquitin/26S (UPS) régule la dégradation des protéines et contribue de manière significative au développement d'une large gamme de procédés, y compris la réponse immune, de développement et de la mort cellulaire programmée. En outre, en plus de preuves suggère que de nombreux agents pathogènes des plantes, comme Agrobacterium, exploitent les UPS d'accueil pour une infection efficace, soulignant l'importance de l'UPS dans les interactions plante-pathogène.

La spécificité de substrat de l'onduleur est obtenue par l'ubiquitine-ligase E3 qui agit de concert avec le E1 et E2 ligases de reconnaître et de marquer les molécules de protéines spécifiques destinés à la dégradation par la fixation sur les chaînes de molécules d'ubiquitine. Une classe des ligases E3 est l'EFC (Skp1 / Cprotéine Ullin / F-box) complexe, qui reconnaît spécifiquement les substrats UPS et les objectifs pour l'ubiquitination via son composant de la protéine F-box. Pour étudier le rôle potentiel de l'UPS dans un processus biologique d'intérêt, il est important de mettre au point un test simple et fiable pour la dégradation des protéines UPS médiation. Ici, nous décrivons un tel dosage en utilisant un système sans cellule végétale. Ce test peut être adapté pour des études sur les rôles des réglementée dégradation des protéines dans divers processus cellulaires, avec un accent particulier sur les F-box interactions protéine-substrat.

Introduction

Le protéasome ubiquitin/26S est en train de devenir un mécanisme généralisé pour le contrôle de diverses réactions biologiques, y compris la régulation transcriptionnelle, la progression du cycle cellulaire et la transduction du signal, le récepteur régulation à la baisse ou l'endocytose, entre autres procédés ^1-4. Dans cette voie, la protéine cible est marquée par ubiquitine résidus qui sont d'abord fixés par l'intermédiaire d'une liaison thiolester d'enzyme ubiquitine-activation E1 et ensuite transporté vers un résidu d'acide aminé cystéine de l'ubiquitine-enzyme de conjugaison E2, enfin, E2 interagit avec l'ubiquitine ligase E3 , entraînant une polyubiquitination du substrat protéique. En fin de compte, les protéines polyubiquitinées sont reconnues et dégradées par le protéasome 26S. Dans ce mécanisme, l'enzyme E3 spécifie le substrat et agit en tant que composant clé de régulation du système de protéasome ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 peuvent agir indépendamment, comme ligases de domaine RING, ou dans le cadre d'un SCF unités multiples (S) complexe protéique kp1/Cullin/F-box, tels que F-box ligases de domaine. SCF-médiation voies de dégradation par le protéasome sont impliquées dans la régulation de la transcription, le cycle cellulaire, la transduction du signal ^5-10 et bien d'autres fonctions cellulaires majeurs.

Outre ces rôles essentiels dans la régulation des processus cellulaires, UPS prend l'étape centrale dans de nombreuses interactions plante-pathogène. Par exemple, en plus de preuves suggère que plusieurs agents pathogènes des plantes, y compris Agrobacterium tumefaciens, s'appuient sur ​​les UPS d'accueil pour faciliter le processus d'infection ^11. Agrobacterium provoque des tumeurs néoplasiques sur les plantes, qui représentent ses hôtes naturels, et il peut également transformer une large gamme d'autres eucaryotes, les champignons de ^1,2 à ^12,13 cellules humaines. Au cours de son infection, Agrobacterium exporte un élément d'ADN (ADN-T) et de plusieurs protéines de virulence (vir) dans la cellule hôte ^{de 12 à 13.} Une de ces protéines est VirF, la première protéine F-box trouvéêtre codée par un génome de procaryote ^14. Dans le cadre du complexe SCF ubiquitine ligase, VirF, et son homologue de l'hôte fonctionnel VBF ^15, faciliter l'infection par Agrobacterium via la dégradation des protéines UPS médiée, ce qui facilite probablement la décapsidation de l'ADN-T des bactéries envahissent de ses protéines bactériennes et d'accueil d'accompagnement, VirE2 et VIP1, respectivement ^16,17. Fait intéressant, de nombreuses protéines F-box, y compris VirF, sont intrinsèquement instables en raison de leur propre protéolyse, qui est médiée par l'activité de autoubiquitination ^18,19 ou par d'autres ligases E3 pour lesquels les protéines F-box peuvent servir de substrats ^{de 20 à 23.}

Lorsque l'on étudie l'activité biochimique des protéines F-box, d'autres ligases ubiquitine, et / ou leurs substrats, il serait très utile d'utiliser un test simple et fiable pour la dégradation par le protéasome. Nous décrivons ici un tel protocole pour l'analyse de la stabilité de la protéine dans une celluleSans système. Dans cet essai, la stabilité du substrat UPS est analysée en présence ou en l'absence de l'un des composants essentiels de la voie de dégradation par le protéasome, comme une protéine F-box, dans un système acellulaire. En règle générale, on exprime la protéine (s) testé dans les tissus végétaux, de préparer des extraits acellulaires à partir de ces tissus et de contrôler les quantités de la protéine (s) d'intérêt par western blot. Le mécanisme de l'onduleur dépendant de la dégradation des protéines est mise en évidence par l'inclusion d'inhibiteurs de protéasome spécifiques et / ou en utilisant la co-expression de la forme négative dominante d'un composant d'SCF, Cullin. Alors que nous illustrons ce dosage en utilisant la dégradation par le protéasome de la protéine Arabidopsis VIP1 ¹⁷ par la protéine F-box VBF ^15, elle peut être utilisée pour étudier la stabilité de tous les autres substrats du protéasome.

Protocole

Une. L'expression des protéines

1. Choix du système d'expression
   Sélectionnez le système, c'est à dire, des vecteurs et la méthode de délivrance de vecteur, le mieux adapté pour l'expression de la protéine d'intérêt dans l'organisme modèle / cellule spécifique. A noter que notre dosage nécessite l'expression des protéines testées dans des quantités facilement détectables, ce qui est mieux réalisée par transformation transitoire de grands nombres de cellules. Chez les plantes, par exemple, cela est le mieux réalisée en utilisant des plasmides binaires en tant que vecteurs d'expression et Agrobacterium comme système de délivrance.
2. Construction de vecteurs d'expression binaires,
   Cloner la séquence (s) codante de la protéine (s) d'intérêt dans un vecteur d'expression, seul ou en fusion traductionnelle d'une étiquette d'épitope. Utilisation des vecteurs appropriés pour le système d'expression choisi et les procédures standard de biologie moléculaire pour le clonage de gène. Pour la livraison de gène au moyen d'Agrobacterium, employer des vecteurs binaires et leur présenter, en utilisant également standard protocoles, dans une souche d'Agrobacterium, tels que EHA105, pour l'inoculation ultérieure de tissus végétaux.
3. Choix des espèces végétales
   Sélectionner les espèces de plantes dans lesquelles la protéine (s) d'intérêt est exprimé. Notez que, bien que toutes les espèces de plantes sensibles à la transformation génétique par Agrobacterium peuvent être utilisées, les espèces de plantes de choix est Nicotiana benthamiana, qui est facile à cultiver, très sensibles à Agrobacterium, et a de grandes feuilles qui sont facilement inoculées.
4. La croissance des plantes
   Cultiver une plante pour 4 à 6 semaines dans une casserole avec le Pro-Mix BX dans un pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) dans des conditions respectueuses de l'environnement contrôlé (par exemple, la chambre de croissance) de journée (soit 16 h de 130 -150 uE m-2 s-1 lumière à 23 ° C et 8 h d'obscurité à 20 ° C) et 40-65% d'humidité relative.
   1.5.2 Fertiliser parfois avec des produits disponibles dans le commerce par les instructions du fabricant. Une fois que la plante est cultivée, sélectionnezfeuilles avec la taille de 50 mm x 70 mm ou plus (ces mesures de longueur ne comprennent pas le pétiole) pour inoculation d'Agrobacterium.
5. Inoculation avec Agrobacterium
   Cultiver la souche d'Agrobacterium hébergeant la construction binaire exprimant la protéine (s) testé à l'étape 1.3 pendant une nuit à 28 ° C dans du milieu YEP (1% de peptone, 1% d'extrait de levure et 0,5% de NaCl) supplémenté avec des antibiotiques appropriés (par exemple, 100 mg / L de streptomycine et 10 mg / L de rifampicine pour les vecteurs à base de pPZP-RSC2 ^24-25).
   1.6.2 centrifuger les cellules, remises en suspension à DO ₆₀₀ = 0,5 dans un tampon d'infiltration [10 mM de _MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 uM acétosyringone], et incuber pendant 2 h à température ambiante. Infiltrer la culture dans la face abaxiale des feuilles, en utilisant une seringue sans aiguille 1 mL; noter que les feuilles sont inoculés in situ, tout en est fixée à la plante.
   1.6.3 Après infiltration, cultiver la plante pendant 72 h sous le régime de lumière de 16 h 130-150 et# 181; E m-2 s-1 lumière à 23 ° C / 8 heures d'obscurité à 20 ° C avant la récolte.
6. Application des inhibiteurs de protéasome
   Pour soutenir l'idée que la protéine (s) testé est dégradée par une voie du protéasome, utiliser des inhibiteurs de protéasome spécifiques MG132 et lactacystine ^28-29, ce qui devrait réduire ou même bloquer la dégradation. Quatre heures avant la récolte (voir l'étape 2.1), infiltrer les surfaces foliaires Agrobacterium inoculés avec 10 uM MG132 (Merck Millipore) ou 10 uM lactacystine (Sigma-Aldrich) ou une maquette de traiter la feuille avec les solvants respectifs, soit 0,1% de DMSO ou de l'eau distillée.

2. Préparation d'extraits acellulaires

1. Récolte des feuilles
   Récolter les zones de la feuille inoculée, habituellement ca. 200-400 mg de poids frais, et les moudre en poudre fine dans de l'azote liquide. Sinon, perles battre les tissus, en utilisant n'importe quel cordon-batteur (par exemple, Biospec) ou un amalgamateur dentaire (par exemple, PTC avancée Technologies) directement dans la mémoire tampon de dégradation (voir l'étape 2.2).
2. L'extraction des protéines
   Préparer un extrait de protéines totales en plaçant le tissu broyé dans 500 ul de tampon de dégradation [50 mM de Tris-HCL (pH 7,5), NaCl 100 mM, _MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, mM adénosine 5-5'-triphosphate, et un inhibiteur de protéase 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. A noter que le cocktail d'inhibiteurs de protease affecte principalement la sérine, la cystéine, aspartique, et de métalloprotéases et n'interfère pas avec la protéase 26S. Clarifier l'extrait par deux centrifugations successives à 12000 g pendant 5 min.
3. réaction de dégradation de la protéine
   Transférer des volumes égaux d'extraits, généralement de 20 ul, à des tubes de microcentrifugation et incuber à température ambiante pendant des périodes de temps de plus en plus. Typiquement, le temps de l'échantillon zéro, et 5, 10, 15, 20, et 30 points dans le temps min. Arrêtez réactions faisant bouillir dans un tampon de gel échantillon SDS, et de les analyser par western blot.

jove_title "> 3. Détection dégradation des protéines par immuno-

1. L'électrophorèse sur gel
   3.1.1 résoudre les échantillons de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS et électrotransfert des protéines résolues à une membrane de nitrocellulose selon le protocole standard ^{de 30.}
   3.1.2 Déterminer la concentration en protéine en utilisant la méthode de Bradford (Bio-Rad), et la charge de 50 à 80 ug de protéine totale par voie de circulation. Assurez-vous que tous les échantillons sont chargés aussi. Pour les commandes de chargement, comparer les intensités d'une espèce de protéine ubiquitaire, comme putatif Rubisco grandes chaînes qui migrent comme un groupe majeur avec une mobilité électrophorétique relative de l'ordre de 50 kDa, ils peuvent être détectés sur Coomassie gels colorées en bleu ou sur Ponceau S-ou fluorescent SYPRO Ruby teinté membranes de nitrocellulose.
2. Blocage
   Bloquer la membrane avec 5% de lait écrémé dans du TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) pendant 1 h à température ambiante.
3. L'anticorps primaire
   Diluer l'anticorps anti-épitope primaire dans 1% de lait écrémé dans du TBST à la concentration recommandée par le fabricant et incuber avec la membrane bloquée pendant 1 h à la température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce.
4. Rinçage
   Rincer la membrane est rincée dans 20 ml de TBST pendant 15 min une fois, et deux fois pendant 5 min à température ambiante avec agitation douce.
5. Anticorps secondaire
   Diluer l'anticorps secondaire (par exemple, anti-IgG de lapin) conjugué à de la peroxydase de raifort (HRP) dans 1% de lait écrémé dans du TBST tel que recommandé par le fabricant et incuber avec la membrane pendant 1 h à température ambiante avec agitation douce.
6. Détection
   Rincer à nouveau la membrane, comme décrit à l'étape 3.4. Après le dernier rinçage dans du TBST, de visualiser les protéines d'intérêt avec un substrat chimioluminescent HRP, le plus souvent en utilisant un kit ECL.

Résultats

Figure 1, adapté de Zaltsman et al. ^17, illustre expériences représentatives pour la détection de la dégradation par le protéasome dans un système acellulaire. Plus précisément, nous démontrons la déstabilisation d'une usine liées à la défense protéine VIP1 par VBF protéine F-box par la voie SCF ^VBF en N. benthamiana. Arabidopsis VBF et protéines HA-marqués VIP1 (HA-VIP1) ont été transitoirement co-exprimées, et HA-VIP1 la teneur ...

Discussion

Ce test repose sur l'expression des protéines testées dans les tissus végétaux, ainsi, le processus potentiel de dégradation par le protéasome se produit évidemment déjà à l'intérieur des tissus vivants. Nous dosage protéine déstabilisation, cependant, que dans les extraits, avec le temps zéro échantillon servant de point de référence initial. Par conséquent, nous définissons comme un essai acellulaire.

Un aspect important pour la réussite de cet essai est le choi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein assay kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean system	Bio-Rad	165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system	Bio-Rad	170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane	Pall Corporation	27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055